食品中香蘭素檢測方法研究進(jìn)展

陳林林，鄭鳳鳴，范天嬌，張佳欣，楊茜瑤

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028)

香蘭素(vanillin, VAN)又名3-甲氧基-4-羥基苯甲醛或香草醛，分子式為 C8H8O3，外觀呈白色或淡黃色結(jié)晶，通常包括甲基香蘭素和乙基香蘭素，最早是從蘭科植物香莢蘭中發(fā)現(xiàn)的，從而帶有香莢蘭香氣和濃重的奶香。19世紀(jì)后，科技的進(jìn)步帶動了香莢蘭中香蘭素的提取技術(shù)發(fā)展，并將其應(yīng)用于食品領(lǐng)域，如乳制品、糖果、橄欖油、餅干、巧克力、蛋糕等的增香劑和固香劑，是全世界產(chǎn)量最大的合成香料品種之一[1-2]。

然而，有研究表明攝入大量的合成香蘭素會引起頭痛、惡心、嘔吐，甚至還會對肝和腎的功能造成影響，對人體健康造成威脅[3]。糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合專家委員會限制的香蘭素每日最大攝入量為10 mg/kg，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》同樣規(guī)定了香蘭素在食品中的使用限量。在中國，0～6個月的嬰兒配方奶粉中被禁止添加香蘭素，其原因是香蘭素?fù)碛袧庵氐哪滔銡馕?，會?dǎo)致嬰幼兒對這種奶粉產(chǎn)生過度依賴，以此來增加此奶粉的銷量。此外，嬰兒肝臟和腎臟的解毒能力在這一階段較差，食用香蘭素對嬰兒的肝臟和腎臟造成的傷害更是不可治愈的[4-5]。然而作為一種使用率極高的食用調(diào)味品，香蘭素在嬰幼兒配方奶粉中被廣泛添加，其含量超標(biāo)問題也一直被人們忽略。如2021年5月6日上海市場監(jiān)管局在某公司生產(chǎn)的嬰幼兒奶粉中檢測出一定含量的香蘭素，并對其沒收物品并處罰金，這也是近3年國內(nèi)對奶粉品牌開出的最大罰單。抽樣人員對當(dāng)事人進(jìn)口總經(jīng)銷的某嬰兒配方奶粉0～6月齡1段進(jìn)行了監(jiān)督抽檢。經(jīng)寧波海關(guān)技術(shù)中心檢驗，其出具的檢驗報告顯示：上述批次產(chǎn)品的香蘭素項目實測值為171.6 μg/kg，檢測結(jié)果不符合GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》要求，結(jié)論為該產(chǎn)品不合格。

基于對食品安全的考慮，以及食品添加劑行業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展，香蘭素的檢測顯然是至關(guān)重要的。因此，需要一種經(jīng)濟(jì)、選擇性好和靈敏度高的檢測香蘭素濃度的方法。目前，香蘭素的檢測主要涉及奶粉、米粉、乳制品、植物油、豆?jié){和天然椰汁等食品，檢測方法包括色譜法[6-11]、光譜法[12]和電化學(xué)法[13]等。本文對近5年來所報道的香蘭素的檢測方法以及這些方法的優(yōu)缺點進(jìn)行了綜述，旨在為各種食品中香蘭素的檢測提供有效參考，同時也為食品添加劑的合理使用提供技術(shù)支持。香蘭素結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 香蘭素結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of vanillin

1 色譜法在香蘭素檢測中的應(yīng)用

1.1 氣相色譜法

氣相色譜法(gas chromatography, GC)是一種在有機(jī)化學(xué)中對易于揮發(fā)而不發(fā)生分解的化合物進(jìn)行分離與分析的色譜技術(shù)。此方法操作簡單、儀器分析時間短、速度快、干擾小、靈敏度高、樣品進(jìn)樣量少[14-15]，適用于香蘭素的定性定量分析，是檢測香蘭素的國標(biāo)方法。孟慶順等[16]利用氣相色譜法和建立內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線法對米粉中的香蘭素和乙基香蘭素同時進(jìn)行測定，該方法一次進(jìn)樣分析時間僅為20 min，檢測時間短。通過對樣品的加標(biāo)回收和樣品中目標(biāo)物質(zhì)的反復(fù)多次驗證，證明該方法回收率較高、重現(xiàn)性較好，是一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的定量檢測米粉中香蘭素的理想方法。由于不同來源的香蘭素樣品具有不同的δ13 C值，所以Katryna等[17]使用δ13 C值來對香蘭素進(jìn)行定性，建立了二氯甲烷萃取后餾分中香蘭素的分析方法。結(jié)果證明該方法具有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的可靠性、可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

然而當(dāng)檢測的樣品為熱不穩(wěn)定性樣品時，容易造成被測物在空氣中的氧化，具有一定的局限性。對于復(fù)雜樣品的檢測也面臨著前處理時間長、耗時長等問題，因此在臨場分析檢測某些樣品時受限。

1.2 液相色譜法

液相色譜法是一種流動相為液體的色譜法，通常可分為高效液相色譜法法(high performance liquid chromatography, HPLC)和超高效液相色譜法(ultra high performance liquid chromatography,UPLC)。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、精密度高，適用于各種液體樣品中香蘭素的檢測[18-19]。édgar等[20]采用高效液相色譜法對可可粉中的香蘭素和乙基香蘭素進(jìn)行定量分析。在優(yōu)化了提取和分離條件后，兩種分析物的測定時間均不到4 min，最優(yōu)條件下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值均低于2.05%，檢出限在0.04～0.06 mg/L之間。陳靜等[21]在紫外檢測波長267 nm處，結(jié)合高效液相色譜法和外標(biāo)法對液態(tài)乳、乳粉、發(fā)酵乳、乳酸菌飲料、雪糕和干酪樣品中的香蘭素進(jìn)行定量分析。3種香蘭素類化合物在0.05～5.00 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，定量限均為0.2 mg/kg，檢出限均為0.06 mg/kg。本方法定量分析速度快、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，是乳制品中3種香蘭素類化合物同時定量檢測的理想方法。

傳統(tǒng)的高效液相色譜法仍然存在檢測靈敏度和效率上的局限性。超高效液相色譜法是一種具有穩(wěn)定性、易用性、可變靈敏度和選擇性等特點，并且在許多方面優(yōu)于高效液相色譜法的技術(shù)，它顯示出更好的色譜分離度，分析更靈敏，分析時間更短，能夠減少溶劑消耗，其有望替代傳統(tǒng)的高效液相色譜法成為新一代食品安全檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[22-23]。Muhammad[24]建立了一種簡便的聯(lián)用超高效液相色譜-離子色譜法對食品中香蘭素和乙基香蘭素同時測定的方法，溶劑為體積比為3∶2的乙醇和水，提取方法為快速超聲輔助提取。采用IonPac AG19色譜柱作為在線預(yù)富集陰離子的濃縮柱。該方法具有成本低、操作簡便、穩(wěn)定性高、在線預(yù)處理、靈敏度高、分析時間短(17 min)、所需進(jìn)樣量低(20 μL)等優(yōu)點，可以成功用于食品中香蘭素和乙基香蘭素的快速檢測。Liu等[25]為了檢測蜂蜜中的摻假行為，建立了一種簡便、靈敏、準(zhǔn)確的高效液相色譜-電化學(xué)檢測(HPLC-ECD)法同時測定9種蜂蜜中的香蘭素類物質(zhì)。香蘭素的檢出限為1.3×10-2μg/mL，回收率在80.6%～100.2%之間。高效液相色譜-電子捕獲檢測器可同時測定蜂蜜中的香味增強(qiáng)劑香蘭素，對蜂蜜摻假的鑒別具有重要意義。但是由于實驗過程中超高效液相色譜儀所承受的內(nèi)部壓力過大，因此會降低泵的相對使用壽命，加快儀器的連接部位老化速度，一些零件也容易出現(xiàn)故障等，從而增加檢測成本。

1.3 色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)是利用氣相色譜具有的高效分離等優(yōu)勢與質(zhì)譜的高選擇性、靈敏度和分子結(jié)構(gòu)鑒定等優(yōu)勢相結(jié)合的方法，具有操作簡便、干擾少、定性定量準(zhǔn)確的特點，已被應(yīng)用于食品中有害物質(zhì)的分析[26-27]。Wang等[28]采用氣質(zhì)聯(lián)用法測定奶茶中的香蘭素和乙基香蘭素，在預(yù)處理方面采用頂空固相微萃取技術(shù)萃取香蘭素，內(nèi)標(biāo)物為3,4-亞甲二氧苯乙酮，對二者進(jìn)行定量分析。該方法具有檢測靈敏、檢測條件綠色、無污染等優(yōu)點，是一種環(huán)境友好的香蘭素檢測方式。Peng等[29]用同樣的方法定量各種食品中的香蘭素和乙基香蘭素。在確定的最佳條件下，奶茶和嬰幼兒配方奶粉的檢出限為0.005～0.50 μg/g，混合芝麻油的檢出限為0.01～0.05 μg/g。在混合芝麻油中還檢測到麥芽酚、乙基麥芽酚和香蘭素的含量范圍在0.286～1.65 μg/g之間。該方法具有良好的可靠性和同時檢測能力，可用于多種食品中4種風(fēng)味化合物摻假的檢測和健康風(fēng)險評價，然而氣相色譜-質(zhì)譜法的分析時間較長，且儀器價格較貴。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)是由具有高效分離能力的液相色譜和具有高準(zhǔn)確分析能力的質(zhì)譜結(jié)合，是一種用于化合物定性和定量的重要分析技術(shù)。擁有操作簡單、高效靈敏、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，因此被用于實現(xiàn)解析化合物分子結(jié)構(gòu)或樣品的定性定量分析[30]。林正鋒等[31]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳制品中的香蘭素。該方法對樣品中香蘭素的提取采用水-醚體系，經(jīng)堿液反萃除去雜質(zhì)后采用高靈敏度、高選擇性的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析4種化合物，整個過程省去了氮吹濃縮的步驟。與其他方法相比，該法具有快速高效，前處理成本低，4種化合物在各種乳制品中呈弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，無需采用基質(zhì)曲線或者內(nèi)標(biāo)校正補(bǔ)償其基質(zhì)效應(yīng)等優(yōu)點。Qu等[32]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了植物油中的3種香蘭素類化合物含量。該方法使用電噴霧三重四極桿進(jìn)行正離子模式下多反應(yīng)離子監(jiān)測，檢出限為23～30 μg/kg，定量限為76～100 μg/kg。采用該方法檢測了多批次市售植物油，香蘭素的檢出濃度為160～830 μg/kg。但色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同樣具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜，維護(hù)成本高，高精密儀器在實驗室使用時要經(jīng)過專門培訓(xùn)的技術(shù)職員才能操作，對環(huán)境的溫度、濕度等要求高，測試速度慢，功能復(fù)雜，影響分析工作的效率等不足。

2 光譜法在香蘭素檢測中的應(yīng)用

香蘭素檢測的光譜方法主要包括紅外光譜法(FT-IR)、熒光探針法、紫外分光光度法(UV-Vis)等。紅外光譜技術(shù)是一種快速、無損、綠色、環(huán)保的分析技術(shù)，常與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合，在調(diào)味品成分的定量檢測與品質(zhì)評價中有所應(yīng)用[33-34]。Montserrat等[35]采用傅里葉變換中紅外光譜(MID-FTIR)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，對純香草提取物中摻入的乙基香蘭素進(jìn)行鑒別和定量，并通過MID-FTIR光譜進(jìn)行表征以建立化學(xué)計量學(xué)模型，采用主成分回歸、單變量偏最小二乘和多變量算法建立了香蘭素含量的預(yù)測模型。結(jié)果表明，該技術(shù)可以成功地檢測到純香草中摻假的香蘭素。Zhao等[36]開發(fā)了一種通用模型，用于檢測不同品牌嬰兒配方奶粉中的香蘭素。利用偏最小二乘法判別分析(PLSDA)建立分類模型，識別富含香蘭素的像素，該方法的檢測限為0.5%。視覺預(yù)測圖清楚地顯示了香蘭素富集像素的位置，有利于紅外光譜技術(shù)在奶粉市場和生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量檢測中的應(yīng)用和推廣。

近年來，許多具有優(yōu)異熒光性能的金屬有機(jī)骨架(MOF)已經(jīng)被制備成高靈敏度和高選擇性的熒光探針，用于快速檢測食品中的香蘭素等。Wang等[37]利用鉬酸銨輔助形狀控制合成Co(II)基納米MOFs熒光探針用于奶粉中香蘭素的檢測。在297 nm的紫外光激發(fā)下，制得的Co-MOF納米片在440 nm處發(fā)出紫光，且對香蘭素高度敏感，并且在水溶液中可以被香蘭素選擇性猝滅，由此可以進(jìn)行香蘭素的定性檢測。此外，Zhu等[38]使用石墨烯量子點(GQD)作為熒光探針選擇性檢測巧克力中的香蘭素。在最佳條件下，GQD的熒光強(qiáng)度與香蘭素濃度具有良好的線性關(guān)系(0～2.1×105mol/L)，其檢測限為2.5×10-8mol/L。對實際樣品的檢測，香蘭素的回收率為88.0%～108.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～5.4%。該方法的準(zhǔn)確性和精密度良好，可用于各種食品中的香蘭素檢測。

國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 5566中采用紫外可見分光光度法對香蘭素的含量進(jìn)行測定，該方法具有操作簡便、靈敏度高、干擾少、準(zhǔn)確度好、分析成本低、結(jié)果可靠等優(yōu)點，被人們普遍接受[39]。然而該方法靈敏度較低，因此Altunay[40]建立了一種渦旋輔助離子液體分散微萃取(VAILDME)-紫外-可見分光光度法測定食品中香蘭素的新方法。該方法采用乙醇作為分散溶劑、EtSO4作為萃取劑、Cu(II)作為絡(luò)合劑，在pH 8.0的條件下進(jìn)行測定。該方法在0.5～300 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.15 μg/L。通過多次加標(biāo)實驗驗證了該方法的準(zhǔn)確性，加標(biāo)樣品的加標(biāo)回收率在92.1%～103.0%之間。經(jīng)驗證，采用此方法對食品中香蘭素進(jìn)行測定的結(jié)果令人滿意。類似地，Zhao等[41]同樣建立了一種靈敏、簡便、快速的香蘭素比色檢測方法。在高溫酸性條件下，香蘭素的醛基可與鄰甲苯胺的氨基發(fā)生反應(yīng)。所得產(chǎn)物在363 nm處有最大吸收，最后用紫外分光光度計進(jìn)行定量。整個樣品制備和檢測過程不超過20 min，是一種簡便、快速、靈敏的香蘭素比色檢測方法。但光譜法仍然存在檢測結(jié)果受環(huán)境影響較大；光譜干擾受到譜線重疊的影響比較大，所以時而有較差的選擇性；樣品濃度較大時準(zhǔn)確度較低，易受其他物質(zhì)干擾等局限性。

3 電化學(xué)方法在香蘭素檢測中的應(yīng)用

電化學(xué)方法因具有靈敏度高、操作簡單、成本低等優(yōu)點而被廣泛使用，日益成為食品安全質(zhì)量檢測的主要手段[42]。Yiit等[43]使用同樣電極測定了飲料中的香蘭素，用循環(huán)伏安法和方波吸附溶出伏安法研究了這些化合物的電化學(xué)行為。在優(yōu)化條件下的線性電流響應(yīng)良好，檢出限為5.0×10-7mol/L。Filik等[44]則利用聚(茜素紅)修飾玻碳電極測定香蘭素，在0.5～250 μmol/L范圍內(nèi)，香蘭素的檢出限為0.06 μmol/L。聚(茜素紅)功能化凝膠電泳重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性高。該方法用于能量飲料和香草糖樣品中香蘭素的測定效果良好。

近年來，許多關(guān)于絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)技術(shù)的報道被用于開發(fā)各種電化學(xué)傳感器，用于檢測生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境和農(nóng)業(yè)食品等各個領(lǐng)域的目標(biāo)分子[45]。Chen等[46]采用市售的一次性多壁碳納米管絲網(wǎng)印刷電極(CNT-SPE)測定各種香草樣品中的香蘭素。為香草莢中香蘭素快速、靈敏、低成本的定量和常規(guī)分析提供了簡便的提取方法和電化學(xué)檢測方法。Murtada等[47]在此基礎(chǔ)上研制了一種鋁摻雜納米二氧化鈦修飾絲網(wǎng)印刷碳電極(Al-TiO2-NPs/SPCE)用于香蘭素的檢測。此電極測定的香蘭素檢出限為0.02 μmol/L，檢測時間僅為5 min，比市售香蘭素測定電極具有更高的靈敏度和更快的檢測速度，可用作香蘭素的快速篩選試驗應(yīng)用于常規(guī)分析工作中。

碳糊電極(CPE)以其均勻性、低本底電流、制備過程簡單、成本效益高、催化性能好、修飾適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點在傳感器的制備方面取得了很大的進(jìn)展，尤其是對生物分子的檢測具有良好的生物相容性[48]。Erady等[49]利用表面活性劑修飾碳糊傳感器高效選擇性測定食品的香蘭素。該方法所用電極為十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)澆鑄的CPE，并采用伏安法對電極進(jìn)行了表征。該電極可較好地消除食品中的阿魏酸、葉酸、色氨酸等干擾物質(zhì)，對香蘭素的選擇性良好。Shaaban等[50]建立了一種在磷酸鹽緩沖液中利用十二烷基硫酸鈉修飾碳糊電極(SDS/CPE)方波伏安法直接測定食品中乙基香蘭素和甲基香蘭素的新方法。該方法不使用成本高、危害健康的納米材料。與裸碳糊電極相比，SDS/CPE具有良好的重現(xiàn)性，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為0.3%。采用高效液相色譜法驗證該電極檢測結(jié)果的有效性，結(jié)果表明，直接伏安法測定乙基香蘭素和甲基香蘭素經(jīng)濟(jì)、可靠，其檢測結(jié)果與反相高效液相色譜法基本一致。

雖然電化學(xué)檢測方法在檢測香蘭素的應(yīng)用中逐漸受到國內(nèi)外研究者的青睞，但該方法仍然具有檢測過程中存在被測樣品或流動相中的雜質(zhì)，以及實驗過程中溶解的氧氣等干擾物質(zhì)，除此之外，溫度的浮動等也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的影響；電極使用壽命短；電極間重復(fù)性差；受流動性流速的變化影響較大等局限性。

綜上所述，食品中香蘭素檢測方法的應(yīng)用對比見表1。

表1 食品中香蘭素的檢測方法Table 1 The determination methods of vanillin in food

4 展望

本文總結(jié)了近年來食品中香蘭素的檢測方法，發(fā)現(xiàn)不同的檢測方法各有優(yōu)勢和局限性?？筛鶕?jù)待測樣品的特點根據(jù)不同的現(xiàn)場情況選擇合適的檢測方法，以保證得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。氣相色譜法對于易揮發(fā)有機(jī)物中的香蘭素檢測更加適用，但樣品的預(yù)處理具有操作復(fù)雜、處理時間過長等局限性，不適用于臨場的快速檢測；傳統(tǒng)液相色譜法檢測速度快、方便操作，但儀器較大，價格較為昂貴，分析時間較長，同樣不適合現(xiàn)場的檢測；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法由于具有較低的檢出限，應(yīng)用更為廣泛，對樣品基質(zhì)的干擾性較小，用于食品香蘭素定量測定準(zhǔn)確度高，對多種樣品同時大批量的檢測同樣適用；光譜法操作簡單，有些樣品無需復(fù)雜的前處理，可直接進(jìn)行檢測，分析速度較快，適合于現(xiàn)場的快速無痕檢測，但準(zhǔn)確度相對較低；電化學(xué)方法作為一種新興的方法，具有響應(yīng)迅速、靈敏度高、分辨率好等優(yōu)勢，但容易受樣品基質(zhì)干擾，檢測大批量產(chǎn)品時較為困難。隨著更多的檢測方法被應(yīng)用到香蘭素的檢測中，檢測人員需要根據(jù)實際檢測目的和環(huán)境，選擇一種最優(yōu)的方法來獲得香蘭素的準(zhǔn)確含量，也期盼著研究人員根據(jù)現(xiàn)有的檢測方法持續(xù)改善，持續(xù)創(chuàng)新，以研究出更為快速、準(zhǔn)確、綠色健康的檢測方法。