HACCP體系對(duì)富順香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌的控制應(yīng)用

袁先鈴，袁玉梅，雷鳴

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.四川天味家園食品有限公司，成都 610000；3.四川省遠(yuǎn)達(dá)集團(tuán)富順縣美樂(lè)食品有限公司，四川 自貢 643000)

HACCP技術(shù)英文全稱(chēng)為Hazard Analysis and Critical Control Point，中文名為危害分析和關(guān)鍵控制點(diǎn)。HACCP是一種食品安全管理技術(shù)，是一個(gè)世界范圍內(nèi)指導(dǎo)食源性危害安全控制的方針，是國(guó)際上公認(rèn)的食品安全體系[1]，HACCP體系是科學(xué)、高效、簡(jiǎn)單、合理、高度專(zhuān)業(yè)的食品安全管理體系，是控制食品安全風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)防體系[2]。其目的是識(shí)別食品生產(chǎn)加工過(guò)程中可能發(fā)生的安全危害，并建立相應(yīng)的控制程序[3-5]，從而降低食品危害發(fā)生的概率。目前關(guān)于辣椒醬的研究主要集中于發(fā)酵辣椒醬的生產(chǎn)工藝、貨架期及安全分析[6-9]，而對(duì)于非發(fā)酵辣椒醬的研究主要集中于生產(chǎn)工藝方面[10-12]，未見(jiàn)食源性致病細(xì)菌及HACCP方面的研究。

因此，在香辣醬生產(chǎn)加工企業(yè)建立和應(yīng)用HACCP體系，是保證產(chǎn)品質(zhì)量安全的必然選擇。結(jié)合HACCP原理對(duì)香辣醬生產(chǎn)過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)的影響，進(jìn)行危害分析，確定關(guān)鍵控制點(diǎn)并建立HACCP體系，為產(chǎn)品質(zhì)量安全提供有效保障。

1 香辣醬生產(chǎn)工藝

原料預(yù)處理→原輔料加工→醬體調(diào)配→殺菌→罐裝→包裝。

2 香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌鑒定

2.1 試驗(yàn)方法

2.1.1 采樣時(shí)間

以每班次生產(chǎn)為周期，在生產(chǎn)前、生產(chǎn)過(guò)程中每隔2 h/次，生產(chǎn)結(jié)束時(shí)分別采樣，檢測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中菌落總數(shù)和腸桿菌變化趨勢(shì)。

2.1.2 采樣方法

采樣方法見(jiàn)表1。

表1 采樣方法表Table 1 Sampling methods

2.1.2.1 空氣取樣

將營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)平板和結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(VRBGA)平板放到采樣點(diǎn)，打開(kāi)皿蓋，暴露5 min。

2.1.2.2 涂抹取樣

用經(jīng)殺菌后蘸有無(wú)菌生理鹽水的棉球擦拭取樣框內(nèi)表面(框內(nèi)面積為50 cm2)，擦完后將棉球放入盛有10 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，此試管中溶液每1 mL代表5 cm2，密封帶回微生物室備用[13]。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 環(huán)境監(jiān)控試驗(yàn)方法

2.2.1.1 菌落總數(shù)

將采集細(xì)菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿置于35～37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)[14]。

2.2.1.2 腸桿菌科

將采集細(xì)菌后的結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂平皿置于35～37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)[15]。

2.2.2 生理生化鑒定

2.2.2.1 革蘭氏染色鏡檢

腸桿菌科為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢。

2.2.2.2 氧化酶試驗(yàn)

用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒(不要用鎳鉻接種環(huán))挑取單個(gè)菌落涂于浸濕氧化酶試劑的濾紙上，濾紙的顏色在10 s內(nèi)變成藍(lán)紫色，判為陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2.2.3 葡萄糖試驗(yàn)

用接種針挑取少許氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性的同一個(gè)菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基內(nèi),于(36±1) ℃培養(yǎng)(24±2) h后，若試管內(nèi)的內(nèi)容物變?yōu)辄S色，判為陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2.3 菌種鑒定

將檢測(cè)出的腸桿菌科菌種分離純化后進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 檢測(cè)結(jié)果

2.3.1.1 各生產(chǎn)車(chē)間腸桿菌科菌及菌落總數(shù)情況

生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)原料庫(kù)房、粉碎車(chē)間、調(diào)配車(chē)間、罐裝車(chē)間菌落總數(shù)和腸桿菌科菌菌落數(shù)量變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，各車(chē)間環(huán)境中生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌數(shù)量變化以及菌落總數(shù)變化見(jiàn)表2和表3。

表2 生產(chǎn)過(guò)程環(huán)境中菌落總數(shù)變化情況Table 2 Changes in the total number of colonies in environment during production

表3 生產(chǎn)過(guò)程環(huán)境中腸桿菌科菌數(shù)量變化情況Table 3 Changes in the number of Enterobacteriaceae in the environment during production

由表2和表3可知，各車(chē)間整體清潔度由低到高分別為：原料庫(kù)房<粉碎車(chē)間<調(diào)配車(chē)間<罐裝車(chē)間。各個(gè)車(chē)間加工過(guò)程中清潔度由生產(chǎn)前較高到生產(chǎn)過(guò)程中低再隨著生產(chǎn)結(jié)束逐漸增高。而腸桿菌科菌疑似菌數(shù)量均遠(yuǎn)小于菌落總數(shù)，原料庫(kù)房空氣中最多，數(shù)量隨著生產(chǎn)開(kāi)始逐漸增加，隨著生產(chǎn)結(jié)束而減少。

潔凈程度呈動(dòng)態(tài)變化，由粉碎車(chē)間潔凈等級(jí)變化可以說(shuō)明粉碎車(chē)間開(kāi)始生產(chǎn)后可能由于人員活動(dòng)和機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)導(dǎo)致原輔料和地面上微生物浮游在空氣中，導(dǎo)致空氣潔凈度降低，生產(chǎn)完成后空氣中的微生物逐漸減少，空氣潔凈度提高；調(diào)配車(chē)間由于機(jī)械化程度高，管道較多，無(wú)鼓風(fēng)設(shè)備，操作人員較少，故空氣中微生物較少，潔凈度一直處于較高狀態(tài)；罐裝車(chē)間由于為生產(chǎn)最后環(huán)節(jié)，人員進(jìn)入車(chē)間前需要經(jīng)過(guò)清潔間、風(fēng)淋室等以達(dá)到盡量減少人員帶入菌的可能性，且罐裝車(chē)間為一個(gè)比較封閉獨(dú)立的空間，故罐裝車(chē)間空氣中腸桿菌科菌和菌總量均較少，潔凈度一直處于較高狀態(tài)。

2.3.1.2 設(shè)備腸桿菌科菌情況

由表4可知，罐裝車(chē)間設(shè)備表面及設(shè)備與食品接觸面均未檢出腸桿菌科菌，這可能是因?yàn)槿藛T進(jìn)入罐裝車(chē)間需經(jīng)過(guò)清潔間、風(fēng)淋室，罐裝車(chē)間空間相對(duì)封閉獨(dú)立且人員管理良好，故罐裝車(chē)間空氣潔凈等級(jí)比較高，微生物含量少。

表4 罐裝車(chē)間設(shè)備腸桿菌科菌測(cè)定結(jié)果Table 4 Detection results of Enterobacteriaceae in equipment of canned workshop

2.3.1.3 操作人員腸桿菌科菌情況

由表5可知，罐裝車(chē)間操作人員在清潔前，只有2號(hào)操作人員帶有腸桿菌科菌，但清潔后，檢測(cè)結(jié)果為0，說(shuō)明清潔方法能有效殺菌。罐裝人員在完成清潔后人員手部均未攜帶腸桿菌科菌，生產(chǎn)過(guò)程中檢測(cè)結(jié)果顯示人員均未攜帶腸桿菌科菌，說(shuō)明生產(chǎn)過(guò)程中清潔頻率合適，工作5 h后有1人攜帶了腸桿菌科菌，其余2人均未攜帶腸桿菌科菌，這可能與個(gè)人習(xí)慣有關(guān)。

表5 罐裝車(chē)間操作人員腸桿菌科菌測(cè)定結(jié)果Table 5 Detection results of Enterobacteriaceae of production personnel in canned workshop

2.3.2 腸桿菌科菌鑒定結(jié)果

2.3.2.1 生理生化鑒定結(jié)果

腸桿菌科菌疑似菌鑒定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 腸桿菌科菌疑似菌鑒定結(jié)果Table 6 Identification results of suspected Enterobacteriaceae bacteria

2.3.2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

部分腸桿菌科菌疑似菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 部分腸桿菌科菌疑似菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification with 16S rRNA sequence of some suspected Enterobacteriaceae bacteria

將條帶清晰的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)，確定各菌株的分類(lèi)地位，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 腸桿菌科菌疑似菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果Table 7 16S rDNA sequencing results of suspected Enterobacteriaceae bacteria

由表7可知，對(duì)香辣醬各生產(chǎn)車(chē)間、生產(chǎn)人員主要原輔料辣椒、花椒檢測(cè)出的菌種進(jìn)行分離純化經(jīng)16S rDNA測(cè)序結(jié)果可知，分離出14株菌株，其中致病菌13株。具體為腸桿菌科致病細(xì)菌斯氏普羅威登斯菌(Providenciastuartii)、奧斯陸莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)、香坊腸桿菌(Enterobacterxiangfangensis)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)；2株不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)、2株鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、阿爾塔米拉金色單胞菌(Aureimonasaltamirensis)、棲麥假單胞菌(Pseudomonasoryzihabitans)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)均為致病細(xì)菌；紅綬曲霉(Aspergillusnomius)為致病菌；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)為非致病菌。

3 香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中HACCP體系建立

3.1 香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌的危害分析

根據(jù)各生產(chǎn)車(chē)間及生產(chǎn)環(huán)節(jié)的腸桿菌科菌數(shù)量變化，在腸桿菌科菌溯源分析和表8香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌危害分析表基礎(chǔ)上，結(jié)合關(guān)鍵控制點(diǎn)(CCP)判斷樹(shù)(見(jiàn)圖2)，對(duì)辣醬生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行危害分析(見(jiàn)表8)。

圖2 香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌的CCP判斷樹(shù)Fig.2 CCP judgement tree of Enterobacteriaceae in the production process of spicy sauce

表8 香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中腸桿菌科菌危害分析Table 8 Hazard analysis of Enterobacteriaceae in the production process of spicy sauce

續(xù) 表

3.1.1 原輔料驗(yàn)收

原輔料初始微生物含量會(huì)很大程度上影響原輔料在儲(chǔ)存過(guò)程中微生物的基數(shù)，直接影響原輔料質(zhì)量，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量。控制原輔料驗(yàn)收時(shí)微生物含量，有利于原輔料后期儲(chǔ)存和產(chǎn)品質(zhì)量的提高，故將原輔料驗(yàn)收確定為關(guān)鍵控制點(diǎn)之一。

3.1.2 原料儲(chǔ)存

儲(chǔ)存環(huán)境對(duì)原輔料在儲(chǔ)存過(guò)程中腸桿菌科菌的生長(zhǎng)增殖有很大影響，從原料儲(chǔ)存環(huán)境的溫度、濕度及原輔料本身水分含量等方面優(yōu)化儲(chǔ)存環(huán)境可以有效控制原輔料在儲(chǔ)存過(guò)程中腸桿菌科菌的生長(zhǎng)繁殖，提高原輔料質(zhì)量，故將原料儲(chǔ)存確定為關(guān)鍵控制點(diǎn)之一。

3.1.3 醬體調(diào)配

香辣醬在生產(chǎn)調(diào)配過(guò)程中，為提高產(chǎn)品口感和質(zhì)量會(huì)適量添加食品添加劑，食品添加劑的使用不規(guī)范會(huì)直接影響食品安全，食品添加劑使用應(yīng)嚴(yán)格按照GB 2760-2014[16]標(biāo)準(zhǔn)。故將香辣醬調(diào)配確定為關(guān)鍵控制點(diǎn)之一。

3.1.4 香辣醬罐裝

香辣醬罐裝是暴露在空氣中進(jìn)行的，因此產(chǎn)品質(zhì)量與產(chǎn)品在罐裝過(guò)程中生產(chǎn)環(huán)境質(zhì)量密切相關(guān)。生產(chǎn)環(huán)境中的微生物含量直接影響生產(chǎn)過(guò)程中半成品中微生物含量，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量?？刂品鬯檐?chē)間生產(chǎn)環(huán)境中微生物含量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量尤為重要。故將香辣醬粉碎確定為關(guān)鍵控制點(diǎn)之一。

3.1.5 操作人員

香辣醬生產(chǎn)為半自動(dòng)化生產(chǎn)，從生產(chǎn)開(kāi)始到生產(chǎn)完成過(guò)程中某些環(huán)節(jié)需要操作人員完成，需要接觸到半成品、成品，操作人員攜帶的微生物含量也會(huì)影響產(chǎn)品質(zhì)量。給操作人員定時(shí)進(jìn)行殺菌清潔，有利于產(chǎn)品質(zhì)量。故將操作人員作為關(guān)鍵控制點(diǎn)之一。

3.2 香辣醬生產(chǎn)腸桿菌科菌的HACCP計(jì)劃表建立

在表8的危害分析及關(guān)鍵控制點(diǎn)和糾偏措施的基礎(chǔ)上建立HACCP計(jì)劃表，必須高度重視糾偏措施和驗(yàn)證程序的設(shè)置，及時(shí)完整各檔案記錄，驗(yàn)證程序是為了考察HACCP體系中CCP點(diǎn)是否保持在受控狀態(tài)[17]，出現(xiàn)偏差時(shí)及時(shí)采取恰當(dāng)糾偏措施，嚴(yán)格按照HACCP計(jì)劃表操作，最終達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量安全和降低食品危害的目的。香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中的HACCP計(jì)劃表見(jiàn)表9。

表9 富順香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中針對(duì)腸桿菌科菌的HACCP計(jì)劃表Table 9 HACCP schedule for Enterobacteriaceae in production of Fushun spicy sauce

4 小結(jié)

HACCP體系是國(guó)際上共同認(rèn)可和接受的食品安全保證體系，可通過(guò)控制食品生產(chǎn)過(guò)程中關(guān)鍵點(diǎn)有效保護(hù)食品免受可能發(fā)生的危害[18-19]，是適用于各類(lèi)食品企業(yè)的簡(jiǎn)便、易行、合理、有效的控制體系[20]。HACCP體系能通過(guò)控制食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)，達(dá)到提高最終產(chǎn)品質(zhì)量的目的，是能控制潛在危害的有效的預(yù)防性方法，是食品生產(chǎn)更為安全、成本更低的質(zhì)量控制方法。對(duì)富順香辣醬生產(chǎn)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)的腸桿菌科菌污染情況調(diào)查分析，對(duì)腸桿菌科菌危害來(lái)源以及危害程度，依據(jù)CCP 判斷樹(shù)，確定其生產(chǎn)關(guān)鍵控制點(diǎn)分別為：原輔料驗(yàn)收、原料儲(chǔ)存、香辣醬粉碎、香辣醬調(diào)配和操作人員，并對(duì)關(guān)鍵控制點(diǎn)設(shè)定控制措施，建立HACCP體系，為富順香辣醬的食品安全奠定基礎(chǔ)。