自然發(fā)酵過程中紅樹莓的微生物多樣性及活性成分研究

武林芝，郝秀萍

(太原學(xué)院 材料與化學(xué)工程系，太原 030032)

樹莓果富含多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，這些物質(zhì)具有強大的保健功效[1]。我國每年的紅樹莓產(chǎn)量已經(jīng)超過了2萬噸[2]。目前，紅樹莓被加工的產(chǎn)品主要為一些果酒和飲料，種類單一，并且加工的工藝簡單[3]。隨著我國紅樹莓產(chǎn)量的不斷增加，傳統(tǒng)加工工藝也需要升級。

紅樹莓的果實是漿果型，有特殊的香味，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括糖類和多種礦物質(zhì)元素[4-5]。相關(guān)的研究結(jié)果表明，在100 g的紅樹莓中含有240 mg的維生素和0.168 g鉀，維生素中含量較高的是維生素C和維生素E[6]。紅樹莓中也富含酮類物質(zhì)和酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗氧化作用[7]。

當(dāng)紅樹莓成熟之后，很容易腐爛，不易儲存，所以大部分的紅樹莓被粗加工，制成一些紅樹莓果汁和果脯[8]。我國紅樹莓的加工還處于起步階段，加工程度較低，隨著樹莓產(chǎn)量的不斷增加，樹莓的加工有待進一步升級和多樣化[9]。

本試驗通過對不同區(qū)域的紅樹莓發(fā)酵過程中的活性物質(zhì)和微生物量變化進行研究，探究紅樹莓發(fā)酵過程中活性物質(zhì)變化與微生物量變化的相關(guān)性，從而了解紅樹莓的自然發(fā)酵機理，并采用傳統(tǒng)的菌株分離方式，分離并培養(yǎng)出發(fā)酵性能良好的菌株，以豐富我國的紅樹莓發(fā)酵微生物資源庫。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與設(shè)備

1.1.1 試驗原料和試劑

兩種紅樹莓樣品A和樣品B分別從不同的市場上購得；化學(xué)試劑包括樣品琥珀酸、PDA土豆培養(yǎng)基、蘋果酸、真菌DNA提取試劑盒。

1.1.2 試驗設(shè)備與儀器

奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、離心機、滅菌鍋、天平、振蕩儀、紫外分光光度計、水浴鍋和PCR儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅樹莓發(fā)酵液的制備

樣品A和樣品B紅樹莓分別放入體積為30 L的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，每間隔10 d取一次樣品，取樣的時間分別為0，10，20，30，40，50 d，取出的樣品放置在4 ℃的條件下保存待用[10]。

1.2.2 紅樹莓發(fā)酵液理化指標(biāo)的測定

1.2.2.1 紅樹莓中有機酸含量的測定

紅樹莓中有機酸的測定根據(jù)高效液相色譜法[11]，色譜柱為4.5 mm×250 mm×5 μm；洗脫時間為10 min，柱溫為38 ℃，有機酸的檢測波長為210 nm。

1.2.2.2 紅樹莓發(fā)酵液中總酚含量的測定

紅樹莓發(fā)酵液中總酚的測定根據(jù)參考文獻[12]，采用福林酚法對紅樹莓發(fā)酵液中總酚進行測定，把沒食子酸的質(zhì)量濃度定為橫坐標(biāo)，吸光度定為縱坐標(biāo)，并根據(jù)回歸方程式Y(jié)=0.0125X+0.0076(R2=0.9998)進行計算。吸取1 mL的樣品，在樣品中添加2 mL的福林酚試劑，搖勻，避光1 h，在波長760 nm處測定吸光值，并計算總酚含量。

1.2.2.3 紅樹莓發(fā)酵液對DPPH自由基清除率的測定

稱取0.005 g DPPH，將其溶解在100 mL的無水乙醇中，并制成DPPH自由基溶液。吸取1 mL稀釋后的紅樹莓發(fā)酵液，與3 mL DPPH自由基溶液在遮光條件下反應(yīng)25 min，測定波長在517 nm處的吸光值X1。取1 mL稀釋后的紅樹莓發(fā)酵液和3 mL無水乙醇自由基溶液，反應(yīng)25 min，并在波長517 nm處測定吸光值X2。取1 mL無水乙醇和3 mL DPPH自由基溶液混合，搖勻，反應(yīng)25 min，在波長517 nm條件下測定吸光值X3，X3為空白對照。計算公式如下：

DPPH自由基清除率=[1-(X1-X2)/X3]×100%[13]。

1.2.2.4 紅樹莓發(fā)酵液中DNA的提取和檢測

紅樹莓中真菌的基因組采用基因組的試劑盒進行提取，提取之后，DNA在電泳的條件下進行檢測[14-15]。

1.2.2.5 紅樹莓發(fā)酵液中真菌的分離和純化

真菌的分離和純化：取少許發(fā)酵完成的紅樹莓發(fā)酵液，在無菌的環(huán)境條件下稀釋，把稀釋后的菌液涂于PDA平板上，將接種后的培養(yǎng)基放置在25 ℃恒溫條件下，培養(yǎng)36 h，并挑取單個菌落進行分離純化培養(yǎng)，在4 ℃的條件下保存?zhèn)溆肹16]。

利用分子生物學(xué)鑒定：將分離純化的菌株使用真菌提取試劑盒進行DNA提取，使用ITS5/ITS4引物對真菌的保守區(qū)域進行擴增[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅樹莓發(fā)酵過程中有機酸含量的變化

利用高效液相色譜法，對紅樹莓發(fā)酵后的各種酸進行分析和測定，測定的樣品由樣品A和樣品B混勻，混勻之后的紅樹莓發(fā)酵液中有機酸含量變化見圖1。

圖1 紅樹莓發(fā)酵過程中有機酸含量的變化Fig.1 Changes of organic acid content in the fermentation process of Rubus idaeus L.

由圖1可知，在紅樹莓發(fā)酵后，發(fā)酵液中有機酸變化明顯，而隨著發(fā)酵時間的增長，乳酸、檸檬酸和蘋果酸的變化最為明顯；琥鉑酸和酒石酸的變化量較少。紅樹莓發(fā)酵50 d之后，發(fā)酵液中含量最多的乳酸由原來的1.52 mg/mL增加至14.0 mg/mL，其含量增大了8.2倍；檸檬酸在紅樹莓發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先增高后降低然后再增高的趨勢，當(dāng)發(fā)酵至50 d結(jié)束時，紅樹莓中的檸檬酸含量為6 mg/mL，相比之前的0.8 mg/mL也增加了6.5倍。

紅樹莓發(fā)酵過程中有機酸含量的變化與紅樹莓發(fā)酵液中微生物的糖代謝有著密切的關(guān)系，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵液中的氧氣含量逐漸被消耗，使得檸檬酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸的氧化反應(yīng)受到阻礙，造成檸檬酸在紅樹莓自然發(fā)酵的過程中逐漸積累，發(fā)酵液中的琥珀酸含量逐漸降低。在缺氧的條件下，發(fā)酵液中的丙酮酸被還原為乙醇或者乳酸，那么樣品中的乳酸也會隨著發(fā)酵時間的增長而逐漸升高。此外，在紅樹莓發(fā)酵液中可能存在一些將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸的細(xì)菌，從而將蘋果酸降解，乳酸含量增高[18]。

2.2 紅樹莓發(fā)酵過程中總酚含量的變化

本試驗通過Folin-Ciocalteau法對紅樹莓中總酚的含量進行測定，兩種樣品在不同時間段內(nèi)的總酚含量變化見圖2。

圖2 兩個樣本發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total phenol content during the fermentation process of two samples

由圖2可知，無論是樣品A還是樣品B，發(fā)酵后樣品中的總酚含量明顯增加。當(dāng)發(fā)酵時間至30 d時，兩個樣品中的總酚含量均最高，其中樣品A中的總酚含量為1.2 mg/mL，樣品B中的總酚含量為1.14 mg/mL。當(dāng)發(fā)酵時間超過30 d時，紅樹莓自然發(fā)酵液中的總酚逐漸呈現(xiàn)下降的趨勢，但是下降的趨勢并不明顯。當(dāng)發(fā)酵時間為50 d時，樣品A中總酚含量為0.9 mg/mL，而樣品B中總酚含量為0.7 mg/mL，分別是未經(jīng)過發(fā)酵時的2倍和8倍。樣品A和樣品B在發(fā)酵過程中，樣品A中的總酚一直高于樣品B中的總酚，這是由于不同的生活環(huán)境導(dǎo)致紅樹莓中酚類物質(zhì)的差異。

酚類物質(zhì)是人們公認(rèn)的抗氧化物質(zhì)[19]，經(jīng)過發(fā)酵的紅樹莓發(fā)酵液中的酚類物質(zhì)隨著發(fā)酵時間的增長先增加后降低，在發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中的酚類物質(zhì)逐漸降低，這可能是由于發(fā)酵液中的酚類物質(zhì)被分解，導(dǎo)致酚類成分降低。

2.3 紅樹莓發(fā)酵過程中自由基清除能力的變化

DPPH自由基為脂溶性自由基，以氮為中心，與羥基自由基和超氧自由基相比，其穩(wěn)定性更高，是測定物質(zhì)抗氧化活性最基本的方法之一。由圖3可知，紅樹莓在發(fā)酵過程中，發(fā)酵液對DPPH自由基的清除率明顯增強，隨著發(fā)酵時間的延長，DPPH自由基的清除率更高。在紅樹莓發(fā)酵的過程中，樣品A對DPPH自由基的清除率明顯高于樣品B對DPPH自由基的清除率。當(dāng)發(fā)酵時間為50 d時，樣品A對DPPH自由基的清除率為45%，樣品B對DPPH自由基的清除率為33%，分別是未發(fā)酵時的1.8倍和1.32倍。

圖3 兩個樣本發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.3 Changes of DPPH free radical scavenging rates during the fermentation process of two samples

2.4 紅樹莓發(fā)酵液中真菌群落α多樣性分析

對于樣品中的微生物多樣性分析，常常使用α多樣性分析[20]，一般用于對物種豐富度和多樣性分析。Ace、Sobs和Chao常常被用于估計微生物群落中的豐富度，香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和辛普森指數(shù)(Simpson)被用于計算微生物多樣性，Shannon和Simpson表示微生物的多樣性高低，Coverage表示對樣本的覆蓋率。

由表1可知，樣品A和樣品B中的真菌群落多樣性和豐富度均存在一定的差異，樣品A中的Ace、Chao、Sobs和Shannon數(shù)值均小于樣品B中的數(shù)值，Simpson大于樣品B中的數(shù)值，表明樣品A中的真菌豐富度和多樣性一直高于樣品B中的豐富度和多樣性。兩個樣品中的覆蓋率均大于0.99，表明試驗結(jié)果與真實值較接近。樣品A中的真菌多樣性明顯多于樣品B中的真菌多樣性，這是由于樣品A的采集地溫度和濕度相對較高，適宜微生物的生長和繁殖，使得樣品A中的外源微生物明顯多于樣品B中的外源微生物，所以導(dǎo)致樣品A在自然發(fā)酵過程中微生物的含量明顯高于樣品B。

表1 紅樹莓自然發(fā)酵液中的真菌多樣性分析Table 1 Analysis of fungal diversity in natural fermentation broth of Rubus idaeus L.

2.5 紅樹莓發(fā)酵完成后發(fā)酵液中真菌群落的分析組成

從紅樹莓發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中一共鑒定到50個不同屬，其中樣品A中含有45個不同的屬，樣品B中含有30個不同的屬，樣品A中的真菌多樣性明顯多于樣品B中的真菌多樣性。

由圖4可知，兩種樣品中的真菌優(yōu)勢屬為Saccharomyces、Hanseniaspora、Kazachstania和Pichia。Hanseniaspora(漢森氏酵母)和Kazachstania、Pichia在兩個樣品中所占的比例相似。樣品A中的Saccharomyces少于樣品B。說明不同產(chǎn)地的紅樹莓樣品A和樣品B在發(fā)酵過程中微生物的物種量存在一定的差異。

圖4 兩個樣本發(fā)酵完成后真菌群落多樣性的分析Fig.4 Analysis of fungal community diversity after the fermentation of two samples

2.6 紅樹莓發(fā)酵后分離獲得的菌株鑒定結(jié)果

將紅樹莓中的真菌進行分離純化，分離之后獲得菌株，按照試劑盒的要求，提取菌株的DNA，獲得DNA之后進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物在電泳的條件下進行質(zhì)量檢測，把質(zhì)量好的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。完成測序后分析并確定分離菌株大致的屬范圍，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)。

下載完成后的數(shù)據(jù)使用BioEdit進行對齊，將對齊好的數(shù)據(jù)上傳至Cipres (https://www.phylo.org/portal2/login!input.action)平臺上，進行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立，分離獲得的菌株親緣關(guān)系見圖5。

圖5 基于ITS分析獲得紅樹莓發(fā)酵液中微生物多樣性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of microbial diversity in Rubus idaeus L. fermentation broth obtained based on ITS analysis注：每個分支上的數(shù)值表示支持率：最大簡約樹和貝葉斯樹的支持率，最大簡約樹的支持率70%被展示，貝葉斯樹的支持率大于90%被展示。

由圖5可知，分離獲得的真菌種類最多的為Pichia(畢赤酵母屬)，一共有7個菌株，其次為Kazachstania(哈薩克斯坦酵母屬)，一共有1個菌株。

3 小結(jié)

紅樹莓經(jīng)過發(fā)酵后，能產(chǎn)生有利于身體健康的微生物代謝產(chǎn)物、酶和多糖等多種物質(zhì)。但是紅樹莓發(fā)酵液的質(zhì)量不穩(wěn)定，發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量受原材料質(zhì)量、產(chǎn)地和發(fā)酵工藝等多種因素的影響。本研究以紅樹莓作為原料，研究紅樹莓自然發(fā)酵過程中發(fā)酵液活性成分和微生物的多樣性的改變。