高通量測(cè)序技術(shù)在探索芽菜微生物群落結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用

王新惠，劉力嘉，丁悅，孫勁松，潘攀，張雅琳，龐紫琳，劉洋,

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610106；2.宜賓學(xué)院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000)

芽菜是在我國(guó)四川南部較為盛行的一道傳統(tǒng)醬腌菜，由新鮮的芥菜莖部通過(guò)清洗、劃絲、晾曬、腌制、發(fā)酵等工藝制作而成[1]。芽菜發(fā)酵是芽菜制作過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)，因?yàn)檠坎说娘L(fēng)味主要來(lái)源于發(fā)酵環(huán)境中微生物代謝活動(dòng)[2-3]。

芽菜自然發(fā)酵過(guò)程中會(huì)有微生物群落結(jié)構(gòu)變化，這也是影響芽菜風(fēng)味和食用安全性的關(guān)鍵點(diǎn)。但是，目前對(duì)于芽菜中的微生物菌群結(jié)構(gòu)和多樣性分析并未完全了解。在過(guò)去的研究中，主要有依賴微生物的培養(yǎng)特點(diǎn)和形態(tài)學(xué)的傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法來(lái)探索發(fā)酵食品中菌群。馬長(zhǎng)路等[4]通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)分離的方法從東北酸菜中分離出植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；尹曦等[5]用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法發(fā)現(xiàn)宜賓芽菜中主要有戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌。但依靠形態(tài)學(xué)來(lái)鑒定微生物常常不夠全面，因?yàn)槟芡ㄟ^(guò)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的菌群很少，所以傳統(tǒng)的方式不能全面地認(rèn)識(shí)發(fā)酵環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)。隨后基于PCR的檢測(cè)手段出現(xiàn)，主要有PCR-DGGE技術(shù)、EIRC-PCR技術(shù)和RFLP技術(shù)等。張先琴[6]通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)分析了芽菜中的微生物群落結(jié)構(gòu)，但無(wú)法有一個(gè)準(zhǔn)確的定量；荊雪嬌[7]通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)發(fā)現(xiàn)短乳桿菌為泡菜和酸菜的優(yōu)勢(shì)菌群，彎曲乳桿菌在泡菜和浙江榨菜中為優(yōu)勢(shì)菌群，消化乳桿菌和食用糖乳桿菌分別為酸菜和醬菜的優(yōu)勢(shì)菌群，但基于PCR的技術(shù)手段往往因?yàn)橐z電泳，圖譜復(fù)雜且存在工作量大、靈敏度有限等缺點(diǎn)。近幾年，高通量測(cè)序技術(shù)的誕生為了解微生物菌群結(jié)構(gòu)提供了新的解決方案，因其具有無(wú)需克隆、測(cè)序量大、速度快等特點(diǎn)[8-10]而廣泛應(yīng)用于檢測(cè)植物病毒、畜禽、食源性病原體[11]等。楊柳等[12]利用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在辣白菜中Weissella菌屬與菌落計(jì)數(shù)相距最近，同時(shí)也與總酸含量的呈味物質(zhì)呈正相關(guān)，其貢獻(xiàn)率最好，其他菌屬呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Weissella菌屬對(duì)主要呈味物質(zhì)有重要作用。賈晶晶等[13]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)12%食鹽濃度發(fā)酵的腌漬白菜液分析得出共有6個(gè)菌門。最優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門，其相對(duì)含量高達(dá)67.01%，丙型變形菌綱相對(duì)含量為99.17%，為其主要優(yōu)勢(shì)菌綱，其中普羅威登斯菌屬為最優(yōu)勢(shì)菌屬。由此可以看出高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物群落多樣分析是較準(zhǔn)確且完備的。

本研究重點(diǎn)在于利用高通量測(cè)序技術(shù)從門、種水平上研究市場(chǎng)上不同品牌的宜賓芽菜之間微生物群落結(jié)構(gòu)差異性及是否存在有害菌，在檢測(cè)市場(chǎng)產(chǎn)品的安全性的同時(shí)也為廠家在發(fā)酵過(guò)程中規(guī)避一些不必要的有害微生物繁殖起到提醒作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

宜賓芽菜：購(gòu)于宜賓敘州區(qū)當(dāng)?shù)刭Q(mào)易市場(chǎng)，購(gòu)買3種不同廠家的袋裝芽菜，分別編號(hào)C1、C2、C3。所有樣品均為無(wú)菌采樣，使用無(wú)菌塑封袋包裝后置于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

圖1 3種芽菜樣品Fig.1 Three kinds of sprout samples

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；通用型恒壓恒流電泳儀；Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700 PCR儀；QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒 Qiagen公司；Qubit 2.0微量熒光核酸定量?jī)x ThermoFisher公司；X1R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；HiSeq測(cè)序儀、HiSeq Rapid SBS Kit v2 (FC-402-4023 500 Cycle)測(cè)序試劑盒 美國(guó)Illumina公司；其他所需試劑均購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 DNA提取和PCR測(cè)序、擴(kuò)增

使用特定的DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。引物引用：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物進(jìn)行PCR。每一個(gè)25 μL的體系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD-Plus-Neo酶(Toyobo公司)和10 ng模板。PCR程序包括起始94 ℃ 1 min，然后30次循環(huán)(變性94 ℃ 20 s，退火54 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 30 s)，最后72 ℃ 5 min。 每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)PCR技術(shù)重復(fù)。PCR與1/6體積的6 loading buffer混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取目的條帶用來(lái)回收，回收使用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen公司)。使用Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Scientific公司)定量。最后等摩爾量混合。建庫(kù)使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)定量和文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用HiSeq 2500平臺(tái)PE250模式測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先使用FLASH[14]拼接雙端序列，截去Barcode序列得到原始數(shù)據(jù)，然后使用Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)控。在Usearch軟件[15]基礎(chǔ)上，使用UPARSE算法在97%水平上進(jìn)行OTU聚類，再用R語(yǔ)言進(jìn)行各種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，最后用ggplot2包作圖。對(duì)于Alpha多樣性分析，PD指數(shù)的計(jì)算使用Picante包，其他指數(shù)使用Vegan包。對(duì)于Beta多樣性分析，使用GUniFrac包計(jì)算UniFrac距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽菜中細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)主要有細(xì)菌菌群豐度指數(shù)Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。3種不同品牌的宜賓芽菜中細(xì)菌菌群多樣性結(jié)果見表1。

表1 3種宜賓芽菜中細(xì)菌群落豐度和多樣性Table 1 The abundance and diversity of bacterial community in the three kinds of sprout samples

由表1可知，C3樣本中細(xì)菌菌群豐度最高，而C2樣本中細(xì)菌菌群的豐度最低。從芽菜中細(xì)菌菌群多樣性指數(shù)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1樣本中的細(xì)菌菌群多樣性最高，C2樣本中的細(xì)菌菌群多樣性最低。3種芽菜在細(xì)菌菌群多樣性和豐度上具有一定的差異，這可能是由于原料的選擇、制作工藝以及滅菌條件的不同造成的。

2.2 細(xì)菌群落韋恩圖分析

將細(xì)菌序列在97%相似水平上定義為一個(gè)OTU，對(duì)3種宜賓芽菜中細(xì)菌的OTU進(jìn)行分析得到OTU韋恩圖，見圖2。

圖2 3種包裝宜賓芽菜的OTU韋恩圖分析Fig.2 OTU Venn diagram analysis of three kinds of packaged Yibin sprouts

由圖2可知，3個(gè)樣品共測(cè)得1948個(gè)OTUs。C1中測(cè)得1351個(gè)OTUs，C2中測(cè)得1315個(gè)OTUs，C3中測(cè)得1444個(gè)OTUs，3種宜賓芽菜中共有727個(gè)OTUs，結(jié)果表明，3種芽菜細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間存在一定差異，但相比3種芽菜共有菌落，每種芽菜獨(dú)有菌落占比更小。

2.3 微生物相對(duì)豐度曲線

根據(jù)OTU豐度，使用Rank-Abundance曲線對(duì)樣本多樣性進(jìn)行評(píng)估，得到相對(duì)豐度曲線，見圖3。

圖3 3組樣品的相對(duì)豐度曲線Fig.3 The relative abundance curves of three groups of samples

曲線的平滑程度反映了樣本中物種的均勻度，可以看出隨著測(cè)序加深，序列增加，各個(gè)樣品的曲線斜率逐漸減小，呈現(xiàn)一個(gè)趨于平緩的態(tài)勢(shì)，說(shuō)明物種分布較均勻。而曲線在水平橫軸上的范圍越大，說(shuō)明物種豐度越高，由圖3可知C3樣品的物種豐度最高，C1次之，C2最低。

2.4 細(xì)菌群落在門水平上的結(jié)構(gòu)差異分析

在門的水平上對(duì)3種宜賓芽菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 門水平上不同芽菜樣品的細(xì)菌豐度Fig.4 The bacterial abundance of different sprout samples at phylum level

由圖4可知，3種芽菜中優(yōu)勢(shì)菌門均是厚壁菌門(Firmicutes)，C1樣本中厚壁菌門占比為43.77%，在C2樣本中占比為50.73%，在C3樣本中占比為45.59%。厚壁菌門會(huì)參與膳食植物多糖代謝[16]；其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)，擬桿菌門在C1、C2和C3樣本中占比分別是22.53%、21.98%和23.77%。Ley等[17]發(fā)現(xiàn)厚壁菌門與擬桿菌門的比例降低對(duì)減輕體重有直接的影響，在肥胖受試者中通常厚壁菌門含量較高，擬桿菌門含量較低,因此在樣本中若擬桿菌門比例較高，可能起到抑制人體脂肪沉積的積極作用。在樣本中還檢測(cè)出變形菌門(Proteobacteria)，少數(shù)的奇古菌門(Thaumarchaeota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、 廣古菌門(Euryarchaeota)、放線菌門(Actinobacteria)、醋桿菌門(Acidobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)等。其中，變形菌門屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，它們具有分泌脂多糖的能力，而脂多糖可以作為內(nèi)毒素，容易引起腸道炎癥[18]。對(duì)此，我們?nèi)粘ｏ嬍晨梢宰⒁舛嗍秤酶呃w維或碳水化合物改善腸道菌群來(lái)降低炎癥發(fā)生的概率。

2.5 細(xì)菌群落在種水平上的結(jié)構(gòu)差異分析

在種的水平上對(duì)3種宜賓芽菜中細(xì)菌結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5。

圖5 種水平上不同芽菜樣品的細(xì)菌豐度熱圖Fig.5 The heat map of bacterial abundance of different sprout samples at genus level

由圖5可知，在3組樣品中豐度前三的優(yōu)勢(shì)菌種一致，分別為鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)，共屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)，乳酸桿菌具有嗜酸的特點(diǎn)，因此廣泛分布于傳統(tǒng)醬腌菜中。優(yōu)勢(shì)菌種鼠乳桿菌在3組樣品中占比分別為10.51%、9.87%、11.92%。鼠乳桿菌在腸道中起著調(diào)節(jié)腸道菌群，增強(qiáng)腸道屏障的功能[19-20]，Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，鼠乳桿菌可以作為一種功能性的益生菌來(lái)對(duì)抗食物過(guò)敏。禽乳桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，具有產(chǎn)生細(xì)菌素和有機(jī)酸的能力，可以抑制病原體和炎癥反應(yīng)[22]，它在3種芽菜樣品中占比分別為4.70%、9.82%、5.05%，其中禽乳桿菌在C2中占比最大，而在C1中占比最小。格氏乳桿菌在3組樣品中占比分別為2.56%、2.94%、2.42%，Kyoung等[23]研究發(fā)現(xiàn)格氏乳桿菌會(huì)影響體內(nèi)代謝因子，與Cudraniatricuspidata協(xié)同作用調(diào)節(jié)代謝功能，發(fā)現(xiàn)了一種新的作為肥胖與消瘦的生物標(biāo)志物。此外，還發(fā)現(xiàn)了彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)，有研究表明彎曲乳桿菌具有較高的穩(wěn)定性，對(duì)單核增生細(xì)菌有顯著的抑制作用，從而起到改善發(fā)酵香腸安全的作用[24-25]。同時(shí)，3個(gè)樣品中均含有羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，它常用于嬰幼兒保健食品益生菌使用，可以促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增加人體免疫力[26]。特別注意的是有腐敗致病菌被檢測(cè)出，其中一個(gè)是腦膜炎嗜冷桿菌(Psychrobactermeningitidis)，它可以產(chǎn)生褐藻酸降解菌快速吸收水分從而導(dǎo)致紫菜出現(xiàn)病斑進(jìn)而腐敗[27]，因此在芽菜中可能存在加速腐敗的效果；此外還檢測(cè)出熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，有研究表明熒光假單胞菌常附著于醬腌菜表面，存在還原硝酸鹽生成亞硝酸鹽的情況，因此可能對(duì)食品安全有不良影響[28]。另外，我們還檢測(cè)到了產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)，Marques F Z等[29]發(fā)現(xiàn)Bacteroidesacidifaciens等腸道菌群數(shù)量會(huì)增加高血壓小鼠發(fā)生心力衰竭概率， Kang Chil-sung等[30]發(fā)現(xiàn)Akkermansiamuciniphila、Bacteroidesacidifaciens的減少與DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)。

總體上，在種水平上的有益功能菌主要有鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，腐敗致病菌主要有腦膜炎嗜冷桿菌(Psychrobactermeningitidis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)。在傳統(tǒng)工藝下生產(chǎn)的芽菜，發(fā)酵菌群主要來(lái)源于原輔料和生產(chǎn)環(huán)境中，如何減少腐敗致病菌和擴(kuò)大優(yōu)勢(shì)菌種是提高芽菜食用安全性和風(fēng)味的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.6 Beta多樣性分析

對(duì)3種芽菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖6。

圖6 不同芽菜樣品的PCA分析Fig.6 PCA analysis of different sprout samples

橫坐標(biāo)PC1為第一主成分，它對(duì)3種樣品差異的貢獻(xiàn)值為56.5%，縱坐標(biāo)PC2為第二主成分，它對(duì)3種樣品差異的貢獻(xiàn)值為43.5%。3個(gè)不同芽菜樣本之間的距離較遠(yuǎn)，結(jié)果表明3個(gè)芽菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相差較大。

3 結(jié)論

本文采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3種不同宜賓芽菜中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3種宜賓芽菜中，C3樣本中細(xì)菌菌群豐度最高，而在C1樣本中，細(xì)菌菌群多樣性最高。此外，共檢測(cè)到3種宜賓芽菜中共有727個(gè)OTUs，3種芽菜具有一定相似性。在門的水平上，對(duì)3種宜賓芽菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門是優(yōu)勢(shì)菌門，在C1、C2和C3中占比分別為43.77%、50.73%和45.59%。在種的水平上對(duì)3種宜賓芽菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鼠乳桿菌是3種宜賓芽菜中的優(yōu)勢(shì)菌種，它在C1、C2、C3中占比分別為10.51%、9.87%、11.92%。其次分別是禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)。禽乳桿菌在C1、C2、C3中占比分別為4.70%、9.82%、5.05%，格氏乳桿菌在C1、C2、C3中占比分別為2.56%、2.94%、2.42%。

通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，能快速、準(zhǔn)確地分析芽菜發(fā)酵環(huán)境中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)市面售賣的宜賓芽菜中主要功能菌是鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)、禽乳桿菌(Lactobacillusaviariu)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、羅伊乳桿菌(Lactobacillusreuteri)，但也存在部分腐敗致病菌，如腦膜炎嗜冷桿菌(Psychrobactermeningitidis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、產(chǎn)酸擬桿菌(Bacteroidesacidifaciens)。本研究為芽菜的生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中的微生物控制提供了參考，同時(shí)也為后期對(duì)芽菜的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。