響應(yīng)面法優(yōu)化ε-聚賴(lài)氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基

馬鑫，張子桐，孟鑫巖，王野男，尤麗新*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130600)

微生物源天然防腐劑有著來(lái)源廣泛、價(jià)格偏低等優(yōu)勢(shì)[1],天然防腐劑除了微生物源，還有植物源[2-3]，常見(jiàn)的有如下幾種：乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε-聚賴(lài)氨酸[4]。其中ε-聚賴(lài)氨酸的最適pH值相較于其他兩種防腐劑更為寬泛，且ε-聚賴(lài)氨酸的抑菌譜均比其他兩種抑菌譜廣[5]。ε-聚賴(lài)氨酸是由多個(gè)氨基酸殘基(25～30個(gè))構(gòu)成的同型單體聚合物，化學(xué)法合成的為α型，具有一定的毒性，生物法合成的為ε型，有研究證明后者的抑菌活性比前者更強(qiáng)[6]。

ε-聚賴(lài)氨酸是40多年前日本學(xué)者Shima S和Sakai H[7]從放線(xiàn)菌發(fā)酵液中提取出來(lái)的，目前有許多學(xué)者對(duì)白色鏈霉菌進(jìn)行誘變，其產(chǎn)量有所提高[8]。另有一些研究者不僅誘變選育了菌株，而且優(yōu)化其發(fā)酵過(guò)程，產(chǎn)量均有所提高，但仍然有一定的進(jìn)步空間[9]。

20世紀(jì)80年代，美、日、韓等國(guó)已經(jīng)允許ε-聚賴(lài)氨酸在食品中用作防腐劑。2014年，其作為食品防腐劑也正式進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)[10]。ε-聚賴(lài)氨酸目前在食品領(lǐng)域用作防腐劑，涵蓋許多食品行業(yè)。比如用在延緩水產(chǎn)品品質(zhì)劣變[11]、蔬菜保鮮[12]、延長(zhǎng)肉及肉制品的保質(zhì)期[13]、食品抑菌膜的制作[14]、某些農(nóng)產(chǎn)品病害的預(yù)防[15]等方面。

為了提高ε-聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量，同時(shí)獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益，本試驗(yàn)優(yōu)化了突變菌株的培養(yǎng)基主要成分，獲得的相關(guān)成果可為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的基礎(chǔ)技術(shù)支持，以滿(mǎn)足食品市場(chǎng)對(duì)此類(lèi)天然保鮮劑的需求。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室所保存的經(jīng)過(guò)誘變育種后的白色鏈霉菌。

1.1.2 試驗(yàn)材料

葡萄糖(分析純)：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；糖蜜(分析純)：廣西鑫財(cái)投資有限公司；玉米漿(分析純)：南京茂捷微生物科技有限公司；氯化銨(分析純)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；ε-聚賴(lài)氨酸(化學(xué)純)：鄭州拜納佛生物工程股份有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

PB-10型酸度計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；BSD-YX3200型立式雙層智能精密型搖床 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；AK/QC-058型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

液體種子液培養(yǎng)基(M3G培養(yǎng)基)：50 g葡萄糖，5 g酵母膏，10 g (NH4)2SO4，0.8 g磷酸氫二鉀，1.36 g磷酸二氫鉀，0.5 g MgSO4·7H2O，0.03 g FeSO4·7H2O，蒸餾水1 L，0.04 g ZnSO4·7H2O，pH(6.8±0.2)，滅菌條件為121 ℃，20 min[16]。

優(yōu)化使用發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽成分與液體種子培養(yǎng)基相同。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

在平板上選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落取1環(huán)菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h(條件為200 r/min，30 ℃)，以得種子液。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

將誘變后的菌株種子液按照10%接種量接入40 mL液體培養(yǎng)基(初始pH值為6.8)中，然后分別培養(yǎng)一定時(shí)間(條件為200 r/min，30 ℃)。

1.3.2.1 培養(yǎng)基中碳源、氮源的篩選

a.碳源種類(lèi)的篩選

土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜使用濃度均為50 g/L[17]，其余營(yíng)養(yǎng)成分：酵母浸粉5 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，分別培養(yǎng)3，4，5，6，7 d，取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸含量以及菌體干重。

b.有機(jī)氮源種類(lèi)的篩選

酵母粉、魚(yú)粉蛋白、小麥蛋白、玉米漿、低溫大豆餅粉、中溫大豆餅粉使用濃度均為15 g/L[18]，其余營(yíng)養(yǎng)成分：葡萄糖50 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，分別培養(yǎng)3，4，5，6，7 d，取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸含量以及菌體干重。

c.無(wú)機(jī)氮源種類(lèi)的篩選

硫酸銨、氯化銨和尿素使用濃度均為15 g/L[19]，其余營(yíng)養(yǎng)成分：葡萄糖50 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，分別培養(yǎng)3，4，5，6，7 d，取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸含量以及菌體干重。

1.3.2.2 培養(yǎng)基中碳源、氮源配比的篩選

根據(jù)碳源、有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源選擇結(jié)果以及此菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)特性，以ε-聚賴(lài)氨酸增加量以及菌體干重增加量為指標(biāo)，對(duì)碳源、氮源分別進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

1.3.2.3 培養(yǎng)基中復(fù)合碳源、氮源篩選單因素試驗(yàn)

選擇復(fù)合碳源含量分別為10～50 g/L之間的5個(gè)梯度，兩種不同的碳源(比例為3∶2)，其余營(yíng)養(yǎng)成分為玉米漿5 g/L，氯化銨10 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，在上述相同條件下培養(yǎng)5 d，分別取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

選擇不同的碳源，配比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，碳源總量為30 g/L，其余營(yíng)養(yǎng)成分為玉米漿5 g/L，氯化銨10 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，在上述相同條件下培養(yǎng)5 d，分別取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

選擇總氮源含量分別為10～30 g/L之間的5個(gè)梯度，兩種不同的有機(jī)氮源比例為1∶2，其余營(yíng)養(yǎng)成分為葡萄糖50 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，在上述相同條件下培養(yǎng)5 d，分別取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

選擇兩種不同的氮源，配比分別為0.5∶2.5、1∶2、1.5∶1.5、2∶1、2.5∶0.5，氮源總量為15 g/L，其余營(yíng)養(yǎng)成分為葡萄糖50 g/L，無(wú)機(jī)鹽與優(yōu)化培養(yǎng)基相同，在上述相同條件下培養(yǎng)5 d，分別取發(fā)酵液測(cè)ε-聚賴(lài)氨酸增加量、菌體干重增加量以及pH的變化。

1.3.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以ε-聚賴(lài)氨酸含量為指標(biāo)對(duì)復(fù)合碳源總量、碳源配比、復(fù)合氮源總量以及有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源配比進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.3 ε-聚賴(lài)氨酸含量的測(cè)定

參照Itzhaki[20]和Shima的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源、氮源種類(lèi)篩選結(jié)果

2.1.1 碳源種類(lèi)篩選結(jié)果

選擇5種常用物質(zhì)作為碳源，分別為土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜，濃度均為5%，即50 g/L，產(chǎn)量結(jié)果見(jiàn)圖1，菌體干重變化見(jiàn)圖2。

圖1 不同種類(lèi)碳源對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸濃度的影響Fig.1 The effect of different types of carbon sources on the concentration of ε-polylysine

圖2 不同種類(lèi)碳源對(duì)菌體干重的影響Fig.2 The effect of different types of carbon sources on the dry weight of bacteria

由圖1可知，ε-聚賴(lài)氨酸濃度總體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，土豆淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、甘油、糖蜜5種碳源中以甘油和糖蜜為碳源的兩個(gè)試驗(yàn)組ε-聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量較高，分別為9.008，9.003 g/L。由圖2可知，菌體干重也隨著天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵5～7 d增加不明顯；發(fā)酵至第3天時(shí)，土豆淀粉作為碳源的試驗(yàn)組菌體干重較高，但其在后續(xù)發(fā)酵中并沒(méi)有大幅度變化，可能是由于土豆淀粉不易溶于水，在測(cè)量中產(chǎn)生的誤差。發(fā)酵至第5天時(shí)，當(dāng)甘油作為碳源時(shí)，其試驗(yàn)組的菌體干重較高，為20.075 g/L，其次是糖蜜為碳源的兩個(gè)試驗(yàn)組。由于葡萄糖有利于菌體早期的生長(zhǎng)，因此碳源最終選擇葡萄糖、甘油和糖蜜進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.2 有機(jī)氮源種類(lèi)篩選結(jié)果

本試驗(yàn)選擇的有機(jī)氮源分別為酵母粉、魚(yú)粉蛋白、小麥蛋白、玉米漿、低溫大豆餅粉以及中溫大豆餅粉，濃度均為1%，即10 g/L，配制發(fā)酵培養(yǎng)基；接種活化好的種子液后，分別發(fā)酵3～7 d，然后測(cè)定目標(biāo)產(chǎn)物含量，結(jié)果見(jiàn)圖3，菌體干重變化見(jiàn)圖4。

圖3 不同種類(lèi)有機(jī)氮源對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸濃度的影響Fig.3 The effect of different types of organic nitrogen sources on the concentration of ε-polylysine

圖4 不同種類(lèi)有機(jī)氮源對(duì)菌體干重的影響Fig.4 The effect of different types of organic nitrogen sources on the dry weight of bacteria

由圖3可知，ε-聚賴(lài)氨酸的產(chǎn)量總體是上升的，玉米漿、低溫大豆餅粉、中溫大豆餅粉作為氮源的3個(gè)試驗(yàn)組ε-聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量均較高，分別為8.097，8.039，9.002 g/L。但是，低溫大豆餅粉作為氮源的試驗(yàn)組在發(fā)酵4 d后，產(chǎn)量并沒(méi)有明顯增加。由圖4可知，除小麥蛋白試驗(yàn)組外，其他氮源試驗(yàn)組的菌體干重先增加后減少，其中以酵母菌作為氮源時(shí)，該試驗(yàn)組的菌體干重減少的最明顯，中溫大豆餅粉試驗(yàn)組減少的最不明顯。小麥蛋白作為氮源時(shí)，該試驗(yàn)組的菌體干重一直處于上升的趨勢(shì)，可能是小麥蛋白不利于微生物的前期生長(zhǎng)。發(fā)酵至第5天時(shí)，小麥蛋白作為氮源其菌體干重較高，為16.763 g/L，其次是中溫大豆餅粉、低溫大豆餅粉、玉米漿、魚(yú)粉蛋白(后三者相差不多)為氮源的4個(gè)試驗(yàn)組。這幾種氮源在發(fā)酵5～7 d產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體干重均并無(wú)大的變化；由于低溫大豆餅粉試驗(yàn)組發(fā)酵4 d后ε-聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量沒(méi)有明顯增加，小麥蛋白、魚(yú)粉蛋白作為氮源的兩個(gè)試驗(yàn)組ε-聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量不高，因此選擇玉米漿和中溫大豆餅粉作為氮源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 無(wú)機(jī)氮源種類(lèi)篩選結(jié)果

由圖5可知，ε-聚賴(lài)氨酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵天數(shù)的增加先增加而后出現(xiàn)了微弱的下降趨勢(shì)，其中在發(fā)酵第5天時(shí)，氯化銨作為氮源的試驗(yàn)組其目標(biāo)產(chǎn)物含量較高，為7.628 g/L。但是，硫酸銨作為氮源的試驗(yàn)組發(fā)酵4～7 d，目標(biāo)產(chǎn)物并沒(méi)有明顯增加。由圖6可知，菌體干重先增加而后出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，其中硫酸銨作為無(wú)機(jī)氮源的試驗(yàn)組在發(fā)酵第5天其發(fā)酵液的菌體干重較其他兩種無(wú)機(jī)氮源均高，為10.963 g/L。因此，選擇硫酸銨和氯化銨作為無(wú)機(jī)氮源進(jìn)行復(fù)配試驗(yàn)。

圖5 不同種類(lèi)無(wú)機(jī)氮源對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸濃度的影響Fig.5 The effect of different types of inorganic nitrogen sources on the concentration of ε-polylysine

圖6 不同種類(lèi)無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌體干重的影響Fig.6 The effect of different types of inorganic nitrogen sources on the dry weight of bacteria

2.2 培養(yǎng)基中復(fù)合碳源、復(fù)合氮源的篩選結(jié)果

根據(jù)上述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)的篩選，分別選出兩種較為合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，結(jié)合白色鏈霉菌的生長(zhǎng)特性，對(duì)碳源、氮源進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配比例根據(jù)白色鏈霉菌典型的生長(zhǎng)曲線(xiàn)設(shè)計(jì)。

2.2.1 碳源配比篩選結(jié)果

選擇不同的碳源種類(lèi)進(jìn)行不同比例復(fù)配，以考察其對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，2號(hào)(葡萄糖∶糖蜜為3∶2)、3號(hào)(甘油∶糖蜜為2.5∶2.5)、4號(hào)(葡萄糖∶甘油∶糖蜜為3∶1∶1)3個(gè)復(fù)合碳源試驗(yàn)組的菌體增加量、ε-聚賴(lài)氨酸增加量均高于1號(hào)(葡萄糖∶甘油為3∶2)試驗(yàn)組，且2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)3個(gè)試驗(yàn)組在菌體增加量、ε-聚賴(lài)氨酸增加量方面非常接近，所以從經(jīng)濟(jì)方面考慮，碳源選擇葡萄糖和糖蜜進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配比例選擇葡萄糖∶糖蜜為3∶2。

圖7 碳源復(fù)配比例篩選結(jié)果圖Fig.7 The screening results of compound ratios of carbon sources

2.2.2 氮源配比篩選結(jié)果

選擇不同的氮源種類(lèi)進(jìn)行不同比例復(fù)配，以考察其對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 氮源復(fù)配比例篩選結(jié)果圖Fig.8 The screening results of compound ratios of nitrogen sources

由圖8可知，2號(hào)復(fù)合氮源組(氯化銨∶玉米漿為2∶1)的菌體增加量以及ε-PL增加量較其他6組明顯突出；1號(hào)(氯化銨∶大豆餅粉為2∶1)、3號(hào)(氯化銨∶大豆餅粉∶玉米漿為2∶0.5∶0.5)、7號(hào)(氯化銨∶硫酸銨∶大豆餅粉∶玉米漿為1∶1∶0.5∶0.5)3個(gè)復(fù)合氮源試驗(yàn)組的ε-PL增加量雖然也較高，但是1號(hào)、3號(hào)、7號(hào)這3組的菌體增加量并不明顯。4號(hào)(硫酸銨∶大豆餅粉為2∶1)作為復(fù)合氮源時(shí)，菌體增加量以及ε-PL增加量均不明顯；5號(hào)(硫酸銨∶玉米漿為2∶1)作為復(fù)合氮源時(shí)，菌體增加量以及ε-PL增加量亦均不明顯；6號(hào)(硫酸銨∶大豆餅粉∶玉米漿為2∶0.5∶0.5)復(fù)合氮源組菌體增加量較為明顯，但是其ε-PL增加量并不明顯。根據(jù)上述分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大豆餅粉與其他氮源種類(lèi)進(jìn)行復(fù)配時(shí)，效果并不理想，可能是因?yàn)榇蠖癸灧蹠?huì)有一部分不能溶于水，從而導(dǎo)致其不能夠完全利用，因此，氮源選擇氯化銨和玉米漿進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配比例選擇氯化銨∶玉米漿為2∶1。

2.3 復(fù)合碳源、復(fù)合氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)復(fù)合碳源、復(fù)合氮源的篩選結(jié)果，先對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)中A、B、C、D 4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，為響應(yīng)面試驗(yàn)提供一個(gè)合理的數(shù)據(jù)范圍后，再進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)得出最優(yōu)組合。

2.3.1 復(fù)合碳源、復(fù)合氮源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 復(fù)合碳源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果

將葡萄糖及糖蜜按照固定比例復(fù)配，考察其復(fù)配后不同的復(fù)合碳源總濃度對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 復(fù)合碳源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.9 Single-factor test results of compound carbon source concentration

由圖9可知，菌體增加量一直呈上升趨勢(shì)，但是ε-PL增加量則是先增加后減少，當(dāng)復(fù)合碳源濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，ε-PL增加量達(dá)到一個(gè)最高點(diǎn)(7.465±0.661)g/L，隨后開(kāi)始下降，在復(fù)合碳源濃度達(dá)到40 g/L以后下降趨勢(shì)并不明顯，pH值隨著濃度的變化并無(wú)特別明顯的變化，保持在4.0左右，因此可以看出濃度的變化對(duì)發(fā)酵液pH值的影響并不大。綜上，單因素試驗(yàn)碳源濃度結(jié)果為30 g/L。

2.3.1.2 碳源配比單因素試驗(yàn)結(jié)果

將葡萄糖及糖蜜進(jìn)行不同比例復(fù)配，保持一定的濃度，考察其復(fù)配后不同的配比對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 碳源配比單因素試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.10 Single-factor test results of carbon source ratios

由圖10可知，隨著糖蜜量的增加、葡萄糖量的減少，菌體增加量先呈上升趨勢(shì)再呈下降趨勢(shì)，在碳源配比為1∶4時(shí)出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，為(7.700±0.361)g/L；ε-PL增加量先出現(xiàn)了一個(gè)下降趨勢(shì)隨后開(kāi)始增加，當(dāng)碳源配比達(dá)到1∶4時(shí)，ε-PL增加量達(dá)到最高點(diǎn)，為(7.982±0.273)g/L，而后開(kāi)始出現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)。pH值隨著葡萄糖和糖蜜配比的變化，其變化不太明顯，仍然保持在4.0左右。綜上所述，碳源配比結(jié)果為葡萄糖∶糖蜜為1∶4。

2.3.1.3 復(fù)合氮源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果

將氯化銨及玉米漿按照固定比例復(fù)配，考察其復(fù)配后不同的復(fù)合氮源總濃度對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 復(fù)合氮源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.11 Single-factor test results of compound nitrogen source concentration

由圖11可知，菌體增加量隨著復(fù)合氮源濃度的增加一直呈上升趨勢(shì)，但是ε-PL增加量則是先增加后減少，當(dāng)濃度達(dá)到20 g/L時(shí)，ε-PL增加量最多，為(6.999±0.503)g/L。pH值有些許變化，呈上升趨勢(shì)，即復(fù)合氮源濃度越高，pH值也隨之增加。綜上，復(fù)合氮源濃度單因素試驗(yàn)結(jié)果為20 g/L。

2.3.1.4 氮源配比單因素試驗(yàn)結(jié)果

將氯化銨及玉米漿進(jìn)行不同比例復(fù)配，保持一定的濃度，考察其復(fù)配后不同的配比對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量及菌體量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 氮源配比單因素試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.12 Single-factor test results of nitrogen source ratios

由圖12可知，隨著玉米漿量的增加、氯化銨量的減少，菌體增加量先呈上升趨勢(shì)再呈下降趨勢(shì)，在氮源配比為1∶2時(shí)出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，為(7.5±0.254)g/L；ε-PL增加量先是增加，亦是在氮源配比為1∶2時(shí)出現(xiàn)一個(gè)最高點(diǎn)，為(7.344±0.342)g/L。pH值隨著玉米漿和氯化銨配比的變化，其變化先是保持在5.0左右，在氮源配比為1.5∶1.5時(shí)，pH值雖然開(kāi)始下降，但仍然維持在4.0左右。結(jié)合經(jīng)濟(jì)、時(shí)間等各方面原因，氮源配比單因素試驗(yàn)結(jié)果為氯化銨∶玉米漿為1∶2。

2.3.2 復(fù)合碳源、復(fù)合氮源篩選響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以ε-PL含量為指標(biāo)，以復(fù)合碳源濃度、碳源配比、復(fù)合氮源濃度以及氮源配比為因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)見(jiàn)表1，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合的各因素的回歸方程為：Y=14.29+0.19A+0.15B-0.2C-0.053D+0.26AB-0.47AC+0.015AD-0.11BC+0.052BD-0.075CD-0.43A2-0.14B2-0.23C2-0.31D2。并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis table

續(xù) 表

由表3可知，模型的P<0.05，即此模型差異性顯著，失擬項(xiàng)的P>0.05，即失擬項(xiàng)差異不顯著，說(shuō)明此模型擬合較好，能夠反映出各因素與結(jié)果的關(guān)系，即模型可用。根據(jù)表3中F值的大小即可判斷影響ε-PL含量的主次順序?yàn)镃(氮源濃度)>A(碳源濃度)>B(碳源配比)>D(氮源配比)。此試驗(yàn)中差異極顯著的有交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)A2，達(dá)到顯著的有一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)D2。

2.3.3 響應(yīng)面曲面圖分析

A、B、C、D兩兩交互作用見(jiàn)圖13～圖18。通過(guò)對(duì)6個(gè)曲面的觀(guān)察可以看出響應(yīng)面與各因素之間的作用。

圖13 碳源濃度與碳源配比對(duì)ε-PL含量的影響Fig.13 The effect of carbon source concentration and carbon >source ratios on ε-PL concentration

由圖13可知，假設(shè)碳源配比保持不變，ε-聚賴(lài)氨酸含量變化隨著碳源濃度的增加先上升后下降，說(shuō)明碳源濃度過(guò)高對(duì)ε-聚賴(lài)氨酸含量不僅沒(méi)有正方向作用反而還有反作用。當(dāng)碳源濃度固定時(shí)，響應(yīng)面陡峭程度較為平緩，隨著碳源配比的變化其變化不大，即響應(yīng)值(ε-聚賴(lài)氨酸含量)變化不大。說(shuō)明A碳源濃度、B碳源配比兩因素之間的交互作用不顯著。

由圖14可知，當(dāng)?shù)礉舛裙潭ú蛔儠r(shí)，ε-聚賴(lài)氨酸含量隨著碳源濃度的增加，其變化先呈上升趨勢(shì)后出現(xiàn)一小部分下降趨勢(shì)。當(dāng)碳源濃度固定不變時(shí)，ε-聚賴(lài)氨酸含量隨著氮源濃度的增加，其變化先呈上升趨勢(shì)后出現(xiàn)一部分平緩趨勢(shì)，說(shuō)明氮源濃度過(guò)高并沒(méi)有積極作用。說(shuō)明A碳源濃度、C氮源濃度的交互作用顯著。

圖14 碳源濃度與氮源濃度對(duì)ε-PL含量的影響Fig.14 The effect of carbon source concentration and nitrogen source concentration on ε-PL concentration

由圖15可知，氮源配比固定不變，ε-聚賴(lài)氨酸含量隨著碳源濃度的增加其變化先上升后下降。當(dāng)碳源濃度不變時(shí)，響應(yīng)面陡峭程度較為平緩，隨著氮源配比的變化其變化不大，即響應(yīng)值(ε-聚賴(lài)氨酸含量)的變化不大。說(shuō)明A碳源濃度、D氮源配比的交互作用不顯著。

圖15 碳源濃度與氮源配比對(duì)ε-PL含量的影響Fig.15 The effect of carbon source concentration and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

由圖16可知，假設(shè)C固定不變，響應(yīng)值隨著碳源配比的變化其變化趨勢(shì)平緩。當(dāng)B不變時(shí)，隨著氮源濃度不斷增加，響應(yīng)面陡峭程度較為平緩，響應(yīng)值變化不大。說(shuō)明B碳源配比、C氮源濃度的交互作用不顯著。

圖16 碳源配比與氮源濃度對(duì)ε-PL含量的影響Fig.16 The effect of carbon source ratios and nitrogen source concentration on ε-PL concentration

由圖17可知，假設(shè)氮源配比固定不變，響應(yīng)面變化隨著碳源配比的增加其趨勢(shì)平緩。當(dāng)B不變時(shí)，隨著D數(shù)值的變化，響應(yīng)面陡峭程度較為平緩，響應(yīng)值變化不大。說(shuō)明B碳源配比、D氮源配比的交互作用不顯著。

圖17 碳源配比與氮源配比對(duì)ε-PL含量的影響Fig.17 The effect of carbon source ratios and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

由圖18可知，假設(shè)氮源配比不變，ε-聚賴(lài)氨酸含量隨著C的增加，其變化先呈上升趨勢(shì)后出現(xiàn)一小部分下降趨勢(shì)。當(dāng)C固定時(shí)，隨著氮源配比的變化，響應(yīng)面陡峭程度較為平緩。說(shuō)明C氮源濃度、D氮源配比的交互作用不顯著。

圖18 氮源濃度與氮源配比對(duì)ε-PL含量的影響Fig.18 The effect of nitrogen source concentration and nitrogen source ratios on ε-PL concentration

2.3.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

此軟件得出最佳結(jié)果為：碳源配比為葡萄糖∶糖蜜為1∶4，復(fù)合碳源濃度為40 g/L，復(fù)合氮源濃度為15 g/L，氮源配比為氯化銨∶玉米漿為1∶2。經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，求取平均值，得出在此條件下其發(fā)酵液中ε-聚賴(lài)氨酸含量為14.76 g/L。

3 結(jié)論

碳源種類(lèi)選擇葡萄糖、甘油、糖蜜，有機(jī)氮源種類(lèi)選擇玉米漿和中溫大豆餅粉，無(wú)機(jī)氮源種類(lèi)選擇硫酸銨和氯化銨。碳源配比為葡萄糖∶糖蜜為3∶2，氮源配比為氯化銨∶玉米漿為2∶1。

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的復(fù)合碳源、復(fù)合氮源結(jié)果為：復(fù)合碳源濃度為40 g/L，碳源配比為葡萄糖∶糖蜜為1∶4，復(fù)合氮源濃度為15 g/L，氮源配比為氯化銨∶玉米漿為1∶2。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8 g/L，糖蜜32 g/L，氯化銨5 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO4·7H2O 3.2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.08 g/L，ZnSO4·7H2O 0.04 g/L，K2HPO42.4 g/L，KH2PO43.2 g/L，在此條件下其發(fā)酵液中ε-聚賴(lài)氨酸含量為14.76 g/L。