貴州天名精化學(xué)成分及抗菌活性研究

陳 潔，王 丹，張 雄，彭明友，徐 冉,2，晏 英,2，王 穎,2*

1貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省化學(xué)合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550004

菊科天名精屬(Carpesium)植物為多年生草本，全世界約有21種，其中少數(shù)種分布于歐亞大陸，大部分分布于亞洲中部，尤其是在我國(guó)的西南片區(qū)有豐富的植物資源，其中的天名精、煙管頭草和金挖耳已被列入中國(guó)法定藥用植物，貴州天名精(Carpesiumfaberi)因其止血、抗寄生蟲、抗炎和解毒特性，長(zhǎng)期以來(lái)被用作民間藥物[1,2]。文獻(xiàn)報(bào)道已從天名精屬植物中至少分離得到277個(gè)化合物，結(jié)構(gòu)類型包括萜類，黃酮，酚類，甾體等，其中從貴州天名精中分離得到37個(gè)化合物，其中倍半萜是其主要活性成分[2]。藥理研究顯示倍半萜類化合物具有抗腫瘤、抗瘧原蟲、抗炎、抗菌等多種生物活性[3]。近年來(lái)對(duì)于貴州天名精的活性報(bào)道主要是抗腫瘤活性[4-6]以及抗炎活性[7,8]，尚未對(duì)其抗菌活性進(jìn)行報(bào)道。為促進(jìn)天名精植物資源的綜合開發(fā)與利用，本研究對(duì)采自貴州凱里的天名精全草開展化學(xué)成分研究，并對(duì)所得化合物進(jìn)行抗菌活性測(cè)試。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化，N-1300D-WD)；Bruker AV-600 MHz核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)；四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)；Bruker HTC/Esquire 質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司)；高效液相色譜儀為Agilent 1200型(美國(guó)安捷倫科技司)；色譜柱Waters sunfire C18(10 mm × 150 mm，4.6 mm× 250 mm)(沃特世公司)；BP211D電子天平(Sartorouius公司)；UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器有限公司)；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)；超低溫保存箱(海爾醫(yī)療公司)；高壓滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；96孔一次性細(xì)胞培養(yǎng)板(耐思生命科技有限公司)；移液槍(Eppendorf公司)。二甲基亞砜(索萊寶科技有限公司)；MHB培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)公司)；Sephadex LH-20(三菱公司)；C18反相硅膠(日本YMC公司)；正相硅膠和薄層色譜板(青島海洋化工廠)；核磁用氘代試劑(美國(guó)CIL氘代試劑)；液相用水(娃哈哈純凈水20181109)；色譜級(jí)甲醇、乙腈(科密歐試劑公司)；化學(xué)實(shí)驗(yàn)用溶劑為工業(yè)重蒸溶劑，顯色劑為8%的硫酸乙醇溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，均購(gòu)于上海中科康泰生物有限公司，保存于-80 ℃。

樣品采自貴省州凱里市，經(jīng)過(guò)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文老師鑒定為貴州天名精(Carpesiumfaberi)，憑證標(biāo)本(TMJ201909)保存于貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 化合物的提取與分離

將貴州天名精全草30 kg切碎后，以乙醇在室溫條件下浸泡48 h后提取，每次提取時(shí)間為3 h，所得提取液在55 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將所得浸膏放置于通風(fēng)櫥中，揮干至無(wú)醇味，所得浸膏大約12 kg。將上述所得浸膏加水充分混懸后用乙酸乙酯萃取3次。萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(溫度：55 ℃)上濃縮。所得萃取物放置于通風(fēng)櫥中，待溶劑揮干，最后稱取浸膏的重量為：乙酸乙酯部分重1.5 kg。取乙酸乙酯部位浸膏，用乙酸乙酯充分溶解后，加入適量正相硅膠(40～80目)拌樣。正相硅膠(100～200目)用石油醚濕法裝柱，邊加邊敲打柱體，以確保裝柱結(jié)實(shí)無(wú)氣泡，反復(fù)利用石油醚沖洗，待液面降至與硅膠面基本相平，采用干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯(50∶1→0∶1)梯度洗脫樣品，經(jīng)TLC檢測(cè)，合并相似流分，共得10個(gè)組分，記為Fr1～Fr10。

其中Fr5(67.5 g)經(jīng)過(guò)MCI(甲醇-水50%→100%)得到8個(gè)亞餾分，記為Fr5-1～Fr5-8，其中Fr5-3(1 g)經(jīng)過(guò)反相(甲醇-水40%→100%)，得到6個(gè)亞餾分，記為Fr5-3a～Fr5-3f，其中Fr5-3e再經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為98%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時(shí)間23 min)得到化合物11(4 mg)；Fr5-5(10 g)經(jīng)過(guò)反相柱(甲醇-水40%→100%)得到8個(gè)亞餾分，記為Fr55-1～Fr55-8，其中Fr55-5經(jīng)過(guò)凝膠柱層析(甲醇)再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇1∶0→100∶1)，得到化合物13(4.6 mg)；Fr55-6經(jīng)過(guò)凝膠柱層析(甲醇)，再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯35∶1→0∶1)得到6個(gè)亞餾分，記為Fr55-6a～Fr55-6f，其中Fr55-6d經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為70%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時(shí)間25.6 min)得到化合物10(3 mg)；Fr55-6b經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為100%甲醇，流速3 mL/min，保留時(shí)間27.2 min)得到化合物9(5.5 mg)；Fr55-7經(jīng)過(guò)凝膠柱層析(甲醇)，再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮20∶1→0∶1)，得到3個(gè)亞餾分Fr55-7a～Fr55-7c，其中Fr55-7b經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為98%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時(shí)間21 min)得到化合物14(3 mg)；Fr55-7a經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為100%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時(shí)間22 min)得到化合物8(4.9 mg)；Fr55-8經(jīng)過(guò)2次硅膠柱(石油醚：乙酸乙酯40∶1→0∶1)，得到化合物12(4.8 mg)。

Fr7(78 g)經(jīng)過(guò)MCI(甲醇-水20%→100%)得到9個(gè)亞餾分，記為Fr7-1～Fr7-9，其中Fr7-2經(jīng)過(guò)反相柱層析(甲醇-水10%→50%)得到5個(gè)亞餾分，記為Fr7-2-1～Fr7-2-5，其中Fr7-2-3經(jīng)硅膠柱層析(5∶1→0∶1)得到5個(gè)亞餾分記為Fr7-2-3a～Fr7-2-3e，其中Fr7-2-3b經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為30%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時(shí)間15 min)得到化合物7(10.9 mg)；Fr7-2-3c經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為30%甲醇-水，流速2.5 mL/min，保留時(shí)間18.2 min、24 min)，得到化合物2(6.8 mg)、化合物3(4.4 mg)；Fr7-4經(jīng)過(guò)反相柱層析(甲醇-水10%→60%)得到10個(gè)亞餾分，記為Fr7-4-1～Fr7-4-10，其中Fr7-4-3、Fr7-4-6用甲醇重結(jié)晶得到化合物5(10 mg)、化合物1(20 mg)；Fr7-4-8經(jīng)過(guò)硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇200∶1→0∶1)再經(jīng)過(guò)制備型HPLC(流動(dòng)相為40%甲醇-水，流速2.5 mL/min，保留時(shí)間26 min)，得到化合物4(5.1 mg)；Fr7-7用甲醇重結(jié)晶得到化合物6(24 mg)。

1.3.2 化合物1單晶結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將化合物1在1 mL液相瓶中用甲醇溶解，瓶口用塑料膜覆蓋，并在膜上扎2個(gè)小孔，室溫?fù)]發(fā)，得到若干晶體。對(duì)于單晶分析，選擇尺寸為0.40 mm × 0.07 mm × 0.04 mm的晶體。所有衍射數(shù)據(jù)均在裝備銅靶的Bruker Smart Apex CCD diffractometer衍射儀上獲得。

1.3.3 化合物活性篩選

1.3.3.1 樣品供試液制備

精確稱取一定量的化合物溶于二甲基亞砜中，配制成濃度為15.36 mg/mL的溶液，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 菌株活化

MHB液體培養(yǎng)基：稱取12 g固體培養(yǎng)基，加蒸餾水1 000 mL，加熱使培養(yǎng)基完全溶解，于高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌30 min。

將細(xì)菌接種在MHB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、130 r/min條件下活化培養(yǎng)24 h；利用平板劃線法蘸取活化菌液于固體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)12～24 h，獲得單個(gè)菌落。用接種環(huán)挑取單菌落于MHB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)24 h，制得菌懸液，用MHB培養(yǎng)液將菌懸液濃度稀釋至1×106～1×107CFU/mL備用。

1.3.3.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

使用無(wú)菌96孔一次性細(xì)胞培養(yǎng)板，做好標(biāo)記后，在1號(hào)孔中加入300 μL培養(yǎng)基溶液為空白對(duì)照，在2號(hào)孔中加入10 μL DMSO，140 μL培養(yǎng)基溶液，在3號(hào)孔中加入10 μL硫酸慶大霉素，140 μL培養(yǎng)基溶液，5～12號(hào)孔預(yù)先加入150 μL培養(yǎng)基溶液，4號(hào)孔加入290 μL培養(yǎng)基溶液，再加入10 μL樣品溶液混勻后吸取150 μL至5號(hào)孔，采用二倍稀釋法依次進(jìn)行稀釋至12號(hào)孔，每個(gè)梯度重復(fù)3次；2～12孔均加入100 μL，1×106～107CFU/mL菌懸液，接種后，置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后取出觀察。如小孔內(nèi)澄清即視為細(xì)菌生長(zhǎng)受到了抑制，澄清小孔中所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為對(duì)該菌的最低抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)方法參考Wang等[9]的研究。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1的晶體數(shù)據(jù)：C15H20O4，M = 264.31，晶胞參數(shù)：a= 6.462 1(2)nm，b= 6.462 1(2)nm，c= 62.496(2)nm，α= 90°，β= 90°，γ= 90°；晶胞體積：V= 2 609.75(18)nm3；晶胞內(nèi)分子數(shù)：Z= 8；T= 100(2)K，空間群P41 212，μ(Cu Kα)= 0.790 mm-1，共收集24 445個(gè)衍射點(diǎn)，對(duì)其中2 548個(gè)獨(dú)立點(diǎn)(Rint=0.027 9)進(jìn)行分析。R1=0.033 5，wR2=0.089 8，F(xiàn)lack 參數(shù)為0.02(2)，如圖2所示。

圖2 化合物1的單晶X射線衍射結(jié)構(gòu)

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定結(jié)果

評(píng)估了化合物1～14對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢菌和白色念珠菌的抑菌活性。結(jié)果表明，化合物1對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出微弱抑菌活性，化合物1的MIC值為256 μg/mL，化合物10和化合物6對(duì)白色念珠菌顯示出弱活性，化合物10的MIC值為128 μg/mL，化合物6的MIC值為128 μg/mL，其余化合物則未顯示抗菌活性。

3 結(jié)論

利用多種色譜方法，從黔產(chǎn)天名精中分離鑒定得到14個(gè)化合物，如圖1所示，包括倍半萜、二萜、甾體類等成分，其中化合物2、7～14為首次從該植物中得到。針對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行抗菌活性篩選。采用二倍稀釋法，測(cè)定化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢菌和白色念珠菌的抑菌活性，使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，所有樣品均使用DMSO溶解配制成15.36 mg/mL的藥液?；钚詼y(cè)試結(jié)果顯示，抗菌活性測(cè)試表明，化合物1對(duì)枯草芽孢桿菌有微弱抑菌活性，化合物1的MIC值為256 μg/mL，化合物10、化合物6對(duì)白色念珠菌顯示出弱活性，化合物10的MIC值為128 μg/mL，化合物6的MIC值為128 μg/mL，其余化合物則未顯示出抗菌活性。本研究成果豐富了貴州天名精中的化學(xué)成分及生物活性內(nèi)容，為其進(jìn)一步的研究開發(fā)提供參考資料。

圖1 化合物1～14化學(xué)結(jié)構(gòu)