基于UPLC-QTOF-MS分析不同產(chǎn)地鐵皮石斛化學(xué)成分含量差異

陳定康，李芝蘭，楊 柳，胡江苗

1中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所；2中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物醫(yī)生研發(fā)中心，昆明 650201；3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生附生型草本植物，自古以來都是我國(guó)應(yīng)用中藥材中的名品，其自然主要分布區(qū)在安徽、浙江、湖南、福建、廣西、四川、云南等地[1]。鐵皮石斛的人工種植主產(chǎn)區(qū)為云南、浙江、安徽、廣東。鐵皮石斛中含有多種化學(xué)物質(zhì)，包括多糖、生物堿類、黃酮類、聯(lián)芐類、木脂素類及揮發(fā)性化學(xué)成分等活性成分，具有極高的藥用價(jià)值[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為鐵皮石斛具有益胃生津，滋陰清熱的功效，用于治療熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔等癥狀[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛中的黃酮類成分具有降血糖功效[4]，聯(lián)芐類和多糖類成分可以抗炎[5]，聯(lián)芐、黃酮及酚性成分具有抗氧化活性[6]，聯(lián)芐類成分具有抗癌作用[7]，多糖可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[8]等。

鐵皮石斛作為藥用植物，其產(chǎn)量和品質(zhì)受原植物種類、生長(zhǎng)面積、種植技術(shù)、土壤養(yǎng)分、氣候條件、采收期等因素的影響[9]。鐵皮石斛野生產(chǎn)量稀少，目前市場(chǎng)上流通的商品鐵皮石斛主要來源于全國(guó)各地的人工種植基地[10]。由于種植基地分布范圍較為廣泛，各地出產(chǎn)的鐵皮石斛生長(zhǎng)過程中的各種條件無法保證一致，勢(shì)必造成鐵皮石斛藥用價(jià)值的差異。根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》對(duì)鐵皮石斛品質(zhì)的評(píng)價(jià)方法，以多糖及醇溶性浸出物的含量為評(píng)價(jià)品質(zhì)好壞的標(biāo)準(zhǔn)[11]。藥典中規(guī)定的多糖及醇溶性浸出物都為粗提物，且檢測(cè)方法比較簡(jiǎn)略，容易產(chǎn)生較大誤差。這說明只以多糖及醇溶性浸出物含量作為鐵皮石斛品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)是具有一定局限性的，所以選擇一種鐵皮石斛中含量較高并具有良好的藥理活性的化學(xué)成分進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)定是勢(shì)在必行的[12]。本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)不同產(chǎn)地鐵皮石斛中除多糖外的其他化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，找出評(píng)價(jià)鐵皮石斛質(zhì)量的標(biāo)志組分，完善鐵皮石斛的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 材料與試劑

本研究所用植物材料是鐵皮石斛的莖部位，采集于云南、安徽、浙江和廣東等23個(gè)不同產(chǎn)地，產(chǎn)地具體信息見表1，為了方便討論，每個(gè)產(chǎn)地都有一個(gè)特定的編號(hào)TPX(X=1～23)。所有植物材料都經(jīng)過吳之坤博士(貴陽中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽)鑒定。石斛酚(純度≥99.15%)和柚皮素(純度≥99.64%)兩種標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室自行提取。

表1 不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣本來源的地理信息

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó) Waters公司)；Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國(guó)Agilent Technologies公司)；BT125D型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 醇提物的制備

2.1.1 提取工藝

鐵皮石斛的莖放置在烘干機(jī)中，烘干溫度設(shè)置為80 ℃，完全干燥后打成粉末。稱取一定量的粉末，按1∶10(粉末∶80%乙醇，m/V)比例加入溶劑，80 ℃水浴加熱回流提取2次，每次2 h。收集提取液，去除溶劑后即得不同產(chǎn)地的鐵皮石斛醇提物。

2.1.2 醇提物得率

醇提物收集后稱重，用以下公式計(jì)算得率：

式中，m醇提物表示醇提物質(zhì)量，m鐵皮石斛粉末表示稱得鐵皮石斛粉末質(zhì)量。

本次實(shí)驗(yàn)中，不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物得率結(jié)果如表2所示。醇提物得率范圍為6.80%～17.84%。

表2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物得率和定量分析結(jié)果

2.2 定性分析

由于受品種品系、種植環(huán)境、栽培管理以及采收時(shí)間等條件影響，鐵皮石斛內(nèi)含物構(gòu)成以及含量差異明顯。故此，我們利用UPLC-QTOF-MS對(duì)不用產(chǎn)地的鐵皮石斛醇提物進(jìn)行了化學(xué)成分分析。

2.2.1 分析條件

使用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF)分析醇提物的化學(xué)組成。液相色譜流動(dòng)相100%水溶液(A)-100%乙腈溶液(B)，梯度洗脫，洗脫順序?yàn)椋?～30 min，20%→100% B；30～31 min，100%→20% B；31～35 min，20% B。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，色譜柱型號(hào)為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)。質(zhì)量檢測(cè)器設(shè)定為ESI負(fù)離子模式。干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量8 L/min；霧化器壓力：30 psig；毛細(xì)管電壓：3 500 V；碰撞電壓：-175 V；錐孔體：-65 V；相對(duì)分子質(zhì)量掃描范圍：m/z50～1 700。

2.2.2 鐵皮石斛中化合物的鑒定

根據(jù)第“2.2.1”節(jié)的方法，分析了23個(gè)鐵皮石斛醇提物樣本。為確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，本試驗(yàn)同時(shí)考察了230、254、280 nm的色譜峰分離情況，結(jié)果顯示230 nm的譜圖中化合物分離度較好、吸收較強(qiáng)，故選擇230 nm作最終檢測(cè)波長(zhǎng)。23個(gè)鐵皮石斛醇提物樣品色譜圖如圖1所示。

圖1 23個(gè)鐵皮石斛醇提物樣品的指紋圖譜

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent Mass Hunter Workstation軟件，對(duì)出峰初步處理。依據(jù)峰面積、保留時(shí)間和分子量，排除假陽性的碎片峰。采用Qualitative Analysis B.06.00軟件擬合計(jì)算得到相應(yīng)的分子式，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，初步推測(cè)化學(xué)成分，如圖2所示。

圖2 阿魏酰酪胺(A)和柚皮素(B)的質(zhì)譜

對(duì)各產(chǎn)地鐵皮石斛主要成分進(jìn)行了表征，結(jié)果如表3所示。從不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物中共鑒定了(-)-lirioresinol B(1)、fructose-phenylalanine(2)、香草酸(3)、對(duì)羥基苯甲酸(4)、石斛堿(5)、對(duì)香豆酸(6)、3-羥基肉桂酸(7)、vicenin 2(8)、vicenin 1(9)、apiin(10)、4′-O-glucosylvitexin(11)、acanthoside B(12)、蘆丁(13)、6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranosylapigenin(14)、vicenin 3(15)、moupinamide(16)、2′-O-Rhamnosylvitexin(17)、柚皮素(18)、dendronobiloside A(19)、石斛酚(20)、Pinellic acid(21)、N-isopentenyldendrobine(22)、dihydroconiferyl dihydro-p-coumarate(23)、densiflorol A(24)、2-methyl-1H-indol-7-ylβ-D-mannopyranoside(25)、2-hydroxydendrobine(26)、vanilloside(27)、aduncin(28)、acuminoside(29)、棕櫚酸(30)、N-反式-對(duì)香豆酰酪胺(31)、eicosyl caffeate(32)等32種可能存在的化合物。對(duì)這32種成分進(jìn)行進(jìn)一步分析顯示，(-)-lirioresinol B(1)、fructose-phenylalanine(2)、石斛堿(5)、對(duì)香豆酸(6)、vicenin1(9)、蘆丁(13)、moupinamide(16)、柚皮素(18)、石斛酚(20)、densiflorol A(24)、vanilloside(27)、aduncin(28)、棕櫚酸(30)等13種化合物是不同產(chǎn)地鐵皮石斛的共有成分。

表3 不同產(chǎn)地鐵皮石斛化學(xué)成分鑒定結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品定量分析

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解成不同濃度用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters Xevo TQ-S)用來分析不同產(chǎn)地醇提物中石斛酚和柚皮素這兩種物質(zhì)的含量。液相色譜流動(dòng)相為100%水(A)-100% 乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫順序?yàn)椋?～4 min，20%→35% B；4～7 min，35%→100% B；7～8 min，100%→20% B；8～10 min，20% B。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，流速:0.3 mL/min，色譜柱型號(hào)為ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)。在質(zhì)量分析儀中選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行定量分析。石斛酚的離子裂解躍遷為m/z302.85→287.85；柚皮素的離子裂解躍遷為m/z270.81→150.81。石斛酚和柚皮素的錐電壓和碰撞能量分別為30 V和20 eV。優(yōu)化的通用質(zhì)譜條件為：脫溶劑溫度350 ℃，脫溶劑氣體600 L/h；毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐狀氣體流速150 L/h，碰撞氣體流速0.10 mL/min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照目標(biāo)化合物離子的響應(yīng)情況，配制不同濃度混標(biāo)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x，μg/mL)與對(duì)應(yīng)的峰面積(y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。由圖得石斛酚的線性回歸方程y=337.766x，在0～180 μg/mL濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 7。柚皮素的線性回歸方程y=213 346x，在0～5 μg/mL濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5。石斛酚的檢出限和定量限分別為0.18 μg/mL(信噪比=3)和0.70 μg/mL(信噪比=10)；柚皮素的檢出限和定量限分別為0.30 μg/mL(信噪比=3)和1.03 μg/mL(信噪比=10)。

圖3 石斛酚(A)和柚皮素(B)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取15號(hào)產(chǎn)地的樣品10 mg，平行稱量6份，進(jìn)行定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出待測(cè)物質(zhì)的含量并計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。測(cè)得待測(cè)分析物含量的RSD均小于5%，說明方法的重現(xiàn)性好。

2.4.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

根據(jù)樣品中石斛酚和柚皮素的含量及線性范圍，確定化合物在樣品中合適的加標(biāo)量，設(shè)置低、中、高三個(gè)水平的加標(biāo)量。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明方法的準(zhǔn)確度能滿足檢測(cè)要求。

表4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

2.5 石斛酚和柚皮素的含量分析

石斛酚是一種鐵皮石斛中常見的酚類化合物。有研究表明石斛酚可以誘導(dǎo)糖原合成酶激酶3β介導(dǎo)的MYC蛋白降解來達(dá)到抑制肺癌細(xì)胞增殖的目的[13]。還有資料顯示，石斛酚在抗炎和抗氧化應(yīng)激等方面具有潛在應(yīng)用[14]。柚皮素則是石斛中一種常見的黃酮類活性成分，具有抗炎、抗氧化、改善血液質(zhì)量，保護(hù)心血管系統(tǒng)等藥理活性，具有廣闊的開發(fā)前景[15]。通過多樣本分析，聯(lián)芐和黃酮是鐵皮石斛化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成主成分，這兩類成分具有代表性和普遍性。因此，選取石斛酚和柚皮素作為衡量鐵皮石斛品質(zhì)的潛在標(biāo)志化合物，兩個(gè)化合物結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 石斛酚(20)及柚皮素(18)結(jié)構(gòu)

按所建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對(duì)23種不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物中的石斛酚和柚皮素含量進(jìn)行檢測(cè)分析，不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物樣品中所含這兩種化合物含量的結(jié)果如表2所示。如結(jié)果所示，不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物中都含有石斛酚和柚皮素這兩個(gè)成分，只是在含量上存在差異。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，通過對(duì)這兩個(gè)化合物的含量測(cè)定來評(píng)價(jià)鐵皮石斛質(zhì)量是完全可行的。

3 討論與結(jié)論

藥用植物的活性表現(xiàn)受其次生代謝產(chǎn)物構(gòu)成和含量的影響：一方面取決于藥用植物本身由于品種因素造成的基因表達(dá)差異；另一方面，生長(zhǎng)過程中降雨、溫度、濕度、日照等農(nóng)業(yè)氣候條件和田間管理等對(duì)其品質(zhì)也有著重要影響。隨著對(duì)藥用植物研究的不斷深入，以單一化學(xué)成分為指標(biāo)對(duì)中藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)的體系出現(xiàn)了一定的局限性[16]。除了鐵皮石斛多糖之外，鐵皮石斛中還存在有相當(dāng)可觀的小分子化學(xué)成分[17]。廣泛分析這些化學(xué)成分，將其與鐵皮石斛的藥材質(zhì)量關(guān)聯(lián)起來，進(jìn)而找出生長(zhǎng)環(huán)境和種植工藝與鐵皮石斛品質(zhì)之間的聯(lián)系，對(duì)鐵皮石斛質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的后期改進(jìn)具有重要意義。

本研究利用UPLC-Q-TOF-MS對(duì)不同產(chǎn)地的鐵皮石斛醇提物進(jìn)行天然小分子構(gòu)成和含量進(jìn)行了探索，進(jìn)一步探討鐵皮石斛這一常用中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)鐵皮石斛醇提物進(jìn)行定性分析，共鑒定了32種主要成分，利用化學(xué)分析軟件和本地?cái)?shù)據(jù)庫對(duì)可能的結(jié)構(gòu)和分子式進(jìn)行推測(cè)，得到(-)-lirioresinol B、fructose-phenylalanine、香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、石斛堿等化學(xué)結(jié)構(gòu)。其中，有13種成分在不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物中均有檢測(cè)得到，這表明鐵皮石斛雖然受不同產(chǎn)地的影響所產(chǎn)生次生代謝物雖有一定差異但其主要活性成分認(rèn)識(shí)具有很高的共性。鐵皮石斛中富含酚性物質(zhì)，主要為石斛酚代表的聯(lián)芐類化合物和柚皮素代表的黃酮類成分。相應(yīng)地，標(biāo)準(zhǔn)品定量分析結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛中石斛酚和柚皮素的含量存在差異，說明這兩種化合物可以作為潛在的鐵皮石斛質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

近年來，本研究組一直關(guān)注鐵皮石斛新成分、新功能的開發(fā)工作，尤其是鐵皮石斛在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。Chen[18]和Qi[19]等對(duì)鐵皮石斛多糖的保濕性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明鐵皮石斛多糖提取物具有良好的保濕作用，能提高皮膚細(xì)胞對(duì)干燥環(huán)境的耐受程度。除多糖外，鐵皮石斛中還含有大量酚類化合物，這類天然的抗氧化劑在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出一定的DPPH、ABTS自由基清除活性[20,21]。目前，鐵皮石斛作為一種高端化妝品原料已廣泛用于美妝護(hù)膚產(chǎn)品中，受到廣大消費(fèi)者的青睞[22]。

為了闡明鐵皮石斛醇提物中可能的活性成分，更好地用于護(hù)膚產(chǎn)品開發(fā)，我們對(duì)不同產(chǎn)地鐵皮石斛醇提物進(jìn)行了化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成的分析工作，為鐵皮石斛的科學(xué)合理利用提供理論基礎(chǔ)。