藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的體外抑制活性研究

潘 玥，劉小莉，王 英，夏秀東，陶寧萍，吳 寒，劉思遠(yuǎn)，周劍忠,3*

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，南京 210014；3江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

藍(lán)莓是一種小漿果，甜酸適口，為鮮食佳品，屬杜鵑花科，越橘屬植物。在我國東北長白山、大興安嶺和小興安嶺林區(qū)有大量的野生藍(lán)莓[1]。藍(lán)莓富含糖類、萜類、氨基酸和大量多酚類等化合物，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用[2]。近年來，對(duì)其活性成分的研究日益增多。與藍(lán)莓的果實(shí)和花相比，藍(lán)莓葉的酚類物質(zhì)含量更高[3]。目前藍(lán)莓葉多酚在抗氧化能力[4]、降血壓、抑菌[5]方面的研究較多，降血糖方面的研究很少。如今糖尿病已成為威脅人類健康的重大疾病之一[6]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶能夠促進(jìn)口腔、胃、腸道對(duì)食物的分解，釋放葡萄糖進(jìn)入血液，使血糖水平升高[7,8]。服用抑制劑類藥物是目前治療糖尿病的首選方式。市面上化學(xué)類藥物容易引起脹氣、消化不良等副作用[9]，從天然物質(zhì)中提取抑制劑更具安全性。已有研究報(bào)道植物提取物中多酚類、萜類衍生物[10]、多糖[11]、苯丙素類化合物[12]等具有良好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。多酚在預(yù)防和治療糖尿病方面具有很大的潛力，Liu等[13]表明綠茶提取物中多酚具有抑制作用，能夠抑制腸道上皮細(xì)胞Caco-2對(duì)葡萄糖的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)。Sun等[14]通過分子對(duì)接，探究出多酚能夠與α-淀粉酶活性位點(diǎn)的氨基酸殘基結(jié)合改變酶的分子構(gòu)象，從而抑制其與底物結(jié)合。本文研究了藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用和抑制類型，為藍(lán)莓葉相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

2 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓葉2020年7月采自溧陽白露山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司藍(lán)莓基地；AB-8大孔樹脂(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(成都市科龍化工試劑有限公司)；氫氧化鈉、酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、葡萄糖、苯酚和可溶性淀粉(西隴化工股份有限公司)；沒食子酸、福林酚試劑、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)和阿卡波糖(麥克林)；α-淀粉酶(豬胰腺)(10 U/mg)和α-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司)。

Epoch酶標(biāo)儀(美國Bioteck儀器有限公司)；ML204/02電子分析天平、FE28-Meter臺(tái)式pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Deltal 2-24/LSC冷凍干燥機(jī)(德國Christ公司)；3k15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ2 200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓葉酚類物質(zhì)的提取

參照Wu等[15]方法稍作改變，將新鮮藍(lán)莓葉切片，按照料液比為1∶10(g/mL)加入酸化乙醇(含有0.5%鹽酸的80%乙醇)勻漿2 min，超聲輔助提取20 min，功率為800 W，超聲結(jié)束后5 000 r/min離心10 min收集上清液。上述提取方法提取三次后合并溶劑。經(jīng)40 ℃ 50 r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到藍(lán)莓葉多酚粗提物，將其凍干后-20 ℃避光保存。

1.2.2 總酚含量的測定

參照Wu等[15]的方法，將藍(lán)莓葉多酚凍干樣配制成1 mg/mL溶液，取0.1 mL加入0.3 mL 10%乙醇稀釋，再分別加入2.0 mL 0.5 mol/L福林酚試劑，搖勻，反應(yīng)4 min，隨后加入2 mL 75 g/L的飽和碳酸鈉，搖勻，室溫下暗反應(yīng)2 h。用蒸餾水做空白對(duì)照，利用酶標(biāo)儀在760 nm處測定吸光度。以沒食子酸(GA)在760 nm處的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為y=1.744x+0.021(R2=0.990)。y為藍(lán)莓葉多酚粗提液的吸光值，x表示總酚含量，mg GA/mg(DW)，DW為干重。

1.2.3 藍(lán)莓葉酚類物質(zhì)的純化

采用AB-8大孔吸附樹脂對(duì)藍(lán)莓葉多酚粗提物進(jìn)行純化，將100 mg粗提物溶于50 mL酸化乙醇中，經(jīng)0.45 μm有機(jī)針膜過濾，按照Ma[16]方法進(jìn)行純化，合并洗脫液。在40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)至1/4體積停止，倒出溶液，-20 ℃下凍結(jié)溶液，冷凍干燥24 h，得到純化后藍(lán)莓葉多酚。

1.2.4 藍(lán)莓葉多酚的鑒定

1.2.4.1 樣品處理

將純化后的藍(lán)莓葉多酚凍干樣用80%甲醇溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜，采用LC-MS鑒定。

1.2.4.2 液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)成分鑒定

樣品采用LC-MS體系(G2-XS QTof，Waters)進(jìn)行分析。將2 μL樣品注入U(xiǎn)PLC柱(2.1 mm×100 mm ACQUITY UPLC BEH C18柱，含有1.7 μm粒子)，流速為0.35 mL/min。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為 0.1% 甲酸乙腈水溶液。采用以下梯度程序：5% 流動(dòng)相B，0.5 min；5%→40%流動(dòng)相B,20 min;40%→95% 流動(dòng)相B,2 min;95%流動(dòng)相B,2 min。

質(zhì)譜分析采用電噴霧源，正離子模式。MSe采集模式，選擇質(zhì)量范圍50～1 200m/z。使用亮氨酸-腦啡肽(m/z556.277 1)校準(zhǔn)質(zhì)量。電離參數(shù)為：毛細(xì)管電壓2.5 kV，樣品錐 40 V，源溫度120 ℃，脫溶劑氣體溫度為 400 ℃。使用Masslynx 4.1和Unifi 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。成分鑒定參照南京農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)譜庫，鑒定匹配度高于80%的化學(xué)成分。

1.2.5α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)

將藍(lán)莓葉多酚濃度配制為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μg/mL，阿卡波糖濃度配制為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 μg/mL。按照Tian[17]方法稍作改變，以阿卡波糖作為陽性對(duì)照，按照表1進(jìn)行α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)，α-淀粉酶抑制率按下列公式計(jì)算。根據(jù)抑制率與藍(lán)莓葉多酚濃度關(guān)系，通過GraphPad Prism 8軟件擬合計(jì)算半抑制濃度IC50值。

表1 α-淀粉酶抑制活性測定

式中：ODA為實(shí)驗(yàn)組吸光值；ODa為實(shí)驗(yàn)空白組吸光值；ODB為對(duì)照組吸光值；ODb為空白組吸光值。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)

將藍(lán)莓葉多酚和阿卡波糖濃度配制為2、4、6、8、10、12、14 μg/mL，按照Tian[17]方法稍作改變，以阿卡波糖為陽性對(duì)照，按照表2進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)，α-葡萄糖苷酶抑制率按下列公式計(jì)算。根據(jù)抑制率與藍(lán)莓葉多酚濃度關(guān)系，通過GraphPad Prism 8軟件擬合計(jì)算半抑制濃度IC50值。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

式中：ODA為實(shí)驗(yàn)組吸光值；ODa為實(shí)驗(yàn)空白組吸光值；ODB為對(duì)照組吸光值；ODb為空白組吸光值。

1.2.7 藍(lán)莓葉多酚穩(wěn)定性研究

1.2.7.1 藍(lán)莓葉多酚對(duì)溫度的穩(wěn)定性

將純化后的藍(lán)莓葉多酚配制成0.02 mg/mL溶液，分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴中保溫30 min，迅速冷卻至室溫，測其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，以溫度為橫坐標(biāo)，以酶抑制活性為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.2.7.2 藍(lán)莓葉多酚對(duì)pH的穩(wěn)定性

將純化后的藍(lán)莓葉多酚配制成溶液，分別用不同pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12)的PBS緩沖液溶解后于37 ℃保溫4 h，用緩沖液回調(diào)pH至6.8和6.9，再將各個(gè)pH條件下處理的多酚稀釋至相同濃度，測定其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，以pH為橫坐標(biāo)，以酶抑制活性為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.2.8 抑制作用類型研究

1.2.8.1α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)

將純化后藍(lán)莓葉多酚配制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的溶液，α-淀粉酶溶液設(shè)置為0、0.15、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9、1.05 mg/mL。計(jì)算酶促反應(yīng)速率，繪制酶促反應(yīng)速率與α-淀粉酶濃度的關(guān)系圖。

將可溶性淀粉配制成0.25%、0.33%、0.5%、1.0%、2.0%，計(jì)算不同底物濃度和不同濃度藍(lán)莓葉多酚下的酶促反應(yīng)速率。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖和Dixon圖，分析確定藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制類型。

1.2.8.2α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)

將純化后藍(lán)莓葉多酚配制成濃度為0.005、0.010、0.015、0.020 mg/mL的溶液，α-葡萄糖苷酶溶液設(shè)置為0、0.506、1.012、1.26、1.518、2.024 U/mL。計(jì)算酶促反應(yīng)速率，繪制酶促反應(yīng)速率與α-葡萄糖苷酶濃度的關(guān)系圖。

將pNPG配制成2.5、3.3、5、10、20 mmol/L，計(jì)算不同底物濃度和不同濃度藍(lán)莓葉多酚下的酶促反應(yīng)速率。繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖和Dixon圖，分析確定藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

由Origin 2019軟件繪制，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3次，采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件整理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 純化前后藍(lán)莓葉多酚含量及抑制活性的變化

為確定純化前后藍(lán)莓葉多酚含量和抑制活性，將純化前后藍(lán)莓葉提取物凍干樣配制成相同濃度，按照“1.2.2”“1.2.5”和“1.2.6”方法分別測定并計(jì)算純化前后總酚含量、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的變化。通過圖1藍(lán)莓葉粗提物經(jīng)純化后的總酚含量可知純化后藍(lán)莓葉多酚純度為36%，較純化前提高了44.00%，α-淀粉酶抑制率提高了138.70%，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了12.42%。純化前后對(duì)α-淀粉酶抑制和α-葡萄糖苷酶活性提升極顯著(P< 0.01)，同等濃度下藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率高于α-淀粉酶。接下來的實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)純化后藍(lán)莓葉多酚，對(duì)其成分、溫度和pH的穩(wěn)定性、半抑制濃度IC50值及其抑制類型進(jìn)行探究。

圖1 藍(lán)莓葉多酚純化前后總酚含量和抑制活性的變化

2.2 藍(lán)莓葉純化后的多酚物質(zhì)鑒定分析

從表3 LC-MS分析結(jié)果可以看出藍(lán)莓葉提取物中多酚主要有綠原酸、5,6,7,3′,4′-五氫化二異黃酮、槲皮素、原花青素、3′-羥基染料木素、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷、1,5-二阿魏酰奎寧酸等11種多酚物質(zhì)，其中綠原酸含量最高。有研究表明，綠原酸是藍(lán)莓葉中含量最高的酚類物質(zhì)[18]，其中綠原酸、阿魏酸、槲皮素、原花青素等，已被證明具有較強(qiáng)的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性[19]。由“2.1”結(jié)果可知藍(lán)莓葉多酚提取物中總酚含量與對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性成正相關(guān)。結(jié)果表明，藍(lán)莓葉提取物中多酚類化合物是其抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

表3 藍(lán)莓葉提取物成分分析結(jié)果

2.3 藍(lán)莓葉多酚對(duì)溫度的穩(wěn)定性研究

由圖2可知溫度對(duì)藍(lán)莓葉多酚抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影響趨勢大致相同。當(dāng)溫度在30 ℃和40 ℃時(shí)，藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶的抑制率無顯著性差異(P> 0.05)；40 ℃之后隨溫度升高，抑制率呈緩慢下降趨勢，80 ℃作用30 min，抑制劑活性較40 ℃失去了19.38%；90 ℃作用30 min后，藍(lán)莓葉多酚完全失活。溫度在30～80 ℃時(shí)，藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率呈下降趨勢；當(dāng)溫度在80 ℃時(shí)，相比30 ℃抑制率失去了14.75%；90 ℃作用30 min后，藍(lán)莓葉多酚幾乎完全失活。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明提取物中有效活性成分容易受高溫影響發(fā)生氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致抑制率下降。

圖2 溫度對(duì)藍(lán)莓葉多酚抑制活性的影響

藍(lán)莓葉多酚對(duì)酶的抑制活性受溫度影響較小。在37 ℃具有較高的抑制活性，說明其在人體內(nèi)能夠保持良好的效果；但當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性明顯降低。在產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用中應(yīng)注意加工溫度對(duì)其活性成分的影響，不宜高溫。

2.4 藍(lán)莓葉多酚對(duì)pH的穩(wěn)定性研究

由圖3可知藍(lán)莓葉多酚經(jīng)pH 2.0～8.0環(huán)境處理后能夠保持其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性，抑制率都超過了90%。當(dāng)pH > 8.0時(shí)抑制率呈緩慢下降趨勢，當(dāng)pH為12.0時(shí)抑制率驟降至46.50%，說明藍(lán)莓葉多酚經(jīng)過堿性條件處理后對(duì)α-淀粉酶抑制活性影響較大。藍(lán)莓葉多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性受pH的影響較大，pH 2.0～5.0呈上升趨勢，pH 5.0時(shí)，抑制率最大，達(dá)到73.06%。在pH 5.0之后，隨著pH升高，α-葡萄糖苷酶抑制率逐漸降低。pH 7.0～8.0抑制率較pH 7.0驟降了45.49%，pH 8.0～11.0趨于穩(wěn)定，pH 12.0時(shí)完全失去抑制活性。藍(lán)莓葉多酚經(jīng)pH 3.0～5.0處理后，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性比較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸和堿性條件下不穩(wěn)定。

圖3 pH對(duì)藍(lán)莓葉多酚抑制活性的影響

綜上所述，藍(lán)莓葉多酚在偏酸性條件下比較穩(wěn)定，能夠保持較高的抑制活性。而人體胃酸pH低于2，腸道pH在7.5左右[20]，說明藍(lán)莓葉多酚添加到食物中，在胃腸道消化環(huán)境下，仍能保持其抑制活性。在產(chǎn)品的開發(fā)研究中，將藍(lán)莓葉多酚添加至酸性食品中，能夠最大程度保持其功能活性。

2.5 藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究

由圖4可以看出隨著藍(lán)莓葉多酚和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨濃度增大而增大，且無限趨于100%，這表明藍(lán)莓葉多酚和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用與其活性成分含量有關(guān)。對(duì)其添加濃度(X)與抑制率(Y)之間的關(guān)系建立線性回歸方程，并計(jì)算IC50值(見表4)。藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶的IC50值(10.926 μg/mL)大于α-葡萄糖苷酶的IC50值(7.276 μg/mL)，表明藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到50%所需濃度低于對(duì)同等酶活下的α-淀粉酶抑制率達(dá)到50%所需濃度，即在此范圍內(nèi)，藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于同等濃度的α-淀粉酶的抑制活性。

表4 藍(lán)莓葉多酚和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用(IC50)比較

圖4 藍(lán)莓葉多酚和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制作用

阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值低于藍(lán)莓葉多酚的，可知藍(lán)莓葉多酚抑制效果不及阿卡波糖，這可能與藍(lán)莓葉多酚提取純度不高有關(guān)。由“2.1”結(jié)果可知，純化后藍(lán)莓葉多酚純度為36%，遠(yuǎn)低于阿卡波糖純度(98%)。本文采用的純化方法只粗略除去了水溶性雜質(zhì)，而洗脫劑的選擇、吸附流速、樣品液濃度、洗脫流速等因素對(duì)純化效果有一定的影響。為提高藍(lán)莓葉多酚的體外降血糖活性，還需進(jìn)一步優(yōu)化純化條件和方法。阿卡波糖應(yīng)用于臨床，患者服用此藥物會(huì)有類似腹脹、腹瀉的情況[9]。而從藍(lán)莓葉中提取的多酚是一種天然植物活性物質(zhì)，用于降血糖食品藥品研發(fā)更具安全性。

2.6 藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制類型

最后通過紫外光譜法研究了藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)，探究藍(lán)莓葉多酚濃度、酶濃度與酶解速率之間的關(guān)系，判斷抑制作用是否可逆。如圖5A和5D所示，所有直線都基本過原點(diǎn)。隨著藍(lán)莓葉多酚濃度增加，直線斜率逐漸下降，說明藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用是可逆性的[21]。

為確定藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的可逆抑制類型，按照Lineweaver-Burk和Dixon雙倒數(shù)曲線作圖法，探究藍(lán)莓葉多酚濃度、底物濃度與酶解速率之間的關(guān)系，確定抑制類型和抑制常數(shù)。由圖5B、5C、5E和5F可知，反應(yīng)體系中隨著抑制劑濃度降低，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的酶解反應(yīng)速率明顯升高。隨著底物濃度的增加，酶解反應(yīng)速率也在增加，并逐漸接近最大反應(yīng)速率Vmax。這一結(jié)果說明藍(lán)莓葉多酚能夠競爭底物，優(yōu)先與酶相結(jié)合形成復(fù)合物，從而使酶失活[22]。通過Lineweaver-Burk圖監(jiān)測米氏常數(shù)Km和最大酶解速率Vmax值的變化，斜率為Km和Vmax的比值，y軸截距為1/Vmax值，直線斜率隨藍(lán)莓葉多酚濃度增大而增大。通過Dixon圖可以看出隨著藍(lán)莓葉多酚濃度增大，x軸截距減小，y軸截距增大，即Vmax值減小，Km增大。不同濃度多酚直線分別相交于第二象限和第三象限的一點(diǎn)，交點(diǎn)接近y軸，這種特征符合混合型抑制，藍(lán)莓葉多酚屬于混合型抑制劑。隨著抑制劑濃度增加，由于α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶被抑制改變了Vmax和Km值，表明藍(lán)莓葉多酚對(duì)酶具有完整且單一的抑制位點(diǎn)或單一類別的抑制位點(diǎn)[23]，從而更容易與酶結(jié)合改變酶的活性中心構(gòu)象，抑制α-淀粉酶與淀粉生成葡萄糖，α-葡萄糖苷酶與對(duì)硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)生成葡萄糖和對(duì)硝基苯酚(pNP)。這與阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果是相同的[24]。根據(jù)Zhang[25]中所述，Lineweaver-Burk圖中交點(diǎn)橫坐標(biāo)絕對(duì)值為競爭性抑制常數(shù)Kic值，而Dixon圖中交點(diǎn)橫坐標(biāo)絕對(duì)值為非競爭性抑制常數(shù)Kiu。通過計(jì)算得出藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶的Kic為1.041 5 mg/mL，Kiu為0.150 4 mg/mL。對(duì)α-葡萄糖苷酶的Kic為0.222 9 mg/mL，Kiu為0.004 1 mg/mL。其競爭性常數(shù)>非競爭性常數(shù)，說明藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶都是競爭性大于非競爭性的混合可逆性抑制類型。而Kic和Kiu值越低，1/Kic和1/Kiu值越高，表明抑制劑與酶的結(jié)合越強(qiáng)。α-淀粉酶的Kic和Kiu值比α-葡萄糖苷酶的高，則說明藍(lán)莓葉多酚與α-葡萄糖苷酶結(jié)合力比α-淀粉酶結(jié)合力強(qiáng)。

圖5 藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制動(dòng)力學(xué)

3 結(jié)論

本文研究的藍(lán)莓葉多酚提取物中主要成分有綠原酸、5,6,7,3′,4′-五氫化二異黃酮、槲皮素、原花青素等。體外降血糖活性評(píng)價(jià)顯示，藍(lán)莓葉多酚具有較好的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用，且抑制活性與總酚含量成正相關(guān)。通過探究溫度和pH對(duì)藍(lán)莓葉多酚抑制活性的影響，可知藍(lán)莓葉多酚在低溫(30～50 ℃)和偏酸性(pH 2.0～8.0和3.0～5.0)環(huán)境下比較穩(wěn)定，能夠保持較高的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。藍(lán)莓葉多酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50分別為10.926和7.276 μg/mL，此外動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其對(duì)兩個(gè)酶的抑制類型均為競爭性大于非競爭性的混合性可逆抑制。

綜上所述，藍(lán)莓葉中多酚含量豐富，具有較好的體外α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用，揭示了藍(lán)莓葉多酚具有潛在的降血糖作用，為藍(lán)莓葉相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。