1例染色體結(jié)構(gòu)變異無精癥患者的納米孔測序臨床應(yīng)用*

王亞，黃明濤，劉安，周冉，張沁欣，胡平，許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)國家重點試驗室，南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京 210001)

結(jié)構(gòu)變異(structure variants，SVs)是一種大于等于50 bp的基因組重排的統(tǒng)稱[1]，包括：缺失(deletion, DEL)、重復(fù)(duplication, DUP)、插入(insertion, INS)、倒位(inversion, INV)、易位(translocation, TRA)等[2]。由于二代測序技術(shù)受到讀長較短、PCR擴增偏好性等影響，使得目前學(xué)界對復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異的研究較少，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變異與疾病之間的相關(guān)性不明確[3]。伴隨著第三代測序技術(shù)的發(fā)展，牛津納米孔測序技術(shù)(oxford nanopore technology, ONT)和PacBio單分子測序技術(shù)(single molecule real time, SMRT)的出現(xiàn)[4]，使得人們認(rèn)識到結(jié)構(gòu)變異與神經(jīng)發(fā)育障礙[5-6]、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[7]以及男性不育[8]等疾病密切相關(guān)，其中約10.3%的低生育能力男性中染色體存在異常[9]。但因二者檢測和分析難度較高，尚不能完全進入臨床應(yīng)用階段。因此，建立完善的納米孔測序試驗和生物信息分析流程，篩選致病性結(jié)構(gòu)變異，是將納米孔測序技術(shù)由基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)為臨床檢測的重要過程。一項405例中國人口的結(jié)構(gòu)變異與其表型、疾病和群體的關(guān)系的研究率先闡明了結(jié)構(gòu)變異在我國人群基因組不同位置的分布特點和人群特征[3]，該研究對臨床上篩選結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致的疾病提供了巨大的幫助。本研究擬對比納米孔測序與染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)2種檢測方法，分析1例復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的非梗阻性無精癥病例，評價納米孔測序在復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異檢測的臨床應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來源 收集2019年3月于南京市婦幼保健院診斷為染色體平衡易位的非梗阻性無精癥患者外周血標(biāo)本1例(南京市婦幼保健院科研倫理委員會批準(zhǔn)文號：[2019] KY-081)。該男性患者年齡27歲，婚后正常性生活3年不育，查體排除其他基礎(chǔ)疾病，Y染色體微缺失檢查結(jié)果正常，精液和睪丸穿刺液中未檢出生殖細(xì)胞。

1.2主要儀器和試劑 人類外周血提取試劑盒(Cat#13323，德國凱杰公司)，納米孔測序系統(tǒng)及配套的建庫測序試劑盒(SQK-LSK109，英國納米孔測序公司)。微量分光光度計(Nanodrop 2000，美國賽默飛公司)，熒光定量儀(Qubit 3.0，美國Invitrogen公司)，染色體微陣列芯片掃描儀Affymetrix GeneChip system 3000、染色體微陣列芯片CytoScan HD(美國昂飛公司)，自動化DNA片段回收系統(tǒng)(BluePippin system，美國Sage Science公司)，高通量測序儀(PromethION，英國ONT公司)。

1.3染色體微陣列試驗 取該患者300 μL外周血提取DNA，根據(jù)染色體微陣列試驗流程(美國昂飛公司)進行試驗，主要包括基因組DNA的消化、連接和PCR，對PCR產(chǎn)物純化后進行片段化，隨后進行標(biāo)記和雜交，最后進行洗脫、染色和掃描。染色體微陣列使用CytoScan HD芯片。使用Chromosome_Analysis_Suite_4.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.4納米孔測序試驗 取2 mL外周血，提取約2 μg DNA(A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0，A260 nm/A230 nm值為2.0～2.2)。通過BluePippin自動化DNA片段回收系統(tǒng)篩選≥15 kb的DNA片段，純化后根據(jù)納米孔測序系統(tǒng)及配套的建庫測序試劑盒說明書完成建庫和上機測序過程，期間清洗1次測序芯片，獲得更大的數(shù)據(jù)量。

1.5數(shù)據(jù)分析 測序時，通過Guppy(4.5.3)將FASTA5數(shù)據(jù)實時轉(zhuǎn)換成FASTQ數(shù)據(jù)，隨后以GRCh37人類參考基因組為參考序列，通過Minimap2(2.17)軟件對FASTQ數(shù)據(jù)進行序列比對。使用Sniffles[10](1.0.12)、Nanovar[11](1.3.2)、cuteSV[12](1.010)3種軟件分別對上述數(shù)據(jù)進行結(jié)構(gòu)變異查找，包括：缺失(DEL)、插入(INS)、重復(fù)(DUP)、倒位(INV)、易位(TRA)，匯總后使用AnnotSV(2.2)對結(jié)構(gòu)變異進行注釋。

1.6PCR鑒定 根據(jù)納米孔測序所得結(jié)構(gòu)變異位置,使用primer3web(https://primer3.ut.ee/)軟件設(shè)計引物，通過PCR擴增結(jié)構(gòu)變異區(qū)域并進行Sanger測序,確定斷裂段堿基序列信息，驗證納米孔測序發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)變異的準(zhǔn)確性。引物見表1。

表1 Sanger測序引物

2 結(jié)果

2.1患者臨床信息 患者排除囊性纖維癥CFTR基因突變、生殖內(nèi)分泌異常(雄激素不敏感等)、抗精子抗體陽性、睪丸發(fā)育異常(隱睪、先天性無睪癥)、雙側(cè)睪丸炎、雙側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)、雙側(cè)精索靜脈曲張、腫瘤、藥物或毒素、創(chuàng)傷及環(huán)境危害等因素，Y染色體AZF a、b、c區(qū)域結(jié)果均正常，后經(jīng)外周血染色體G顯帶核型分析發(fā)現(xiàn)該患者核型為46,XY,t(1;3)(q21;q27)，屬于染色體結(jié)構(gòu)變異(圖1)，但該結(jié)構(gòu)變異的致病性尚未可知。

注：紅色箭頭所示為發(fā)生平衡易位的2條染色體。

2.2染色體微陣列結(jié)果 按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會指南(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)，染色體微陣列分析發(fā)現(xiàn)9個臨床意義不明的染色體拷貝數(shù)變異(VOUS)，3個純合子狀態(tài)區(qū)段 (regions of homozygosity, ROH，表2)以及15q15.3區(qū)段缺失(圖2)，內(nèi)含PPIP5K1、CKMT1B、STRC、CATSPER2共計4個OMIM基因，可能與隱性遺傳方式的15q15.3缺失引起的STRC相關(guān)聽力障礙有關(guān)[13]，此患者為攜帶者。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)庫比對：(1)根據(jù)ACMG判讀，以上拷貝數(shù)變異被判定為VOUS；(2)15q15.3區(qū)段126 kb缺失影響的3個基因(PPIP5K1、CKMT1B、STRC)在OMIM數(shù)據(jù)庫中無精子發(fā)生相關(guān)報道，CATSPER2在精子運動中起著至關(guān)重要的作用，該基因的缺失會引起嚴(yán)重的弱畸形精子癥[14-15]，但在本病例中為雜合性缺失并不致病。

表2 染色體微陣列分析結(jié)果

注：Weighted Log2 Ratio，Log2比率加權(quán)值；Copy Number State，拷貝數(shù)狀態(tài)；LOH(segments)，雜合性缺失；Allele Difference，等位基因差異；BAF，B等位基因頻率。

2.3納米孔測序結(jié)果 下機數(shù)據(jù)通過NanoPlot質(zhì)量控制后，平均讀長為18 259.8 bp，平均測序質(zhì)量為13.4，N50長度為24 816.0 bp。本研究中Sniffles、NanoVar和CuteSV 3種工具均鑒定出的12 053個結(jié)構(gòu)變異為高可信度變異(圖3A)，其中缺失6 260個、插入5 624個、重復(fù)115個、倒位22個、易位32個(圖3B)。此外，通過AnnotSV對測序結(jié)果進行注釋，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異在基因組中的分布如下：UTR區(qū)782個，Exon區(qū)3 796個，Intron區(qū)957個，其他區(qū)域24個，影響2 406個基因。與染色體核型結(jié)果相比，納米孔測序精確定位了該結(jié)構(gòu)變異的斷裂點位置分別位于chr1:156329779-156333071和chr3:191595575。根據(jù)斷裂端人為將1號染色體分為A、B、C、D 4個區(qū)域，3號染色體分為E、F 2個區(qū)域(圖3C)。結(jié)果顯示，在1號染色體B區(qū)缺失3 198 bp(圖3D)，C區(qū)與A區(qū)拼接。因此，通過對序列分析，針對2個斷裂區(qū)域設(shè)計引物進行PCR擴增并Sanger測序，結(jié)果確認(rèn)1號染色體長臂存在3 198 bp缺失，最終形成新的1號衍生染色體。3號染色體斷裂段與1號染色體D區(qū)拼接后，形成新的3號衍生染色體(圖3C、3E)。綜上，將該不育男性患者復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)變異更加精準(zhǔn)地描述為：Seq[GRCh37]t(1;3)(q21;q27)g.[chr1:pter_cen_156329779:cher1:156332977-156333069:chr3:191595582_qter]g.[chr3:pter_cen_191595574:chr1:156333071_qter]。

注：A，3種結(jié)構(gòu)變異分析軟件韋恩圖；B，取交集后結(jié)構(gòu)變異不同類型占比；C，染色體復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異地鐵模式圖；D，IGV發(fā)現(xiàn)1號染色體存在3 198 bp缺失；E，平衡易位斷裂點Sanger測序峰形圖。

3 討論

CMA是近些年臨床常用的高分辨率全基因組檢測技術(shù)，對于多數(shù)染色體的拷貝數(shù)變異、微缺失和重復(fù)的檢出能力較強[16]。在拷貝數(shù)變異和大片段缺失的情況下建議使用CMA檢測，而在本病例中發(fā)現(xiàn)15q15.3區(qū)段缺失，其中就包括新發(fā)現(xiàn)的STRC聽力障礙雜合缺失。但鑒于探針數(shù)目和分布的限制，該方法并沒有檢出1號染色體3 198 bp缺失，因此，該方法結(jié)果為陰性并不能排除在無探針區(qū)域的染色體異常，需用其他檢測手段彌補。

筆者通過對1例非梗阻性無精癥外周血染色體G顯帶核型分析、CMA和納米孔測序等技術(shù)分析后證實，納米孔測序技術(shù)驗證了CMA發(fā)現(xiàn)的15q15.3區(qū)段缺失片段大小為126 kb，包括PPIP5K1、CKMT1B、STRC和CATSPER2基因；明確了染色體核型為46,XY,t(1;3)(q22;q28)，并進一步明確斷裂點處的精確位置和影響基因，包括TSACC、RHBG和FGF12；此外，在平衡易位中還發(fā)現(xiàn)了1號染色體存在3 198 bp缺失以及5 559個能夠被注釋的結(jié)構(gòu)變異。以上結(jié)果提示，基于納米孔測序鑒定出的結(jié)構(gòu)變異影響的基因可能成為明確該名非梗阻性無精癥患者致病原因的重要補充手段，但基于目前的數(shù)據(jù)分析能力和對結(jié)構(gòu)變異的解讀能力，筆者沒能找到該男性不育的致病基因。

通常在染色體G顯帶結(jié)果提示受檢者染色體存在結(jié)構(gòu)變異，而CMA結(jié)果無法解釋致病原因的情況下，納米孔測序在重構(gòu)復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的染色體，尋找斷裂點及其影響的基因等方面具有明顯優(yōu)勢，我國人群[3]以及國外人群[1]的結(jié)構(gòu)變異數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立，但是對于納米孔測序技術(shù)得到的一萬多個結(jié)構(gòu)變異的解讀仍然存在很大的困難。隨著Cas9介導(dǎo)的目標(biāo)片段富集技術(shù)和Read Until程序算法的不斷發(fā)展，使得目標(biāo)區(qū)域靶向測序成為可能，而這項技術(shù)的發(fā)展將為人群遺傳疾病的精準(zhǔn)檢測奠定基礎(chǔ)。相信在不久的將來，隨著納米孔測序準(zhǔn)確度和深度的提升，人類基因組目標(biāo)區(qū)域定制測序的時代即將到來。