循環(huán)circRNA作為肺癌液體活檢標(biāo)志物的研究進展*

趙婷，徐秋月，李婭，段勇

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，昆明 650032)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，在2020年全球肺癌新發(fā)病例約占所有新發(fā)癌癥病例的11.4%，相關(guān)死亡病例占癌癥死亡病例的18%[1]。目前，在肺癌診療過程中常用的癌胚抗原(CEA)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCCA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)等經(jīng)典的血清標(biāo)志物普遍存在敏感性和特異性不高等問題。為更好地滿足臨床需求，亟需尋找更具靈敏度和特異性的新型液體活檢標(biāo)志物，以彌補現(xiàn)有診療指標(biāo)的不足，改善肺癌患者的臨床診療效果。

液體活檢主要通過分析各類體液中腫瘤來源的蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞、外泌體和血小板等，客觀、實時、無創(chuàng)地監(jiān)測腫瘤信息。研究表明，環(huán)狀RNA(circRNA)有望成為腫瘤液體活檢的有力工具，例如circRNA通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和侵襲等生理病理過程，參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；circRNA能穩(wěn)定存在于外周循環(huán)、腦脊液、尿液等體液(包含外泌體)中，且在不同的生理和病理狀況下均可檢測到特定circRNA的表達(dá)水平發(fā)生改變，某種程度上可以反映機體的生理病理狀態(tài)[2]。circRNA不僅在外泌體中富集并穩(wěn)定存在，且有助于形成腫瘤微環(huán)境[3]。循環(huán)circRNA在作為肺癌診斷、病情進展、療效監(jiān)測標(biāo)志物及潛在的治療靶點方面受到越來越多的關(guān)注，通過廣泛且深入的研究有望篩選出具臨床轉(zhuǎn)化潛能的循環(huán)circRNA。

1 circRNA的生物學(xué)作用

1976年，Sanger等[4]首次發(fā)現(xiàn)circRNA時，認(rèn)為其只是錯誤剪接的副產(chǎn)物，沒有任何有價值的生物學(xué)功能。直至2013年，有學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)，circRNA具有microRNA海綿的作用[5]。目前研究[6-7]表明，circRNA主要通過以下4種方式在腫瘤的形成和病情進展中發(fā)揮作用：(1)microRNA海綿：許多circRNAs含有1個或多個miRNA反應(yīng)元件(MREs)，充當(dāng)microRNA海綿阻止microRNA與目標(biāo)mRNA結(jié)合,從而發(fā)揮內(nèi)源競爭RNA(ceRNA)作用；(2)蛋白質(zhì)海綿：部分circRNAs能夠與RNA結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而阻止circRNA與目標(biāo)mRNA的結(jié)合；或者，通過circRNA與RBP之間的相互調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能，如circMbl與肌肉盲蛋白(MBL)等；(3)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用：內(nèi)含子circRNA(ciRNA)和外顯子-內(nèi)含子RNA(EIciRNA)主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)；(4)翻譯功能：少數(shù)circRNAs可通過內(nèi)部核糖體位點(IRES)介導(dǎo)、N6-甲基腺苷(m6A)介導(dǎo)或豐富的開放閱讀框(ORFs)3種方式，參與或促進蛋白質(zhì)翻譯的有效啟動。

2 circRNA作為液體活檢標(biāo)志物的優(yōu)勢

circRNA是一類由前體RNA反向剪接形成的具有獨特共價閉合結(jié)構(gòu)的環(huán)狀RNA分子，在真核生物和病毒中廣泛表達(dá)[8]。相比于線性RNA，circRNA缺少5′帽結(jié)構(gòu)和3′A尾，對外切核糖核酸酶(Rnase R)具有高度抗性，不僅能夠更穩(wěn)定地存在于各種組織和細(xì)胞中，還能在外周循環(huán)、尿液、唾液、腦脊液等體液中富集并穩(wěn)定存在[9]。circRNA表達(dá)具有高穩(wěn)定性、組織/細(xì)胞特異性和廣泛表達(dá)等優(yōu)勢，是腫瘤新型液體活檢的理想候選標(biāo)志物[10]。此外，由于循環(huán)外周血的微創(chuàng)采集模式和易獲性，現(xiàn)已成為液體活檢的主要體液之一[11]。越來越多的研究也表明，循環(huán)circRNA在肺癌的早期診斷、病情監(jiān)測等方面具有重要意義，其還可能成為肺癌的潛在治療靶標(biāo)[12-14]。

3 循環(huán)circRNA的定量檢測方法

目前，PCR是生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于circRNA定量分析的常規(guī)和經(jīng)典的檢測方法，包括實時熒光定量PCR(RT-qPCR)、數(shù)字PCR(ddPCR)、滾環(huán)擴增(RCA)[15-16]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)[17]和基于DNA探針連接的PCR[18]等。其中，RT-qPCR是對目標(biāo)circRNA進行相對定量分析的常用方法，也是驗證RNA-seq高通量結(jié)果的重要方法[19]。但RT-qPCR分析存在靈敏度較低的局限性。ddPCR通過“分而治之”的原理，結(jié)合泊松分布可實現(xiàn)對低豐度目標(biāo)RNA的絕對定量分析，這對于循環(huán)circRNA的絕對定量檢測特別有價值。Jiao等[16]基于RCA方法開發(fā)了一種使用雙功能磁珠直接捕獲目標(biāo)circRNA-miRNA復(fù)合物(CMRRI)以及信號放大的生物傳感系統(tǒng)，可直接檢測生物樣品中的CMRRI，但不適用于低表達(dá)的circRNA。莖環(huán)引物誘導(dǎo)的LAMP可精準(zhǔn)識別circRNA連接序列，并成功地應(yīng)用于各種均相溶液中，可靈敏且特異地檢測目標(biāo)circRNA[17]。此外，基于DNA探針連接的PCR法通過在circRNA的連接位點使用splintR連接酶準(zhǔn)確連接2個DNA探針，從而實現(xiàn)對circRNA的精準(zhǔn)識別和定量檢測[18-19]。

4 循環(huán)circRNA作為肺癌液體活檢標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀

循環(huán)circRNA不僅可以用于疾病的早期診斷，還能夠反映疾病的動態(tài)發(fā)展情況和治療效果，且有潛力成為有效的治療靶標(biāo)。表1列出了近年來具有較大臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化潛能的循環(huán)circRNAs，檢測樣本主要來自血漿和血清。

表1 肺癌相關(guān)的循環(huán)circRNAs

4.1循環(huán)circRNA有潛力成為肺癌的診斷標(biāo)志物 已有研究揭示了circRNA作為肺癌液體活檢診斷標(biāo)志物的可能性。Liu等[20]對61例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者血漿hsa_circ_0046264的表達(dá)水平進行檢測分析，結(jié)果證實血漿hsa_circ_0046264對NSCLC的診斷均具有潛在的臨床價值(AUCROC=0.915，敏感性、特異性分別為0.927、0.957)；此外，其還可能成為肺癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點。該研究結(jié)果還顯示，血漿circRNAs的聯(lián)合檢測可在一定程度上提高診斷效能。hsa_circ_005962與hsa_circ_0086414的聯(lián)合應(yīng)用不僅可用于診斷肺腺癌(LUAD)(AUCROC=0.81，敏感性、特異性分別為77.80%、72.22%)，還能區(qū)分TNM早期階段的LUAD患者和健康個體(AUCROC=0.83)[21]。circRNA 除具有較高的早期診斷價值之外，還有潛在的鑒別診斷價值。hsa_circ_0047921可將NSCLC病例與慢阻肺疾病區(qū)分開(AUCROC=0.890)，hsa_circ_0056285聯(lián)合hsa_circ_0007761可區(qū)分NSCLC病例與結(jié)核病例(AUCROC=0.820)；此外，hsa_circ_0047921、hsa_circ_0056285和hsa_circ_0007761三者聯(lián)合檢測在診斷早期NSCLC病例與健康對照時也具有重要的意義(AUCROC=0.919)[22]。在一項60例肺腺癌和58例健康受試者的隊列研究中，單因素和多因素生存分析結(jié)果顯示，血漿hsa_circ_0001715除具有較高的診斷價值外(AUCROC=0.871)，還可能是肺腺癌患者總生存期(OS)的獨立預(yù)后因子[23]。

外泌體circRNA也是一種潛在的無創(chuàng)性腫瘤診斷工具。Wang等[24]使用高通量測序分析了6對肺鱗癌(LUSC)患者和健康對照者的血漿外泌體circRNA表達(dá)譜，共鑒定出252個差異表達(dá)的外泌體circRNAs，其中，上調(diào)的外泌體hsa_circ_0014235和hsa_circ_0025880顯示出潛在的診斷價值(AUCROC分別為0.825、0.800)。在LUAD中表達(dá)上調(diào)的血漿外泌體hsa_circRNA_002178對LUAD的早期診斷具有顯著的有效性(AUCROC=0.997)[25]。未來有必要進行更多的前瞻性研究及大隊列研究，以探索循環(huán)circRNA作為肺癌診斷標(biāo)志物的更多可能性。

4.2循環(huán)circRNA有潛力成為肺癌的療效監(jiān)測標(biāo)志物 多項研究通過比較放化療敏感和耐藥患者血漿或血清中差異表達(dá)的circRNAs，證實循環(huán)circRNA與腫瘤細(xì)胞耐藥性關(guān)系密切，這對于指導(dǎo)臨床治療具有重大意義。circRNA微陣列分析顯示，吉非替尼治療有效組和無效組間共存在1 377個差異表達(dá)circRNAs，進一步通過RT-qPCR在獨立的驗證集中證實hsa_circ_0109320是NSCLC患者表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)療效預(yù)測的潛在指標(biāo)[26]。Liu等[21]通過比較肺癌患者術(shù)前和術(shù)后7 d血漿hsa_circ_0005962和hsa_circ_0086414的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)血漿hsa_circ_0005962在LUAD術(shù)前及術(shù)后患者之間有明顯差異，并進一步通過生信分析和體外實驗證實，hsa_circ_0005962是評估手術(shù)治療效果的潛在標(biāo)志物。此外，病情進展的實時監(jiān)測對于改善肺癌患者治療效果尤其重要。Luo等[27]篩選了231例肺癌患者和41例健康人對照的circRNA表達(dá)譜，并對hsa_circ_0000190的表達(dá)水平進行臨床驗證，結(jié)果表明hsa_circ_0000190可提示晚期肺癌的腫瘤進展和對免疫治療的不良反應(yīng)。

外泌體circRNA在療效監(jiān)測方面也顯現(xiàn)出重要價值。Fang等[28]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清來源的外泌體CircARHGAP10通過miR-638/FAM83F軸抑制了NSCLC的進展，表明外泌體CircARHGAP10是實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測疾病進程的潛在有效標(biāo)志物。一項關(guān)于hsa_circ_0056616的研究表明，在肺腺癌患者血漿中高表達(dá)的外泌體hsa_circRNA_0056616可能是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測的有效生物標(biāo)志物[29]。通過全面理解circRNA并挖掘其作為肺癌療效檢測標(biāo)志物的臨床價值，可有效篩選出具有臨床應(yīng)用潛能的循環(huán)circRNA標(biāo)志物。

4.3循環(huán)circRNA有潛力成為肺癌的治療靶標(biāo) 研究表明，循環(huán)circRNA亦具備作為腫瘤新型治療靶標(biāo)的潛能。Shi等[30]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0008928敲減可提高NSCLC細(xì)胞對順鉑(CDDP)的敏感性，為NSCLC的CDDP耐藥療法提供了新的依據(jù)。一項包含28例奧西替尼耐藥和32例敏感的NSCLC患者隊列研究結(jié)果表明，hsa_circ_0002130通過靶向miR-498調(diào)節(jié)糖酵解進而逆轉(zhuǎn)耐藥的發(fā)生，在體內(nèi)和體外均抑制了NSCLC患者對奧西替尼的耐藥性，這可能是改善肺癌患者臨床治療的理想措施[31]。多項研究表明，hsa_circ_102481、CircCDYL和CircPIP5K1A也可能是肺癌靶向治療的新型靶點[12-14]。

5 總結(jié)與展望

隨著對circRNA的獨特分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究的深入，表明循環(huán)circRNA有潛力成為肺癌液體活檢中具有臨床應(yīng)用價值的診斷、病情監(jiān)測標(biāo)志物和治療靶點。然而，目前液體活檢circRNA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究和臨床轉(zhuǎn)化方面依然面臨巨大的挑戰(zhàn)和困難：(1)circRNA的命名規(guī)則尚未統(tǒng)一，在很大程度上阻礙了整個研究領(lǐng)域的快速發(fā)展；(2)循環(huán)RNA抽提技術(shù)和富集方法的有效性均有待突破；(3)目前的研究大多集中于基礎(chǔ)研究，需廣泛的臨床研究證實circRNA用于腫瘤診療標(biāo)志物的可行性；(4)各研究之間缺乏可比性和一致性，需建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制體系；(5)circRNA通過何種方式擴散入外泌體中以及外泌體circRNA豐度的調(diào)節(jié)機制均有待研究。未來迫切需要加快循環(huán)circRNA富集方法、標(biāo)準(zhǔn)品的研發(fā)和改進，通過開展科學(xué)、創(chuàng)新的基礎(chǔ)研究和系統(tǒng)、全面的真實世界隊列研究，爭取早日實現(xiàn)肺癌循環(huán)circRNA檢測體系的持續(xù)改進和臨床轉(zhuǎn)化。