人參立枯病拮抗菌株鑒定及其生防促生效果

張?zhí)祆o孫文松李 玲劉 瑩劉 坤沈?qū)氂?/p>

(遼寧省經(jīng)濟作物研究所/遼寧省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所,遼寧 遼陽 111000)

人參(Panaxginseng)為五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)多年生草本植物[1]。根及根莖可入藥,含人參皂苷Rg1(C42H72O14)、人參皂苷Re(C48H82O18)和人參皂苷Rb1(C54H92O23),具有大補元氣,復脈固脫,補脾益肺,生津養(yǎng)血,安神益智之功效[2],被稱為“百草之王”,我國人參主要分布在吉林、遼寧及黑龍江省,占全國85%以上[3]。

人參是一種在同一個地方生長緩慢的宿根植物,面臨著一系列的環(huán)境脅迫,包括細菌、真菌、線蟲侵染等。目前,國內(nèi)外記載的人參病害已有 40 多種,我國已發(fā)現(xiàn)的人參病害至少有25種以上[4],嚴重影響了人參產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。人參的主要侵染性病害有銹腐病(Cylindrocarponspp.)、根腐病(Root rot disease)、疫病(PhytophthoracactorumSchroet)、立枯病(RhizoctoniasolaniKuhn)和灰霉病(BotrytiscinereaPers)。由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKuhn) 引起的人參立枯病又稱抽死病、土掐病,易引起人參幼苗萎蔫及莖基腐爛[5],在低溫多雨的條件下,該病發(fā)展蔓延極為迅速,常年發(fā)病率為8%～32%,嚴重者可達40%[6],是人參苗期主要病害之一。目前的防治方法主要是噴灑化學試劑,但由此易導致病原菌產(chǎn)生抗藥性,土壤農(nóng)藥殘留大,土壤微生物生態(tài)失衡等一系列問題,其藥物殘留也直接威脅人類健康[7～8],嚴重影響了人參產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。通過生物防治措施可減少或抑制人參病害的發(fā)生,因其來源廣泛,對人畜安全和對環(huán)境友好而備受研究者的青睞[6]。目前,國內(nèi)外已篩選出多種各類中藥材病害的拮抗菌株,例如人參根腐病、黑斑病等病害的拮抗菌株[9～10],但人參立枯絲核菌拮抗菌株尚未見報道。本研究于2021 年在遼寧省遼陽市用常規(guī)PDA培養(yǎng)基,采用平板對峙法,以31個菌株為候選拮抗菌株,以立枯絲核菌為靶標菌篩選具有拮抗作用的菌株,應用rDNA-ITS分析結(jié)合形態(tài)學鑒定確定拮抗菌株分類地位,同時設定不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、光照和pH值條件研究該菌株的生物學特性,并對其發(fā)酵液進行防病促生盆栽試驗研究,為其生物防治和促生菌肥提供潛在的資源菌,促進人參產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

在遼寧省撫順市人參種植基地采集具有典型立枯病癥狀的病株,采用常規(guī)組織分離法對病株進行分離、純化,經(jīng)鑒定為立枯絲核菌,作為供試標靶病原菌。供試31株拮抗菌由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所提供,是從哈巴湖荒漠和新疆及騰格里沙漠等地分離出的植物內(nèi)生真菌,4 ℃斜面培養(yǎng)保存。

1.2 方法

1.2.1 拮抗真菌與立枯絲核菌平板對峙培養(yǎng)

采用四點平板對峙法測定31株生防菌對病原菌的拮抗效果,以不接拮抗菌為對照,接種后25 ℃暗培養(yǎng),3次重復,用十字交叉法測量對照組和處理組病原菌菌落直徑,計算抑菌率。

抑菌率=(對照組菌落直徑–處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑–菌餅直徑)×100%

1.2.2 拮抗菌鑒定

1.2.2.1 形態(tài)鑒定

將篩選出的拮抗效果好的純菌株接種在PDA平板上(PDA培養(yǎng)基臨用前加入適量鏈霉素以抑制細菌生長),25 ℃暗培養(yǎng)3～5 d進行觀察,按照《真菌鑒定手冊》鑒定到屬[11]。

1.2.2.2 分子生物學鑒定

采用單孢分離法對菌株進行純化,CTAB法(Saghaietal.,1984)提取基因組DNA,應用真菌通用引物ITS1和ITS4對其進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物交由北京鼎國生物工程技術(shù)公司測序。得到的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列進行比較,應用DNAStar構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,獲得最相近菌株ITS-rDNA序列作為參比菌株。

1.2.3 拮抗菌生物學特性研究

根據(jù)傅本重等方法對入選菌株進行生物學特性研究[12]。

1.2.3.1 最佳培養(yǎng)基

將菌齡一致的菌餅(直徑5 mm),分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、水瓊脂(WA)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CM)、改良馬丁氏(MA)、查氏培養(yǎng)基(CA)、麥芽浸粉培養(yǎng)基(MEA)、玉米粉培養(yǎng)基(CMM)8種供試培養(yǎng)基平板中央,3 d后開始采用十字交叉法測量菌落直徑,連續(xù)測量7 d,3次重復。

1.2.3.2 最佳碳源

以查氏培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,以不加碳源作對照,用甘露醇、蔗糖、果糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖和乳糖中等量的碳源替換蔗糖,配制成不同碳源的固體培養(yǎng)基。將菌齡一致的菌餅接種到平板中央,3次重復,測量方法及培養(yǎng)條件同上。

1.2.3.3 最佳氮源

以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,以不加氮源作對照,用尿素、硫酸銨、硝酸鉀、牛肉膏和硝酸銨中等量的氮源替換查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉,將菌齡一致的菌餅接種到平板中央,測量菌落直徑方法及培養(yǎng)條件同上。

1.2.3.4 最適溫度

設置5 ℃、14 ℃、20 ℃、27 ℃、34 ℃共5個處理,測量菌落直徑,根據(jù)菌落直徑大小分析菌株最適溫度。

致死溫度:設置50 ℃、55 ℃、60 ℃共3個處理,根據(jù)菌落是否擴展分析生防菌致死溫度。

1.2.3.5 最適酸堿度

用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將PDA培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至3、4、5、6、7、8、9、10、11、12共10個梯度,分析pH對菌株生長的影響。

1.2.3.6 光照

將菌餅接種到PDA平板中央,分別置于24 h全光照、12 h光暗交替和24 h全黑暗培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25 ℃,3次重復。

1.2.4 室外盆栽防病促生試驗

1.2.4.1 菌株發(fā)酵液的制備

將入選菌株接入葡萄糖馬鈴薯液體培養(yǎng)基中(PDB),170 r/min振蕩5 d,菌量約為108cfu/ml。

1.2.4.2 盆栽防病促生試驗

采用盆缽種植方式,供試土壤為林地土:草炭土按照2∶1混勻。供試參苗為一年生人參苗,根系消毒后進行移栽,每盆3株,3盆1組,每組3次重復。

防效作用測定:先接種立枯絲核菌菌懸液,24 h后再灌注300 ml菌株發(fā)酵液,藥劑對照組施用多菌靈可濕性粉劑500倍液,空白對照為清水。

促生作用測定:在人參苗根部灌注300 ml 396拮抗菌發(fā)酵液,對照組澆灌等量清水,放置在冷棚中常規(guī)管理。

45 d后測其株高、鮮莖、葉、根質(zhì)量等指標,而后于180 ℃烘干至恒重,測其莖葉干質(zhì)量、根干重等指標。

人參立枯病發(fā)病程度參考羅燕娜方法分為5級[13]:

0 級,健苗;

1 級,莖基、根部局部有病斑;

2 級,1/3～1/2 的莖基、根部出現(xiàn)病斑;

3 級,1/2～2/3 的莖基、根部出現(xiàn)病斑;

4 級,枯死。病情指數(shù)和防效分別按照下列公式計算[14]

病情指數(shù)=[∑(病級株數(shù)×代表值)/(總株數(shù)×最高病級代表值)]×100;

防效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理,并用DPS 2005軟件進行單因素方差分析,應用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株室內(nèi)拮抗活性

對31株菌株進行平板對峙法篩選,結(jié)果顯示菌株396對人參立枯絲核菌有拮抗效果,抑菌帶清晰,寬度為2.78±0.05 mm,抑制率為79.4%。

圖1 菌株396與供試病原菌在PDA平板對峙培養(yǎng)中的菌落擴展情況Figure 1 Colony extension of strain 396 tested pathogenic fungi on dual-culture PDA plates

2.2 拮抗真菌種類鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

菌株396在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)生長速度較快,5 d可長滿培養(yǎng)皿;菌落淺褐色,邊緣常呈不整齊波裂狀,菌絲有格、白色半透明,具二叉狀分枝。后期平板中部上方產(chǎn)生大量燒瓶形或卵形黑色子囊殼,子囊殼內(nèi)有大量圓形或近圓形棕色子囊,每個子囊內(nèi)有8個子囊孢子,子囊孢子為單胞。依據(jù)菌落和子囊殼等特征,與《真菌鑒定手冊》中相應屬進行對照,初步鑒定為球毛殼(Chaetomiumglobosum)。

2.2.2 分子鑒定

采用CTAB法(Saghaietal.,1984)提取菌株396基因組DNA,應用真菌通用引物ITS1和ITS4對其rDNA-ITS基因片段進行擴增,得到1條約600 bp的片段。將測序結(jié)果提交NCBI,在GenBank上進行Blast比對,對菌株396構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),結(jié)果表明,菌株396與Chaetomiumglobosum(MN341340、 MN592971、MN700107、MT341778、MT341778)同源性最高,聚在同一組,相似達到100%;菌株396與層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等屬中種類均不在同一組中,親緣關(guān)系較遠。從分子生物學層面證明菌株396為球毛殼。

圖2 球毛殼,a,b,子囊果;c,子囊孢子Figure 2 C. globosum, a, b, Perithecium; c, Ascospore

圖3 基于拮抗菌396 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of antagonistic fungi strain 396 based on ITS-rDNA sequence

2.3 人參立枯絲核菌拮抗真菌的生物學特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響

由表1可見不同培養(yǎng)基對菌株396菌落生長量有顯著的影響,在MA、MEA和CMM培養(yǎng)基上生長最快,10 d均長滿整個培養(yǎng)皿,與其他培養(yǎng)基相比差異顯著,在MA和MEA培養(yǎng)基上菌絲短、致密,是培養(yǎng)396良好培養(yǎng)基,在CMM培養(yǎng)基上長得快,但菌絲稀疏,不適合做396的培養(yǎng)基。在PDA培養(yǎng)基上生長較好,菌落直徑為55.97 mm,在PSA和CM培養(yǎng)基上生長明顯受到抑制,生長緩慢,菌落直徑僅為30.86 mm和31.26 mm。因此,該菌適宜的培養(yǎng)基為MA和MEA培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基對拮抗菌株396菌絲生長的影響Table 1 Effect of different culture media on mycelial growth of antagonistic fungus strain 396

2.3.2 不同氮源對菌絲生長的影響

如表2可見,不同氮源對菌株396的生長量有顯著影響,菌株396對牛肉膏和硝酸鉀利用最好,培養(yǎng)第9 d菌落長滿培養(yǎng)皿,達到75 mm;在尿素和對照的查氏培養(yǎng)基上生長較慢,菌落直徑為45.37 mm和45.68 mm,以硝酸銨為碳源的培養(yǎng)基上生長最慢。因此,硝酸鉀和牛肉膏是菌株396良好的氮源。

表2 不同氮源對拮抗菌株396菌落生長的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth of antagonistic fungi strain 396

2.3.3 不同碳源對菌絲生長的影響

如表3可見,不同碳源對菌株生長量有顯著差異,菌株396對木糖和葡萄糖利用最好,菌落長滿培養(yǎng)皿,達到75 mm;在果糖和乳糖上生長較快,菌落直徑為57～59 mm;在甘露醇和蔗糖上生長較慢,菌落直徑為43～44 mm,麥芽糖生長也很慢,僅為39.09 mm,在無糖的查氏培養(yǎng)基上生長最慢,10 d菌落直徑僅達到31.88 mm。

表3 不同碳源對拮抗菌株396菌落生長的影響Table 3 Effect of different carbon source on mycelial growth of antagonistic fungus strain 396

2.3.4 溫度對菌落生長的影響

從圖4可見,不同溫度對菌株的生長量有顯著影響,最適宜生長溫度為27 ℃,菌落直徑為54.58 mm,溫度為20 ℃時,菌落直徑可達40.91 mm,低溫5 ℃時幾乎不生長,10 d培養(yǎng)后菌落直徑僅增加1.12 mm,溫度34 ℃菌落直徑生長較緩慢,達到18.99 mm。

圖4 溫度對拮抗菌株396菌落生長的影響Figure 4 Growth of antagonistic fungus strain 396 under different temperatures

2.3.5 致死溫度

菌株經(jīng)過50 ℃、55 ℃、60 ℃水浴處理后菌絲生長緩慢,培養(yǎng)5 d后,在60 ℃水浴處理后菌絲不再生長,菌株的致死溫度為60 ℃。

2.3.6 pH值對生防真菌菌絲生長的影響

由圖5可見,菌株396在pH為5～11均能生長,pH為7～8時生長較好,菌落直徑受pH影響較大,pH為3、4和12時菌落直徑基本不增加。結(jié)果表明:該菌株最適宜pH值為7～8。

圖5 不同pH條件下菌株396的生長情況Figure 5 Growth of fungus strain 396 under different pH conditions

2.3.7 光照對菌落生長的影響

由圖6可見,菌株396對光周期不敏感,在12 h光暗交替、全光照、全黑暗條件培養(yǎng)下,菌落直徑差異不顯著。

圖6 不同光照條件下菌株396的生長情況Figure 6 Growth of strain 396 under different light conditions

2.4 拮抗菌株396對人參立枯病盆栽防效試驗結(jié)果

盆栽試驗結(jié)果表明,菌株396發(fā)酵液可以使人參立枯病病情指數(shù)降低,治療作用效果為54.74%,與農(nóng)藥組持平,表現(xiàn)出較好的防病能力。

2.5 拮抗菌株396對人參苗期生長的影響

在盆栽試驗中,菌株發(fā)酵液處理后的人參,在株高、莖葉鮮質(zhì)量、莖葉干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根長和根粗與對照相比有顯著差異。由表5、表6可見,株高與對照相比增加51.21%,莖葉鮮質(zhì)量與對照相比增加115.02%,莖葉干質(zhì)量增加47.37%,根鮮質(zhì)量與對照相比增加28.74%,根長增加41.78%,根粗增加30.59%,根干質(zhì)量與對照相比增加不明顯。由此可見,拮抗菌株396對人參生長具有促進作用。

表4 拮抗真菌396對人參立枯病防效試驗結(jié)果Table 4 Control effect of antagonistic fungus strain 396 on Rhizoctonia solani in Panax ginseng

表5 拮抗真菌396對人參地下生物量的影響Table 5 Effect of antagonistic fungus strain 396 on underground biomass of Panax ginseng

表6 拮抗真菌396對人參地上生物量的影響Table 6 Effect of antagonistic fungus strain 396 on aboveground biomass of Panax ginseng

3 討論與結(jié)論

人參立枯病是人參苗期的主要病害之一,發(fā)生普遍且分布廣泛,近年來在非林地農(nóng)田栽參育苗床上發(fā)生率很高嚴重時可達到40%,造成參苗成片死亡,直接影響人參產(chǎn)量[15]。目前,防治仍以多菌靈等化學藥劑防治為主,但研究表明病原菌對農(nóng)藥能逐漸產(chǎn)生抗藥性,并出現(xiàn)用藥量與病害發(fā)生程度相互遞增的惡性循環(huán)[16],為降低人參農(nóng)藥殘留問題,減少化學農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境等影響,需加大對生物農(nóng)藥研發(fā)。利用豐富的微生物資源進行生物防治是未來發(fā)展趨勢。內(nèi)生菌生存在植物體內(nèi),有穩(wěn)定的生存空間,可以長期定殖于植物體內(nèi),不易受外界環(huán)境條件影響,與病原菌可以直接互作,是一類重要的生防菌資源[17]。球毛殼菌是毛殼菌中研究最早的生防菌[18],具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力[19],廣泛應用于病害的防治。1954年Martin和Moore經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)毛殼菌可使大麥、燕麥、谷物幼苗免受鐮孢屬病原菌侵染,廣泛應用于病害的防治[20]。國內(nèi)研究毛殼菌較晚,目前主要為實驗室研究階段,劉曉光等研究發(fā)現(xiàn),毛殼菌可以重寄生于立枯絲核菌和小核菌菌絲內(nèi),在顯微鏡下可觀察到病原菌菌絲被纏繞、穿透等現(xiàn)象[21]。印敬明等研究表明球毛殼ND35能夠較好定殖于番茄、黃瓜和菜豆植株內(nèi),并能較好地促進番茄生長,對黃瓜苗期猝倒病的防治效果達80.7%[22]。孫卓等從多年生人參根際土壤中篩選出一株對人參立枯絲核菌有較強拮抗能力內(nèi)生芽孢桿菌(Bacillusendophyticus) SZ-56[23]。

本研究采用平板對峙法,以立枯絲核菌為靶標菌,供試的31種菌株均為從新疆騰格里沙漠、哈巴湖荒漠野生植物中分離出的內(nèi)生真菌,從中篩選出一株對人參立枯絲核菌病原菌有較強拮抗作用的菌株396,結(jié)合形態(tài)學特征和ITS序列分析將其鑒定為球毛殼,采用單因素試驗對菌株進行生物學特性和盆栽防病促生試驗研究。初步明確了該菌株最適宜培養(yǎng)基為改良馬丁氏和麥芽浸粉培養(yǎng)基,最適宜氮源為牛肉膏和硝酸鉀,最適宜碳源為木糖和葡萄糖。適宜溫度均為27 ℃,致死溫度為60 ℃,適宜pH為7～8,對光周期不敏感,24 h光照、24 h黑暗與12 h光暗交替培養(yǎng)菌落均能正常生長。菌株發(fā)酵液對人參立枯病防治效果與500倍多菌靈持平。與清水對照相比,菌株發(fā)酵液對一年生人參苗有顯著的促生作用,其中株高與對照相比增加51.21%,莖葉鮮質(zhì)量與對照相比增加115.02%,莖葉干質(zhì)量增加47.37%,根長增加41.78%,根粗增加30.59%,這與孫卓等的研究結(jié)果一致,也展現(xiàn)出396在人參促生中有較好的應用前景[23]。本研究根干質(zhì)量增加不顯著,可能與試驗時間較短,根部干物質(zhì)積累較少有關(guān),針對這一問題,可進一步進行試驗驗證,本研究為人參立枯病生物防治和微生物菌肥的開發(fā)提供理論依據(jù)。