金銀花對變異鏈球菌UA159體外作用的實(shí)驗(yàn)研究

齲病是一種常見的口腔疾病，不僅影響口腔健康還會(huì)影響咀嚼、消化、語言等功能，甚至導(dǎo)致錯(cuò) 畸形，影響美觀

。最近的研究發(fā)現(xiàn)齲病與肥胖癥有關(guān)

。齲病的加重不僅會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，還會(huì)影響心理健康，甚至與抑郁癥有關(guān)

?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)金銀花是一種具有抗炎

、抗菌、抗腫瘤

、抗病毒

、抗氧化

、保肝

、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的藥物。臨床上，金銀花廣泛應(yīng)用于風(fēng)熱感冒、呼吸道感染、癰腫疔瘡、炎癥等。有研究發(fā)現(xiàn)金銀花對葡萄球菌、溶血性鏈球菌、傷寒桿菌、肺炎球菌等有一定的抑制作用

。金銀花制劑現(xiàn)廣泛應(yīng)用于口腔潰瘍、牙齦炎、牙周病、牙髓根尖周病，并取得良好療效，但對齲病的防治方面仍有所欠缺。變異鏈球菌為齲病的主要致齲菌，它的致齲性主要在于其具有產(chǎn)酸性、耐酸性及黏附力，有研究表明變異鏈球菌對牙面的黏附是口腔牙菌斑向致齲性菌斑轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，也是其致齲的重要物質(zhì)基礎(chǔ)

。故本研究初步探討金銀花對變異鏈球菌的抑菌效果，為齲病防治的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

變異鏈球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株UA159（簡稱UA159）由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑與儀器

腦心浸液培養(yǎng)基（brian heart infusion, BHI）、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline, PBS）、2.5%戊二醛、二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司，中國）；金銀花（海門，中國）；結(jié)晶紫及標(biāo)準(zhǔn)革蘭染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；一次性無菌接種環(huán)、EP 管、離心管（Bilogix Group，美國）；離心機(jī)（安徽中科中佳，中國）；正置顯微鏡（Olympus，日本）；掃描電子顯微鏡（FEI，美國）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱（躍進(jìn)，上海）；高壓蒸汽滅菌鍋（Panasonic，日本）。

1.3 菌株的復(fù)蘇、培養(yǎng)和鑒定

取凍存變異鏈球菌UA159 菌株，復(fù)蘇，劃線接種于BHI 瓊脂平板，37 ℃恒溫厭氧箱（80%N

、10%H

、10%CO

）培養(yǎng)24 h；BHI 液體培養(yǎng)基增菌至對數(shù)期；離心，洗滌，重復(fù)3 次，稀釋重懸，調(diào)節(jié)菌液OD

=1.0 后再稀釋100 倍作為標(biāo)準(zhǔn)菌液。

首先是數(shù)據(jù)源層，F(xiàn)LUDW的數(shù)據(jù)源來自于NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的流感病毒數(shù)據(jù)。其次是數(shù)據(jù)抽取層，根據(jù)流感病毒數(shù)據(jù)的特點(diǎn)，F(xiàn)LUDW的數(shù)據(jù)抽取器采用高級語言和SQL編程實(shí)現(xiàn)，系統(tǒng)通過抽取器定期檢測并抽取數(shù)據(jù)源的更新數(shù)據(jù)。再次是數(shù)據(jù)集成層，F(xiàn)LUDW建立了一個(gè)便于高效檢索的集成數(shù)據(jù)庫。最后是系統(tǒng)應(yīng)用層，F(xiàn)LUDW的Web頁面上提供了高效的檢索、序列比對分析等服務(wù)。

1.4 金銀花藥液MIC 值的測定

UA159 為橢圓形，成對或呈短鏈狀分布。在0、6、12 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入金銀花藥液后，細(xì)菌數(shù)量均明顯下降，但趨勢減緩（圖4a～4c）。溶劑組與菌液組均可見菌體大量團(tuán)聚，無明顯差異（圖4d、4e）。

1.5 UA159 菌株生長曲線的測定

實(shí)驗(yàn)組分別稀釋金銀花原液至MIC 及以下等比（1/2，1/4，1/8）3 個(gè)濃度，取1 mL 分別加入試管后再加入1 mL 標(biāo)準(zhǔn)菌液，菌液對照組則加入等量培養(yǎng)基及菌液。檢測培養(yǎng)0、4、8、12、24 h 時(shí)各管中液體的OD

值，繪制生長曲線圖。

1.6 測定金銀花藥液對UA159 產(chǎn)酸影響

實(shí)驗(yàn)組用BHI 液體培養(yǎng)基（含1%蔗糖）按照1.5 方法稀釋金銀花原液后分別取4.5 mL 加入試管，再加入標(biāo)準(zhǔn)菌液0.5 mL，菌液對照組加入等量培養(yǎng)基及菌液。每組設(shè)6 個(gè)平行組，在培養(yǎng)的0、4、8、12、24、48 h 時(shí)各組取出一支，離心，測pH值。0 h 時(shí)的pH 值作為初始pH 值，計(jì)算每個(gè)時(shí)間段每組的ΔpH 值，繪制產(chǎn)酸變化曲線。

綜上所述，倍他樂克聯(lián)合胺碘酮，臨床效果明顯，不僅僅能夠有效改善急性心肌梗死后室性心律失常患者的臨床癥狀，同時(shí)也能顯著提高臨床療效，控制不良反應(yīng)，具有臨床應(yīng)用優(yōu)勢及推廣價(jià)值。

1.7 測定金銀花藥液對UA159 黏附影響

實(shí)驗(yàn)組按1.6 方法稀釋藥液后取2.5 mL 加入試管，菌液對照組則加入等量培養(yǎng)基，溶劑對照組加入等量含DMSO 的培養(yǎng)基，再加入2.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)菌液，試管傾斜30°，24 h 后取出，將管內(nèi)液體倒入第二批相對應(yīng)管中，原試管加入5 mL PBS 搖晃震蕩，再將液體吸取至第三批對應(yīng)的試管中，PBS 溶液再次震蕩。將第2、3 批試管離心（3 000 r/min，15 min），吸棄上清液，5 mL PBS 溶液混勻。測各管OD

值。三批試管的數(shù)據(jù)分別記為X、Y、Z 值，黏附率=X/（X+Y+Z）×100%；黏附抑制率=（菌液對照組黏附率-實(shí)驗(yàn)組黏附率）/菌液對照組黏附率×100%。

1.8 金銀花藥液對UA159 生物膜的影響

與菌液組相比，0、6、12 h 點(diǎn)加入金銀花藥液組的細(xì)菌生物膜形成量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05），而菌液組與溶劑組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05），見表5。

技術(shù)人員、業(yè)務(wù)管理人員等都負(fù)有一定的成本控制責(zé)任，同時(shí)還享有成本控制的權(quán)力，對各部門在成本控制中的業(yè)績進(jìn)行定期的檢查和考證，并與工資分配緊密掛鉤，實(shí)行有獎(jiǎng)有罰，才能達(dá)到預(yù)期的效果，實(shí)現(xiàn)對成本的控制.

“教科研+”為培養(yǎng)能“提出問題”和“發(fā)現(xiàn)問題”的學(xué)生提供了保障，也為培養(yǎng)“研究型”、“專家型”教師提供了有力的條件.

24 h 內(nèi)不同濃度金銀花溶液對UA159 生長影響情況見表2、圖1。結(jié)果顯示：UA159 生長速度隨著藥液濃度的增加而逐漸變緩。菌液組在前8 h內(nèi)增長迅速，后逐漸變緩，12 h 后趨于穩(wěn)定；1/8MIC組與菌液組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05），1/4MIC、1/2MIC、MIC 與菌液組相比每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。不同藥物濃度組組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 金銀花藥液MIC 值的測定

3.2 詞表。詞表(Wordlist)屬于語料庫索引工具的基本功能。它可根據(jù)研究要求由詞表工具自動(dòng)排列，如以形符或類符在語篇中出現(xiàn)的頻率高低列出，或根據(jù)其字母順序進(jìn)行排列。

2.2 UA159 生長曲線的測定

1.8.3 SEM 觀察金銀花藥液對UA159 細(xì)菌數(shù)量的影響 15片氧化鋯片打磨拋光，裝入瓶內(nèi)，用20 mL無水乙醇及UP 超純水進(jìn)行超聲震蕩，高壓蒸汽滅菌15 min，烘干。取1 個(gè)24 孔板，分5 組，每組3 個(gè)復(fù)孔，放入氧化鋯片，重復(fù)1.8.2 方法加入菌液及藥液，厭氧培養(yǎng)24 h 后取出，吸干液體，充分漂洗；加2.5%戊二醛溶液2 mL，加蓋4 ℃固定4 h 后吸凈液體，將氧化鋯片轉(zhuǎn)入一新的24 孔板內(nèi)，反復(fù)漂洗；隨后依次50%、70%、80%、90%酒精梯度脫水各15 min，無水乙醇脫水2 次后干燥。各組選取2 枚，CO

臨界點(diǎn)干燥粘臺，噴金，掃描電鏡鏡檢，拍照。

2.3 測定金銀花藥液對UA159 產(chǎn)酸影響

各組pH 值隨著時(shí)間的推移均呈下降趨勢，8 h前速度更快，隨后減緩，結(jié)果見圖2，表3。1/8MIC與菌液組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05）。MIC、1/2MIC、1/4MIC 組與菌液組相比抑制作用明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。

2.4 測定金銀花藥液對UA159 黏附影響

隨著金銀花藥液濃度的增加，UA159 的黏附率下降，黏附抑制率增加，結(jié)果如表4。溶劑組與菌液組間的黏附率與黏附抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05）；不同金銀花藥液組與菌液組間的黏附率與黏附抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05）。

2.5 金銀花藥液對UA159 生物膜形成量的影響

1.8.1 金銀花藥液對UA159 生物膜形成量的影響 取96 孔板，編號1 ～5 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)菌液，在培養(yǎng)的0、6、12 h 時(shí)分別在1 ～3 組加入100 uL 20 mg/mL 的金銀花藥液，使最終藥液濃度為10 mg/ mL 后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，4、5 組分別為溶劑對照組及菌液對照組。24 h 后吸棄孔內(nèi)液體，PBS漂洗，室溫干燥，甲醛固定15 min；按照使用說明對標(biāo)本進(jìn)行1%結(jié)晶紫染色液染色，再次漂洗干燥，加入200 μL 的33%冰乙酸溶液溶解，酶標(biāo)儀測定每孔OD

值，評估生物膜的形成量。

2.6 變異鏈球菌生物膜結(jié)晶紫染色定性分析

顯微鏡下觀察UA159 菌體呈紫紅色，鏈狀或短鏈狀排列，0、6、12 h 加入藥液后生物膜形成量均明顯下降（圖3a～3c）。溶劑對照組（圖3d）與菌液對照組（圖3e）相比無明顯差異。

觀察1、2 號試管表現(xiàn)為清亮的淡黃色液體并且不伴沉淀生長，3 ～7 號、菌液及溶劑對照組均表現(xiàn)為不同程度的渾濁或沉淀。ΔOD

值結(jié)果見表1，與菌液組相比，1 ～4 號及藥液對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05），而5 ～7 號、溶劑對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05），根據(jù)結(jié)果結(jié)合肉眼觀察試管內(nèi)無渾濁或沉淀生長的最低藥物濃度即為金銀花的MIC，最終測得金銀花藥液對UA159 的MIC 值為12.5 mg/mL。

2.7 SEM 觀察金銀花藥液對UA159 細(xì)菌數(shù)量的影響

取500 mg 金銀花粉末，加入裝有10 mL DMSO溶液的離心管，吹打混勻，最后配置成質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的金銀花原液。實(shí)驗(yàn)組7 支離心管編號1 ～7，1 號加入金銀花原液1 mL，余試管依次按二倍梯度稀釋法用1 mL BHI 液體培養(yǎng)基依次按照二倍梯度稀釋至藥液濃度為25、12.5、6.25、3.125、1.5 625、0.78 125、0.390 625 mg/mL，最后各管均加入1 mL 標(biāo)準(zhǔn)菌液。藥液對照組加入1 mL 金銀花原液及1 mL 培養(yǎng)基；溶劑對照組加入含DMSO 溶劑的1 mL 培養(yǎng)基和1 mL菌液；菌液對照組加入1 mL菌液和1 mL 培養(yǎng)基。厭氧箱培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基情況，以渾濁度為指標(biāo)檢查有無細(xì)菌生長，結(jié)合酶標(biāo)儀檢測0、24 h 后各試管內(nèi)的OD

值，0 h 的OD

值為初始值，計(jì)算ΔOD

值，確定MIC 值。

1.8.2 變異鏈球菌生物膜結(jié)晶紫染色定性分析取2 個(gè)6 孔板，編號1 ～5 組，每組設(shè)2 個(gè)復(fù)孔。每孔放入22 mm×22 mm 滅菌蓋玻片一張，加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)菌液。按1.8.1 方法在培養(yǎng)的0、6、12 h 于1、2、3 組加入20 mg/mL 的金銀花藥液，4 組為溶劑對照組，5 組為菌液對照組，1～5 組均培養(yǎng)24 h后取出。吸干，PBS 漂洗，吸出。5 mL 甲醇固定15 min，洗凈，風(fēng)干。1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS 沖洗，濾紙吸干，正置顯微鏡鏡下觀察，拍照記錄。

3 討 論

變異鏈球菌被認(rèn)為是非致病性口腔微生物群落向菌斑生物膜過渡過程中最相關(guān)的細(xì)菌

。變異鏈球菌具有耐酸性，致使局部牙體組織脫礦，如果不加控制，最終導(dǎo)致齲病產(chǎn)生

。目前臨床上普遍使用的氟化物防齲效果是值得肯定的，但氟化物長期使用會(huì)帶來口腔組織著色、改變味覺等問題，甚至氟中毒等情況的發(fā)生。金銀花作為天然藥物，價(jià)格低，產(chǎn)量大，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，安全性高。主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、黃酮類化合物、有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜類，其中的綠原酸類是有機(jī)酸的主要有效成分，具有廣泛的抗氧化、抗菌作用

。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)天然藥物黃柏、肉桂、丁香的提取物對變異鏈球菌都有抑制作用

，但目前國內(nèi)外關(guān)于金銀花與變異鏈球菌致齲性研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用光密度的值來表示待檢樣品中細(xì)菌的濃度，測得MIC 為12.5 mg/mL。在生長實(shí)驗(yàn)中，藥液組細(xì)菌與標(biāo)準(zhǔn)株生長趨勢基本一致，但OD

值均低于菌液組，說明金銀花可能會(huì)影響細(xì)菌的增殖速度，但并不影響其生長的基本趨勢。從產(chǎn)酸曲線上看，加入藥液后pH 值隨著藥物濃度的增加而升高，產(chǎn)酸的抑制作用增強(qiáng)，說明金銀花能抑制變異鏈球菌的產(chǎn)酸能力。

細(xì)菌的黏附能力是牙菌斑生物膜形成的基礎(chǔ)，變異鏈球菌具有多種高親和力的表面黏附素，這導(dǎo)致其即使沒有蔗糖也能定植

。它表面與黏附有關(guān)的結(jié)構(gòu)有黏附蛋白、胞外多糖等。變異鏈球菌表面的表面蛋白P1 目前被研究較多，10 個(gè)以上的蛋白P1 與唾液GP340 相互作用導(dǎo)致黏附作用的產(chǎn)生

。本研究發(fā)現(xiàn)隨著金銀花濃度增加，細(xì)菌黏附率呈下降趨勢，且黏附抑制率上升，說明金銀花能抑制其黏附。但目前抑制黏附的具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

生物膜的特殊條件可以保護(hù)微生物免受宿主免疫細(xì)胞和藥物治療，并使微環(huán)境在低pH 時(shí)穩(wěn)定，導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦

。牙菌斑生物膜基質(zhì)的主要成分有變異鏈球菌分泌的胞外多糖，其能促進(jìn)細(xì)菌在牙面的定植，起到生物膜骨架的作用，穩(wěn)定菌斑基本結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)測量OD

值以胞外多糖的量來間接衡量被膜的生成量，結(jié)果顯示: 與菌液組相比，金銀花藥液培養(yǎng)24 h 后的OD

值呈減少趨勢。另外在體外建立變異鏈球菌生物膜模型，再利用光學(xué)顯微鏡初步觀察生物膜形成后的樣貌，同時(shí)利用SEM 觀察細(xì)菌數(shù)量變化，結(jié)果顯示加入10 mg/mL 金銀花藥液組在3 個(gè)時(shí)段均降低了細(xì)菌的數(shù)目，同時(shí)減緩了生物膜的形成速度，初步證實(shí)金銀花能抑制生物膜的形成。

即將播出的節(jié)目當(dāng)中可能會(huì)存在畫面損壞、音頻損壞等問題，這就需要使用到播前審檢技術(shù)，對素材進(jìn)行檢測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)素材當(dāng)中存在的損壞，并利用冗余備份技術(shù)及時(shí)播出相關(guān)的節(jié)目，保證播放系統(tǒng)的安全。

3.2.2 患者及照顧者缺乏協(xié)調(diào)經(jīng)驗(yàn) 患者及照顧者在安排預(yù)約、完成專科護(hù)理以及安排交通工具前往預(yù)約地點(diǎn)等方面，有不同程度的困難。有研究結(jié)果顯示，盡管APN給予幫助，但患者在出院后約1周仍存在交通方面問題，最后導(dǎo)致后期和醫(yī)生預(yù)約失敗[17]。此外，一些患者及家庭照顧者最終拒絕APN協(xié)調(diào)，其中部分患者和家庭照顧者向APN報(bào)告會(huì)自行做出必要的安排，但未能如期執(zhí)行。部分家庭照顧者允許APN陪同患者去醫(yī)院就診，但家庭照顧者并未與醫(yī)院協(xié)調(diào)好，故導(dǎo)致患者治療并不理想。此外，主要家庭照顧者未能及時(shí)參加APN TOC模式，APN從其他照顧者獲取信息有很大出入，也干擾了APN進(jìn)一步干預(yù)。

綜上所述，金銀花可抑制變異鏈球菌的生長、產(chǎn)酸、黏附、生物膜形成。本次研究初步證實(shí)了金銀花的抑菌作用，為齲病的防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但目前關(guān)于金銀花抗菌作用機(jī)制多停留在藥理指標(biāo)，化學(xué)成分與藥理作用的關(guān)系仍未探索，且缺少對變異鏈球菌黏附相關(guān)蛋白、基因及動(dòng)物模型的研究，因此，未來將從這些方面進(jìn)一步深入研究。

Zeng HQ performed the experiments and wrote the article. Mao L collected the data. Jin YH assisted with the data statistics. Li ST assisted in the experimental design. Xu A designed the experiments and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

[1] Mathur VP, Dhillon JK. Dental caries: a disease which needs attention[J]. Indian J Pediatr, 2018, 85(3): 202-206. doi: 10.1007/s12098-017-2381-6.

[2] Kor M, Pouramir M, Khafri S, et al. Association between dental caries, obesity and salivary alpha amylase in adolescent girls of babol city, Iran-2017[J].J Dent (Shiraz), 2021, 22(1): 27-32. doi:10.30476/DENTJODS.2020.84190.1070

[3] Arora G,Humphris G,Lahti S,et al.Depression,drugs and dental anxiety in prisons: a mediation model explaining dental decay experience[J]. Community Dent Oral Epidemiol, 2020, 48(3): 248-255.doi:10.1111/cdoe.12522.

[4] Aurlene N, Manipal S, Prabu D, et al. Prevalence of oral mucosal lesions,dental caries,and periodontal disease among patients with systemic lupus erythematosus in a teaching hospital in Chennai,Tamil Nadu[J]. J Family Med Prim Care, 2020, 9(7): 3374-3380.doi:10.4103/jfmpc.jfmpc_1263_19.

[5] Li YQ,Kong DX,Bai M,et al.Lonicera japonica correlation of the temporal and spatial expression patterns of HQT with the biosynthesis and accumulation of chlorogenic acid in flowers[J]. Hortic Res,2019,6:73.doi:10.1038/s41438-019-0154-2

[6] Guo XY, Yu X, Zheng BQ, et al. Lonicerae japonicae network pharmacology-based identification of potential targets of flos acting on anti-inflammatory effects.[J] .Biomed Res Int, 2021, 2021:5507003.doi:10.1155/2021/5507003

[7] Zhou L, Wang H, Yi J, et al. Anti-tumor properties of anthocyanins from Lonicera caerulea 'Beilei' fruit on human hepatocellular carcinoma:

and

study[J]. Biomed Pharmacother,2018,104(104):520-529.doi:10.1016/j.biopha.2018.05.057.

[8] Wan HQ，Ge LL，Xiao LY，et al. 3,4,5-Tri-O-caffeoylquinic acid methyl ester isolated from Lonicera japonica Thunb. Flower buds facilitates hepatitis B virus replication in HepG2. 2. 15 cells [J].Food Chem Toxicol，2020，138：111250. doi: 10.1016/j.fct.2020.111250.

[9] 王桂林,徐未芳,劉樂,等.金銀花不同溶劑提取物多酚含量及抗氧化活性[J]. 食品研究與開發(fā), 2020, 41(5): 104-107. doi:10.12161/j.issn.1005-6521.2020.05.017.Wang GL,Xu WF,Liu Le,et al.The content and antioxidant activities of honeysuckle polyphenol extracted by different solvent[J].Food Res and Dev,2020,41(5):104-107.doi:10.12161/j.issn.1005-6521.2020.05.017.

[10] Golubev D, Zemskaya N, Shevchenko O, et al. Honeysuckle extract (Lonicera pallasii L.) exerts antioxidant properties and extends the lifespan and healthspan of drosophila melanogaster[J].Biogerontology,2022.doi:10.1007/s10522-022-09954-1

[11] Buko V, Zavodnik I, Budryn G, et al. Chlorogenic acid protects against advanced alcoholic steatohepatitis in rats via modulation of redox homeostasis, inflammation, and lipogenesis[J]. Nutrients,2021,13(11):4155.doi:10.3390/nu13114155.

[12] Ye D,Sun J,Li Y.Evaluation of toxicity,bacteriostatic,analgesic,anti-inflammatory,and antipyretic activities of Huangqin-Honghua-Pugongying-Jinyinhua extract[J]. Vet Sci, 2021, 8(12): 330. doi:10.3390/vetsci8120330.

[13] He ZY,Huang ZW,Jiang W,et al.

antimicrobial activity of cinnamal dehyde on biofilms.[J]. Front Microbiol,2019,10:2241.doi:10.3389/fmicb.2019.02241.

[14] Martins ML,Leite K,Pacheco-Filho EF,et al.Efficacy of red propolis hydro-alcoholic extract in controlling

biofilm build-up and dental enamel demineralization[J].Arch Oral Biol,2018,93(93):56-65.doi:10.1016/j.archoralbio.2018.05.017.

[15] Sá-Pinto AC, Rego TM, Marques LS, et al. Correction to: association between malocclusion and dental caries in adolescents: a systematic review and meta-analysis[J]. Eur Arch Paediatr Dent,2021,22(2):309.doi:10.1007/s40368-020-00595-x.

[16] Fan Z,Li L,Bai X,et al.Extraction optimization,antioxidant activity, and tyrosinase inhibitory capacity of polyphenols from Lonicera japonica[J]. Food Sci Nutr, 2019, 7(5): 1786-1794. doi:10.1002/fsn3.1021.

[17] Tsujii T,Kawada-Matsuo M,Migita H,et al.Antibacterial activity of phellodendron bark against

[J]. Microbiol Immunol,2020,64(6):424-434.doi:10.1111/1348-0421.12787.

[18] Cui C, Xu H, Yang H, et al. Antibacterial activity of fruiting body extracts from Culinary-Medicinal winter mushroom,flammulina velutipes(agaricomycetes)against oral pathogen

[J]. Int J Med Mushrooms, 2020, 22(2): 115-124. doi: 10.1615/IntJMedMushrooms.2020033335.

[19] Lemos JA, Palmer SR, Zeng L, et al. The biology of

[J]. Microbiol Spectr, 2019, 7(1): 10. doi: 10.1128/microbiolspec.GPP3-0051-2018.

[20] Sulan RM,Li JK,Crowley PJ,et al.Binding forces of

P1 adhesion[J]. ACS Nano, 2015, 9(2): 1448-1460. doi:10.1021/nn5058886.

[21] Bernardi S, Bianchi S, Botticelli G, et al. Scanning electron microscopy and microbiological approaches for the evaluation of salivary microorganisms behaviour on anatase titanium surfaces:in vitro study[J].Morphologie,2018,102(336):1-6.doi:10.1016/j.morpho.2017.12.001.