荷包牡丹的組培快繁技術(shù)研究

摘? ? 要：為解決荷包牡丹（Lamprocapnos spectabilis 'Amore Rose'）的快繁問(wèn)題，以荷包牡丹試管苗的葉片為外植體材料，進(jìn)行了組培快繁技術(shù)的試驗(yàn)研究，建立了快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明，以幼嫩新葉為外植體材料，更有利于愈傷組織及叢生芽的形成;初代培養(yǎng)基以MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA為最優(yōu)，叢生芽的誘導(dǎo)率為85.7%;繼代增殖培養(yǎng)基以MS+0.5 mg·L-1 6-BA +0.05 mg·L-1 NAA為最優(yōu)，增殖系數(shù)達(dá)3.5;生根培養(yǎng)基以1/2 MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA為最優(yōu)，生根率達(dá)到98%;在草炭∶珍珠巖∶蛭石=7∶3∶2的優(yōu)質(zhì)移栽基質(zhì)上，煉苗成活率達(dá)95%以上。最適宜的培養(yǎng)溫度為20±1 ℃。用荷包牡丹的幼嫩試管苗葉片，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)獲得再生植株，成功建立了組培快繁技術(shù)體系。

關(guān)鍵詞：荷包牡丹;幼嫩新葉;叢生芽;組織培養(yǎng);玻璃化

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.1? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.003

Study on Tissue Rapid Propagation of Lamprocapnos spectabilis 'Amore Rose'

WEI Jinli

（Beijing Florascape Co.， Ltd.， Beijing 100093， China）

Abstract： In order to solve the problem of rapid propagation of Lamprocapnos? spectabilis 'Amore Rose'， the leaves was used as the explants to conduct the research of tissue culture techniques of propagation， and establish the sterile rapid propagation system in vitro. The results showed that it was easier to form callus and buds with young new leaves as explants. MS + 0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA was the suitable medium for explants induction of callus and cluster buds， the induction rate of cluster buds was 85.7%; MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA was the optimizing medium for multipropagation， the multiplication coefficient could reach up to 3.5; 1/2 MS+0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA was the best medium for rooting， the rooting rate could reach to 98%. After 30 days transplanted into greenhouse， the survival rate of young plants were over 95%.The optimum culture temperature was 20±1 ℃. Regenerated plants were obtained from the leaves of young test tube plantlets of Lamprocapnos spectabilis? 'Amore Rose' through callus induction， and the technical system of tissue culture and rapid propagation was successfully established.

Key words： Lamprocapnos spectabilis'Amore Rose'; young new leaves; cluster buds; tissue culture; glass transition

荷包牡丹（Lamprocapnos spectabilis （L.） Fukuhara）又稱(chēng)鈴兒草、鈴心草、瓔珞牡丹、荷包花、蒲包花、土當(dāng)歸、活血草、錦囊花等，是罌粟科荷包牡丹屬多年生宿根草本花卉，原產(chǎn)中國(guó)河北和東北地區(qū)，日本和西伯利亞[1]。荷包牡丹耐寒、耐半陰，花期較早，在4—6月份，且花期較長(zhǎng)，在綠化中可增添早春園林的色彩，尤其適合我國(guó)北方寒冷地區(qū)的栽植與應(yīng)用[2]。其株高30～60 cm，葉叢美麗，總狀花序，花色有玫紅、粉紅和白色等，花朵玲瓏，形似荷包，色彩絢麗，是盆栽和切花的好材料，也適宜于布置花境和在樹(shù)叢、草地邊緣濕潤(rùn)處叢植，亦可供庭園栽培觀(guān)賞，是景觀(guān)效果極好的宿根花卉[3]，在園林綠化應(yīng)用中極其廣泛;同時(shí)，其全草可入藥，具有很好的藥用價(jià)值，其內(nèi)含物荷包牡丹堿具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，被廣泛應(yīng)用醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，尤其近年來(lái)應(yīng)用于癌癥的治療研究，荷包牡丹堿對(duì)肝癌、胃癌和肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖和生長(zhǎng)具有抑制作用[4-6]，開(kāi)發(fā)前景非常廣闊。目前，國(guó)內(nèi)荷包牡丹的繁殖是通過(guò)分株法、扦插法和播種法來(lái)繁殖，扦插繁殖6—7月進(jìn)行，成活率較低[7];分株繁殖3月初與10月進(jìn)行，每2～3年方可進(jìn)行一次分株[8]，受到季節(jié)和環(huán)境的影響限制，使得繁殖難度大效率低;播種繁殖，10月進(jìn)行播種，翌年春季發(fā)芽，移栽后2～3年才能開(kāi)花[9]，效率也很低。因此，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)能有效地解決荷包牡丹的快速繁殖問(wèn)題。

目前，有關(guān)荷包牡丹的組培繁殖技術(shù)，在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有公開(kāi)報(bào)道的相關(guān)資料。本研究中的材料是從國(guó)外新引進(jìn)的優(yōu)良品種，數(shù)量只有幾十株，若用常規(guī)的方法來(lái)繁殖，除了繁殖效率低之外，可供取材的母本基數(shù)也甚少，很難在較短時(shí)間內(nèi)大量繁殖走向市場(chǎng)。為滿(mǎn)足廣大愛(ài)好者和消費(fèi)者的需求，荷包牡丹的組織培養(yǎng)技術(shù)研究，建立無(wú)性離體快繁體系和實(shí)現(xiàn)工廠(chǎng)化生產(chǎn)育苗是亟待解決的問(wèn)題。本研究的結(jié)果，也可為其他的組培育苗或育種提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以荷包牡丹（Lamprocapnos spectabilis 'Amore Rose'）的試管苗葉片為材料，來(lái)源于從美國(guó)Terra Nova公司新引進(jìn)的試管苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片誘導(dǎo)叢生芽 用來(lái)進(jìn)行葉片誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加不同濃度水平的6-BA、KT和NAA，以及白砂糖30 g·L-1和瓊脂粉4.5 g·L-1，培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.2，滅菌溫度121? ℃，時(shí)間20 min。準(zhǔn)備好培養(yǎng)基以后，將供試材料在超凈工作臺(tái)上的無(wú)菌條件下，切取帶有0.5～1 cm左右長(zhǎng)葉柄的葉片為外植體材料，根據(jù)葉片大小可切分成2～3小片，將切分好的葉片平鋪接種于培養(yǎng)基上，試驗(yàn)培養(yǎng)基共設(shè)5個(gè)處理，每個(gè)處理接種5瓶重復(fù)，每瓶接種7個(gè)外植體材料，接種完成后放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)（無(wú)特殊說(shuō)明，培養(yǎng)條件均為以進(jìn)口的飛利浦LED燈為光源，光強(qiáng)度為30 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)長(zhǎng)為每天10 h，培養(yǎng)溫度為20 ± 2 ℃），培養(yǎng)30 d時(shí)觀(guān)察、轉(zhuǎn)接并記錄結(jié)果。

1.2.2 叢生芽的繼代增殖培養(yǎng) 叢生芽繼代增殖的培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加不同濃度水平的6-BA和NAA，其它同上。將葉片誘導(dǎo)所得愈傷組織以及不定芽，以1～2個(gè)芽為一叢進(jìn)行分割后，接種到叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基上，試驗(yàn)培養(yǎng)基共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理接種5瓶重復(fù)，每瓶接種5個(gè)試驗(yàn)材料，培養(yǎng)30 d時(shí)觀(guān)察、轉(zhuǎn)接并記錄結(jié)果。

1.2.3 增殖苗在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng) 以增殖苗為試驗(yàn)材料，接種到增殖培養(yǎng)基上，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)置為18 ℃±1 ℃，20 ℃±1 ℃，22 ℃±1 ℃高、中、低3種不同的溫度處理，每個(gè)處理5瓶重復(fù)，每瓶接種10個(gè)試驗(yàn)材料，培養(yǎng)30 d時(shí)，觀(guān)察、轉(zhuǎn)接并記錄結(jié)果。

1.2.4 誘導(dǎo)生根培養(yǎng) 生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基是以1/2 MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同濃度水平的IBA和NAA，以及白砂糖20 g·L-1，其它同上。將繼代擴(kuò)繁所得的叢生芽苗切成單株，選取植株標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到株高3 cm和葉片數(shù)量4片及以上的無(wú)根單株壯苗，接種到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基共設(shè)7個(gè)處理，每個(gè)處理接種5瓶重復(fù)，每瓶接種10株苗，生根培養(yǎng)25 d時(shí)觀(guān)察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.2.5 生根苗的移栽煉苗 將生根后的瓶苗移到溫室，擰松瓶蓋放在苗床上，并用遮陽(yáng)網(wǎng)進(jìn)行遮光，以避免陽(yáng)光直射造成培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)溫度過(guò)高和光過(guò)強(qiáng)而使苗損傷，在瓶?jī)?nèi)煉苗2～3 d后將苗從培養(yǎng)瓶中取出，清洗干凈根部的培養(yǎng)基[10]，栽到裝有煉苗專(zhuān)用基質(zhì)塊（按體積比優(yōu)質(zhì)草炭∶珍珠巖∶蛭石=7∶3∶2）的128孔穴盤(pán)上，栽完苗后立即噴一次水，噴施一次多菌靈1 000倍或甲霜猛辛1 000倍液，隨后放到煉苗床上進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，養(yǎng)護(hù)30 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100;芽誘導(dǎo)率（%）=分化出芽的愈傷組織外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100;增殖倍數(shù)=接種后苗的總數(shù)量/接種前的總數(shù)量;可生根率（%）=可用來(lái)接生根苗的數(shù)量/苗的總數(shù)量×100;生根率（%）=有根的苗數(shù)量/最初接種的進(jìn)行生根培養(yǎng)的苗數(shù)量×100。

采用Excel 2010和SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)和分析顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片誘導(dǎo)叢生芽

將切分好的外植體葉片接種到不同的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（圖1- A），培養(yǎng)10 d時(shí)開(kāi)始形成愈傷組織，20 d后開(kāi)始形成叢生芽，30 d時(shí)已形成較多的叢生芽，并且有1～2 cm的完整小植株長(zhǎng)起來(lái)。在外植體誘導(dǎo)叢生芽的過(guò)程中，植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類(lèi)及濃度對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)形成都有著不同程度的影響。在不添加任何植物生長(zhǎng)物質(zhì)的情況下，外植體葉片不會(huì)形成愈傷組織;在添加有細(xì)胞分裂素6-BA的培養(yǎng)基中，只有少數(shù)外植體誘導(dǎo)形成了較少的叢生芽，多數(shù)外植體只形成了較小的胚狀愈傷組織塊，沒(méi)有芽的形成，并且在添加較低濃度6-BA的培養(yǎng)基里連愈傷組織都沒(méi)有形成;而在添加了6-BA和KT兩種細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，有較多的胚狀愈傷組織和叢生芽形成（圖1-B），當(dāng)KT的濃度增高時(shí)，有利于愈傷組織的形成，同時(shí)隨著6-BA和KT濃度的增高出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象。在5個(gè)不同處理中，以同時(shí)添加0.5 mg·L-1 6-BA和KT兩種細(xì)胞分裂素的處理3培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果性狀表現(xiàn)為最佳，叢生芽的誘導(dǎo)率為85.7%，具體見(jiàn)表1。

2.2 叢生芽的繼代增殖培養(yǎng)

在外植體誘導(dǎo)叢生芽所得結(jié)果的基礎(chǔ)上，將由外植體培養(yǎng)獲得的不定芽，以1～2個(gè)芽為一叢切分后接種到繼代增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d時(shí)形成叢生芽。在繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，不同的植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度不同對(duì)芽增殖的影響也有所不同。6-BA濃度增高時(shí)有利于芽的形成和增多，NAA濃度增高時(shí)有利于苗長(zhǎng)高大。6-BA與NAA的配比比例和濃度越低時(shí)，苗相對(duì)較為高而粗壯，有利于生根培養(yǎng);比例越高，有利于芽的形成，但隨著培養(yǎng)基中6-BA和NAA的濃度增大，玻璃化現(xiàn)象越嚴(yán)重，使有效增值倍數(shù)變低。在增殖培養(yǎng)基中，6-BA和NAA的添加濃度分別為0.5，0.05 mg·L-1時(shí)，也就是在處理3中增殖倍數(shù)最高，達(dá)到3.5，并且苗的生長(zhǎng)情況相較也最佳;處理1中的苗更有利于生根培養(yǎng)，具體見(jiàn)表2。

2.3 增殖苗在不同溫度下進(jìn)行培養(yǎng)

在18±1 ℃這樣較低的溫度下培養(yǎng)時(shí)，荷包牡丹的增殖苗生長(zhǎng)相對(duì)較為緩慢，植株變得較為矮小，高度僅為2 cm，能夠用來(lái)進(jìn)行接種生根培養(yǎng)的苗很少，在這樣的溫度環(huán)境下培養(yǎng)時(shí)，苗的生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)，使得大量的生產(chǎn)出苗很難實(shí)現(xiàn);當(dāng)溫度升高到20±1 ℃這樣的中等溫度時(shí)，苗生長(zhǎng)變得較快，芽苗增多的同時(shí)苗的質(zhì)量也變得較好，苗株高能達(dá)到3 cm以上，可用來(lái)接種生根培養(yǎng)的大好苗數(shù)量增多，培養(yǎng)效果相較為最佳;當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到22±1 ℃時(shí)，在前期階段苗生長(zhǎng)較快并且苗長(zhǎng)得更高大一些，苗株高能達(dá)到4 cm以上，但到了后期開(kāi)始出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，尤其是基部的小芽隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)玻璃化更為嚴(yán)重，使得整體芽苗的品質(zhì)變差，能用來(lái)接種生根培養(yǎng)的大好苗數(shù)量明顯下降，具體見(jiàn)表3。

2.4 誘導(dǎo)生根培養(yǎng)

將繼代擴(kuò)繁所得的切去基部小芽和愈傷組織的單株大苗接種到生根培養(yǎng)基上（圖1-C），培養(yǎng)15 d時(shí)開(kāi)始有根形成;到20 d時(shí)多數(shù)苗有根形成;再到25 d時(shí)根系長(zhǎng)達(dá)2 cm以上（圖1-D），生根率達(dá)到98%。試驗(yàn)結(jié)果表明，植物生長(zhǎng)物質(zhì)的種類(lèi)和濃度對(duì)根的形成有著較大影響，在荷包牡丹的生根培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，將NAA和IBA結(jié)合起來(lái)使用時(shí)，生根效果明顯好于其中一種單獨(dú)使用的效果，在適宜的濃度中生根率和根的整齊度都明顯變好。不論是結(jié)合起來(lái)使用，還是單獨(dú)使用，在添加的植物生長(zhǎng)物質(zhì)的濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)根的形成和生長(zhǎng)都出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。在7個(gè)不同的處理中，以處理5的培養(yǎng)效果為最佳。具體見(jiàn)表4。

2.5 生根苗的移栽煉苗

荷包牡丹的生根苗從培養(yǎng)瓶移出栽入煉苗基質(zhì)后，將基質(zhì)及苗全部用50%多菌靈1 000倍液噴施浸透，然后放在溫室溫度20～25 ℃和空氣濕度70%～85%的環(huán)境條件下養(yǎng)護(hù)，養(yǎng)護(hù)期間每隔7～10 d噴施一次濃度稀釋1 000倍的速溶復(fù)合肥（氮磷鉀含量比例為20∶20∶20），養(yǎng)護(hù)到15 d時(shí)已長(zhǎng)出2片新葉（圖1-E），養(yǎng)護(hù)到30 d時(shí)根能夠長(zhǎng)滿(mǎn)穴包住基質(zhì)，長(zhǎng)出4片左右新葉，株高為6 cm左右，苗健壯，成活率達(dá)到95%以上。

3 結(jié)論與討論

在以荷包牡丹的無(wú)菌葉片為外植體接種培養(yǎng)獲得叢生芽的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響外植體材料形態(tài)發(fā)生的最關(guān)鍵因素，植物愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化較大程度取決于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度[11]，不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度，對(duì)外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織及叢生芽有著不同程度的影響。在同等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度水平下，越幼嫩的葉片組織啟動(dòng)形成愈傷組織越早，并且愈傷組織易形成叢生芽，但隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度水平越高時(shí)易玻化[12-14];越老的葉片啟動(dòng)越慢甚至有的不啟動(dòng)，也不易形成芽。另外，當(dāng)激素濃度越高時(shí)，越有利于愈傷組織的形成，尤其是KT對(duì)愈傷組織形成的促進(jìn)作用明顯大于6-BA，但當(dāng)其濃度過(guò)高時(shí)，愈傷變得松散而不利于芽的形成;適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值也會(huì)對(duì)愈傷組織的增殖起到一定的促進(jìn)作用[15-16]。

荷包牡丹對(duì)溫度比較敏感，當(dāng)溫度較低光照較強(qiáng)時(shí)，玻璃化現(xiàn)象減少或無(wú)?；?，而當(dāng)溫度低于18 ℃時(shí)，苗生長(zhǎng)相對(duì)緩慢而植株矮小，甚至出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻現(xiàn)象;當(dāng)溫度高于22 ℃以上時(shí)，會(huì)有玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)，隨著溫度的升高玻璃化苗的數(shù)量明顯增多，葉色為深綠色，呈水浸狀，即使剩余的沒(méi)有玻璃化的好苗質(zhì)量有所降低，再次轉(zhuǎn)接或者接種生根苗的效果也不如中溫下培養(yǎng)的好。因此，在荷包牡丹的組織培養(yǎng)快繁過(guò)程中，溫度的控制很重要。

在生根培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在6-BA含量較低的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)的苗增殖系數(shù)低，但苗壯而植株單一，這樣的苗更容易生根。在工廠(chǎng)化大量生產(chǎn)時(shí)，根據(jù)需求調(diào)控6-BA和NAA濃度比例，在生根培養(yǎng)前進(jìn)行一次壯苗培養(yǎng)，這樣有利于提高苗的質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本[17]。經(jīng)測(cè)算，結(jié)合溫度控制和壯苗培養(yǎng)，可使生產(chǎn)成本相較低溫下大幅下降30%以上。

另外，在荷包牡丹的培養(yǎng)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，在苗生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌代謝產(chǎn)物使培養(yǎng)基慢慢褐變，由淺黃色到黃褐色逐漸變化，并隨時(shí)間越長(zhǎng)顏色越深，溫度越高褐化現(xiàn)象也越明顯。這種培養(yǎng)基的褐變現(xiàn)象對(duì)苗生長(zhǎng)影響不明顯，因此沒(méi)有進(jìn)行深入研究。

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