嗜鹽菌群對(duì)酸性大紅 GR 的脫色特性研究

陳庭躍,馬俊杰,李厚霖,趙嘉義,郭 光，丁克強(qiáng)

(南京工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院,南京 211167)

引 言

隨著印染技術(shù)的不斷發(fā)展，人工合成染料被廣泛應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年大概有20億t印染廢水排入水環(huán)境，約占工業(yè)廢水總排放量的十分之一，造成了極大的水體污染[1]。印染廢水具有色度深、毒性大、有機(jī)污染物含量高、難生物降解的有機(jī)物成分高、含有致癌物等特點(diǎn)。偶氮染料是應(yīng)用最為廣泛的合成染料，占人工合成染料產(chǎn)品總量的 80%[2]。偶氮染料還具有致癌、致畸、致突變作用及生物難降解性[3]。

目前，物理法、化學(xué)法和生物法是處理印染廢水的主要技術(shù)。雖然物理和化學(xué)法脫色效果好，但費(fèi)用較高，COD去除效果較差并且易產(chǎn)生二次污染。相比之下，生物法具有能耗低、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用于染料廢水處理[4]。微生物通常合成特定的酶，如偶氮還原酶和漆酶等，從而使偶氮鍵斷裂，形成苯胺類(lèi)化合物等[5]。但是，高鹽抑制了微生物對(duì)偶氮染料的降解。在印染過(guò)程中，為了提高著色效果，大量無(wú)機(jī)鹽加入到染色過(guò)程，導(dǎo)致印染廢水的含鹽量都很高。高鹽導(dǎo)致微生物質(zhì)壁分離，抑制普通微生物的活性。嗜鹽微生物可以在鹽環(huán)境中生存，突破普通微生物的瓶頸，高效的降解偶氮染料。雖然目前已經(jīng)分離出一些嗜鹽菌，但不同菌株的底物范圍和降解條件都不同，因此，需要篩選更高效的嗜鹽微生物。因此，本實(shí)驗(yàn)富集了在 5%鹽度下能使酸性大紅 GR 高效脫色的嗜鹽菌群，并研究了其脫色特性，為高鹽印染廢水生物強(qiáng)化處理提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基和菌群的富集方法

5%鹽度培養(yǎng)基[6]：Na2SO40.5 (g/L)；NH4Cl (0.3 g/L)；CaCl2(0.1 g/L)；KH2PO4(0.2 g/L);KCl (0.5 g/L)；MgCl2·6H2O (6.0 g/L)；NaCl (40.0 g/L)；乳糖 (1.0 g/L)；pH 7.0 ；1×105Pa 滅菌 30 min。

模擬印染廢水：5%鹽度培養(yǎng)基加入染料。

嗜鹽菌群：將10 mL印染廢水處理的活性污泥加入100 mL的5%模擬印染廢水中(酸性大紅GR濃度為100 mg/L)，2周后按照10%的比例接入新鮮模擬印染廢水中，待脫色穩(wěn)定后，富集培養(yǎng)結(jié)束。

1.2 菌群的群落結(jié)構(gòu)分析

采用Fast DNA Spin Kit 試劑盒提取微生物基因組DNA。使用 Illumina Mi Seq PE250 測(cè)序儀高通量測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)，篩選和拼接所有數(shù)據(jù)序列，經(jīng)過(guò)OTU分析與聚類(lèi)分析，最后通過(guò)Sliva數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arb-silva.de/)中的已知數(shù)據(jù)比對(duì)代表性序列、注釋物種并統(tǒng)計(jì)群落結(jié)構(gòu)。

1.3 菌群降解酸性大紅 GR 的影響因素

將菌群接入5% 鹽度培養(yǎng)基(酸性大紅GR濃度為100 mg/L)中培養(yǎng)，20 h 后按10%的比例將菌液接種到不同碳源、氮源、鹽度、pH 和濃度的5%鹽度培養(yǎng)基(酸性大紅GR染濃度為 100 mg/L)中。碳源和氮源分別替換5%鹽度培養(yǎng)基中的乳糖和 NH4Cl，碳源濃度為1 g/L。

1.4 菌株對(duì)其他染料的降解

將菌液接種到含不同偶氮染料的 5% 鹽度培養(yǎng)基中，染料濃度均為100 mg/L。染料包括酸性紫(542 nm)、直接黑G (636 nm)、酸性金黃G (425 nm)、直接粉(538nm)、直接藍(lán)2B (598 nm)和酸性黑(636 nm)，20 h后測(cè)定脫色率。

1.5 染料濃度的測(cè)定和脫色率的計(jì)算

將脫色液在 12 000 r/min 下離心 5 min，取上清液，以未加染料的培養(yǎng)基作空白，在染料的相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。脫色率的計(jì)算按照下式進(jìn)行。

式中A0為初始時(shí)刻染料的吸光度；At為 t 時(shí)刻染料的吸光度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。

1.6 紫外/可見(jiàn)吸收光譜分析

取濃度為100 mg/L 酸性大紅GR溶液、降解10 h和20 h離心后的上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)190～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果和討論

2.1 菌群的富集

本研究經(jīng)過(guò)10次富集，從印染廢水中獲得了一個(gè)能夠在5%鹽度下降解酸性大紅 GR的嗜鹽菌群。在5%鹽度下，20 h的脫色率達(dá)到 95.56% (100 mg/L)。脫色結(jié)束后，微生物顯示為白色，沒(méi)有染料的顏色，說(shuō)明該菌群通過(guò)降解作用將酸性大紅GR脫色，這和其他的研究結(jié)果相似[7](結(jié)果沒(méi)有顯示)。該菌群在靜置條件下比震蕩條件下脫色率高，是由于氧氣比酸性大紅GR更容易成為電子受體[8]。所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用靜置的方法研究。

2.2 嗜鹽菌群的群落結(jié)構(gòu)

高通量測(cè)序結(jié)果表明(圖 1)，該菌群主要由海細(xì)菌屬、卓貝爾氏菌、腸球菌、日勾維多細(xì)菌源菌、替斯崔納菌、梭菌、污泥螺菌屬等組成。它們分別占全部序列的39.76%、21.38%、13.57%、11.31%、7.08%、2.52%和1.96%。海細(xì)菌屬于嗜鹽菌，可以適應(yīng)高鹽環(huán)境，本課題組富集的其他降解偶氮染料的菌群中也發(fā)現(xiàn)該菌[9]。本課題組已經(jīng)從該菌群中分離出該菌，證明該菌能降解偶氮染料，相關(guān)研究正在進(jìn)行中。卓貝爾氏菌可以在多種鹽度下脫氮，但目前還沒(méi)有降解偶氮染料的報(bào)道。腸球菌是兼性厭氧菌，其中Enterococcussp.L2中含有偶氮還原酶基因，可降解多種偶氮染料[10]。日勾維多細(xì)菌源菌可降解n-?；呓z氨酸內(nèi)酯[11]，替斯崔納菌可降解多環(huán)芳烴和農(nóng)藥毒死蜱等[12-13]，梭菌屬于梭菌目是厭氧嗜鹽菌，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這三種菌參與染料脫色的研究，說(shuō)明自然界中還有很多降解偶氮染料的微生物資源。

圖1 微生物菌群的群落結(jié)構(gòu)

2.3 碳源和氮源對(duì)菌群脫色效率的影響

微生物共代謝是微生物降解偶氮染料的重要方式。從圖 2可以看出，碳源對(duì)嗜鹽菌群脫色酸性大紅GR影響較大。乳糖和酵母粉促進(jìn)嗜鹽菌群脫色的效率最好，20 h 后的脫色率分別達(dá)到98.56%和94.95%為，其次為麥芽糖(77.96%)，葡萄糖( 62.06%)，蔗糖為(60.77%)，淀粉的效果最差，只有17.58%。共代謝促進(jìn)微生物脫色偶氮染料，主要是因?yàn)楣泊x基質(zhì)可以作為電子供體，提高偶氮還原酶的活性[14]。乳糖促進(jìn)脫色的效果最好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用乳糖作為共代謝碳源。

圖2 碳源對(duì)嗜鹽菌群脫色效率的影響

碳源也影響嗜鹽菌群對(duì)酸性大紅GR的脫色效果(圖 3)。所有氮源中，尿素和氯化銨的脫色率最高，20 h 后分別達(dá)到 97.48%和 95.77%。而蛋白胨24 h后的脫色率為 86.07%。牛肉膏的促進(jìn)效果最低，僅為 59.73%。有研究發(fā)現(xiàn)，尿素可以促進(jìn) NADH 的再生，從而促進(jìn)微生物對(duì)偶氮染料的脫色[15]。

圖3 氮源對(duì)嗜鹽菌群脫色效率的影響

2.4 pH 對(duì)菌群脫色效率的影響

pH 是影響微生物降解的重要因素，影響染料染料的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響微生物的降解[16]。從圖4可以看出，嗜鹽菌群在pH 7對(duì)酸性大紅GR的脫色率最高，達(dá)到 95.77%。其次為pH 6，20 h的脫色率為93.83%。過(guò)高和過(guò)低pH導(dǎo)致脫色率降低，pH 8、9 和 10 時(shí)，脫色率分別為65.27%、27.44%和26.26%。嗜鹽菌群在 pH 4時(shí)達(dá)到最低，脫色率只有13.50%。pH變化抑制部分微生物生長(zhǎng)，活性降低，抑制微生物脫色[16]。同時(shí)pH通過(guò)影響酶的活性導(dǎo)致脫色率下降。

圖4 pH 對(duì)嗜鹽菌群脫色效率的影響

2.5 染料濃度對(duì)菌群脫色效率的影響

酸性大紅GR濃度影響對(duì)嗜鹽菌群的脫色(圖 5)。在100～400 mg/L范圍內(nèi)，當(dāng)酸性大紅GR濃度為100 mg/L時(shí)，20 h的脫色率達(dá)到 94.74%。濃度升高，微生物需要更多的時(shí)間降解偶氮染料。當(dāng)濃度為 400 mg/L，嗜鹽菌群也能高效脫色，126 h的脫色率為93.73%。偶氮染料具有毒性，濃度越高，毒性越大，從而抑制微生物的活性[17]。同時(shí)，偶氮染料降解產(chǎn)生的苯胺類(lèi)也具有毒性，導(dǎo)致微生物的脫色率下降[18]。本研究富集的嗜鹽菌群可以高效降解400 mg/L的酸性大紅GR，同時(shí)也有較廣的濃度降解范圍，對(duì)處理偶氮染料廢水具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.6 鹽度對(duì)菌群脫色效率的影響

為了提高染料的固著效果，染色過(guò)程中經(jīng)常會(huì)添加無(wú)機(jī)鹽，導(dǎo)致印染廢水的鹽度升高。鹽度對(duì)微生物降解酸性大紅GR的影響如圖 6 所示。在鹽度5%時(shí)，嗜鹽菌群的脫色率最高，達(dá)到96.06%。隨著鹽度升高和降低，脫色率都明顯降低，在0%鹽度時(shí)20 h的脫色率為21.80%。在20%的脫色率最低，脫色率只有6.30%。鹽度是嗜鹽菌生長(zhǎng)的必須的條件，鹽度降低也會(huì)導(dǎo)致微生物活性下降，甚至死亡；但是鹽度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致微生物脫水，活性降低，抑制細(xì)菌的活性[19]。此外，鹽度升高使微生物合成更多的胞外聚合物，影響微生物的代謝方向，脫色率降低[20]。本研究富集的嗜鹽菌可以在3%～10%范圍內(nèi)降解偶氮染料，在高鹽印染廢水中具有應(yīng)用潛力。

圖6 鹽度對(duì)嗜鹽菌群脫色效率的影響

2.7 菌群對(duì)不同偶氮染料的脫色

偶氮染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)也影響嗜鹽菌的脫色效果(圖 7)。20 h 后，酸性大紅 GR幾乎完全脫色(脫色率為 95.58%)，其次是酸性金黃(92.30%)、酸性紫 (76.49%)、直接黑(71.58%)、直接粉(69.41%)、直接藍(lán)2B (65.16%)、酸性黑(32.02%)和。微生物更容易降解結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量較小的偶氮染料[2]。此外，偶氮染料中芳香環(huán)上的取代基種類(lèi)也影響微生物的降解[21]。酸性紫、酸性金黃只有一個(gè)偶氮鍵，容易降解。而酸性紫中含有抑制基團(tuán)磺酸基(-SO3H)，所以比酸洗金黃的降解率低。酸性黑、直接黑包含兩個(gè)偶氮鍵，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所以脫色率較低，這和他人的結(jié)果相同[22]。

圖7 嗜鹽菌群對(duì)不同偶氮染料的脫色效果

2.8 紫外/可見(jiàn)吸收光譜分析

紫外/可見(jiàn)吸收光譜的結(jié)果表明，嗜鹽菌降解酸性大紅GR后的偶氮鍵破壞，導(dǎo)致酸性大紅GR的顏色降低(圖 8)。酸性大紅 GR 在510 nm有明顯的吸收峰，這與他人的結(jié)果相同[23]。經(jīng)過(guò)11 h后，510 nm的吸收峰降低，20 h后，該峰完全消失，證明微生物主要通過(guò)降解破壞偶氮鍵，使酸性大紅GR脫色。

圖8 染料脫色過(guò)程的紫外-可見(jiàn)光掃描圖

3 結(jié) 論

3.1 采用富集的方法，從印染廢水的活性污泥中富集了一個(gè)能夠使酸性大紅GR 脫色的嗜鹽菌群，該菌群主要由菌群主要由海細(xì)菌屬、卓貝爾氏菌和腸球菌等7個(gè)屬組成。

3.2 該菌群的最適脫色條件是pH=7，5%鹽度，共代謝底物是酵母粉和乳糖，最佳氮源為氯化銨和尿素，底物濃度100 mg/L，20 h的脫色率達(dá)到94%。

3.3 該菌群可以在100～400 mg/L濃度內(nèi)高效脫色酸性大紅GR；還可以脫色酸性金黃、酸性紫、直接黑和直接粉等偶氮染料。該菌群通過(guò)偶氮鍵斷裂降解酸性大紅GR。

3.4 該嗜鹽菌群脫色效果好，為高鹽印染廢水處理提供了菌種資源和理論依據(jù)，在高鹽印染廢水處理中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。