EGFL6對骨血管生成的調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展*

廖世杰，宋方茗，陳凱，唐生平，徐家科△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西再生醫(yī)學(xué)研究中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué) 廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.西澳大利亞大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)與科學(xué)學(xué)院，珀斯澳大利亞 6009）

骨具有高度的再生性，其生長和重塑過程經(jīng)由無數(shù)的細(xì)胞活動密切協(xié)調(diào)。除成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞起主要作用外[1-2]，內(nèi)皮細(xì)胞參與的血管生成也是維持機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)動態(tài)平衡的重要一環(huán)[3]。骨組織中廣泛存在的血管網(wǎng)絡(luò)能運(yùn)輸成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體、生長因子及營養(yǎng)物質(zhì)以滿足骨骼的生長、代謝需求[4-5]，血管內(nèi)皮細(xì)胞還能產(chǎn)生多種成骨特性的內(nèi)分泌因子調(diào)控機(jī)體骨穩(wěn)態(tài)[6]。一些細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）在骨血管生成過程中的作用已被研究證實(shí)[7-8]，積極探索新的血管生成因子及其作用機(jī)制尤為重要。

表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域6（epidermal growth factor-like domain，EGFL6）是由成骨細(xì)胞特異性分泌的促血管生成因子，能在骨修復(fù)過程中偶聯(lián)血管生成與成骨。明確EGFL6調(diào)控骨血管生成的機(jī)制，有望為骨愈合受損、骨質(zhì)疏松、骨壞死等臨床難題提供新思路。

1 EGFL6 的分子特征

EGFL基因家族因能編碼包含單個或多個EGFL的蛋白而得名，能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、核因子-?B（NF-?B）及Notch等重要信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)如細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化[9]及胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、血管生成[10]等廣泛的生物學(xué)活動。

EGFL家族成員包括EGFL2、EGFL3、EGFL5、EGFL6、EGFL7、EGFL8和EGFL9等，其中EGFL6、EGFL7可編碼生長因子參與血管生成的調(diào)節(jié)，是目前研究的熱點(diǎn)。EGFL7在成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，能促進(jìn)骨局部環(huán)境及某些腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管生成[9,11]。EGFL6也被稱為MAEG，位于人的Xp22染色體上，由Yeung等[12]在1999年通過DNA分子雜交高通量篩選而發(fā)現(xiàn)。EGFL6蛋白分子結(jié)構(gòu)包括1個N端信號肽結(jié)構(gòu)域、1個整合素結(jié)合位點(diǎn)（RGD）、5個EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域和1個C端MAM結(jié)構(gòu)域[13]。EGFL6蛋白中位于N端的信號肽區(qū)提示其可能是一種分泌蛋白[12]；RGD基序可與整合素受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化[14-16]；EGFL樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域包含30～40個氨基酸殘基，與表皮生長因子（EGF）有著顯著同源性，可通過蛋白質(zhì)間的相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能[5]；位于C端的MAM結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為能夠發(fā)揮黏附功能[17]。此外，EGFL6還有2個潛在的N-糖基化位點(diǎn)和1個潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，提示EGFL6可能作為一種激酶底物，通過磷酸化來調(diào)節(jié)表達(dá)或調(diào)節(jié)功能[12]。

EGFL6最初發(fā)現(xiàn)主要作用于胎兒的早期發(fā)育，隨后在成熟脂肪細(xì)胞、毛囊、軀干真皮組織、顱面區(qū)間質(zhì)及某些腫瘤中也發(fā)現(xiàn)其存在[18-21]。骨骼系統(tǒng)與EGFL6的聯(lián)系最早由Chim等[20]的研究所揭示，筆者發(fā)現(xiàn)EGFL6能在成骨細(xì)胞中特異性地表達(dá)，且與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、血管形成關(guān)系密切。近年來學(xué)者們不斷深入對EGFL6的研究，展示其在成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的交互中發(fā)揮著重要作用。

2 EGFL6 調(diào)控骨血管生成的相關(guān)機(jī)制

作為富含血管的組織，骨的形成過程并非孤立，而是與骨血管的生成緊密聯(lián)系且相互促進(jìn)，二者在時(shí)間、空間上的關(guān)系稱為“血管生成-成骨偶聯(lián)”作用[22]。高表達(dá)CD31和內(nèi)皮黏蛋白（EMCN）的H型血管在骨修復(fù)中地位重要，H型內(nèi)皮細(xì)胞能分泌許多刺激骨祖細(xì)胞增殖和分化的因子來調(diào)節(jié)成骨，可作為評估局部骨血管生長狀況及成骨能力強(qiáng)弱的標(biāo)志[22-24]。目前認(rèn)為，骨重塑發(fā)生在一個稱為骨重塑室的特殊血管結(jié)構(gòu)中，其內(nèi)包含的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞等細(xì)胞能緊密協(xié)作，調(diào)控復(fù)雜而有序的骨修復(fù)活動[5,25-26]。

骨重塑室中，內(nèi)皮細(xì)胞可分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）和胰島素樣生長因子（IGF）等成骨因子影響骨的生長和重塑[6]；而成骨細(xì)胞能旁分泌EGFL6作用于臨近的血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成，同時(shí)能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF-A的表達(dá)，誘導(dǎo)H型血管生成。骨愈合受損、骨壞死等由于局部血運(yùn)的缺乏是目前臨床治療的難題，促進(jìn)血管生成和血供恢復(fù)是治療的關(guān)鍵。EGFL6經(jīng)由多種途徑調(diào)控血管生成（圖1），了解其作用機(jī)制，有助于加深對骨修復(fù)、骨血管重建的認(rèn)識。

圖1 EGFL6偶聯(lián)成骨與血管生成

2.1 EGFL6與MAPK/ERK信號通路 隨著對EGFL6的研究逐步展開，其在骨血管生成的作用機(jī)制也在不斷地被揭示。MAPK/ERK信號通路是EGFL6調(diào)控骨血管生成的重要一環(huán)，該通路屬于蛋白質(zhì)-絲氨酸/蘇氨酸激酶級聯(lián)反應(yīng)，參與了細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等生物學(xué)過程[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7能通過結(jié)合EGFR激活ERK信號通路，調(diào)控骨血管生成[11]。

Chim等[20]首次發(fā)現(xiàn)并研究了EGFL6對骨疾病作用，探索了EGFL6是否經(jīng)由MAPK/ERK信號通路影響骨血管生成。該研究首先驗(yàn)證了EGFL6是一種分泌蛋白，隨后體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有EGFL6的條件培養(yǎng)基不僅能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成與雞胚絨毛尿囊膜的血管生成。與對照組相比，EGFL6組的內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化ERK（p-ERK）的表達(dá)水平顯著升高，進(jìn)一步抑制ERK通路，EGFL6誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及小管形成的能力被顯著抑制。Shen等[29]的研究顯示，經(jīng)EGFL6處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中p-ERK1/2的表達(dá)水平也可發(fā)生不同程度的改變。此外，Chim等[20]的研究發(fā)現(xiàn)外源性EGFL6不誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖和礦化，這與本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相佐證—成骨細(xì)胞以胞內(nèi)分泌EGFL6的方式經(jīng)由MAPK等信號通路內(nèi)源性促進(jìn)成骨[30]，同時(shí)也提示EGFL6能偶聯(lián)成骨與血管生成。以上研究結(jié)果證明了EGFL6可通過ERK信號在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成等方面參與骨血管生成過程。EGFL6可在體外經(jīng)MAPK/ERK信號通路促進(jìn)骨與血管生成，但其在生物體內(nèi)如小鼠模型中的作用以及具體的細(xì)胞間通訊形式，還有待進(jìn)一步探索。

2.2 EGFL6與Wnt/β-catenin信號通路Wnt信號通路是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞增殖、分化、黏附和凋亡等多種過程中發(fā)揮作用，該通路包括3個主要分支：經(jīng)典Wnt通路（即Wnt/β-catenin通路）、Wnt/PCP通路及Wnt/Ca2+通路。其中，Wnt/β-catenin信號通路在骨的正常生長及代謝中的地位重要，能參與調(diào)控BMSCs、成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的增殖、分化[31-32]。

Shen等[29]研究發(fā)現(xiàn)，重組EGFL6蛋白可以促進(jìn)HUVECs的增殖、遷移和小管形成，促進(jìn)CD31表達(dá)及EMCN的內(nèi)皮細(xì)胞形成；此外，通過RT-qPCR、western blotting等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，EGFL6可增強(qiáng)體外HUVECs和BMSCs中β-catenin和活性β-catenin的表達(dá)。在大鼠牽張成骨模型中，免疫熒光實(shí)驗(yàn)也檢測到經(jīng)EGFL6干預(yù)后牽張間隙活性β-catenin的增加，表明Wnt/β-catenin信號通路是EGFL6促進(jìn)血管生成和骨生成的一個潛在機(jī)制[29]。而Wnt信號通路的抑制劑DKK1只能部分抑制由EGFL6誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化及成骨相關(guān)蛋白（如CXCR4、Runx2）的上調(diào)，提示此信號通路可能僅為EGFL6調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一部分，還有其他信號傳導(dǎo)通路參與其中。該實(shí)驗(yàn)表明外源性EGFL6增強(qiáng)了體外BMSCs的成骨分化，并通過刺激血管生成加速骨再生。

2.3 EGFL6與BMP/Smad信號通路BMP信號通路是以BMP為核心和啟動位點(diǎn)的完整信號系統(tǒng)，包括典型的Smad途徑和非典型的MAPK途徑[33]，在骨骼發(fā)育、骨形成和骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中至關(guān)重要。BMP作為一種分泌型的多功能細(xì)胞因子，參與了各種器官的形成和維持過程，其中BMP-2能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并增加骨鈣素等成骨相關(guān)因子的表達(dá)從而促進(jìn)骨形成[34]。另外，在所有的Smad蛋白中Smad1/5/8與成骨細(xì)胞的分化密切相關(guān)，被磷酸化的Smad1/5/8（p-Smad1/5/8）與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[34-35]。

BMP/Smad信號通路作為誘導(dǎo)成骨分化的重要信號，經(jīng)分泌蛋白EGFL6的調(diào)控在增強(qiáng)骨與血管偶聯(lián)、促進(jìn)骨血管生成中扮演重要角色。本課題組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞來源的EFGL6不僅能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及誘導(dǎo)骨血管的生成，還能調(diào)控成骨分化而間接促進(jìn)血管的生成。過表達(dá)EGFL6的BMSCs成骨能力增強(qiáng)；而沉默EGFL6的BMSCs成骨能力明顯減弱，表現(xiàn)為礦化程度降低并伴有關(guān)鍵成骨基因（如Bglap、Sp7和Runx2）的表達(dá)下調(diào)。用BMP-2干預(yù)過表達(dá)或沉默EGFL6的BMSCs后，可檢測到過表達(dá)組p-Smad1/5/8較沉默組明顯增高，提示EGFL6能通過激活BMP/Smad信號通路調(diào)控成骨分化[30]。此外，外源性的EGFL6能促進(jìn)體外內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)，卻對成骨細(xì)胞的增殖及礦化能力無明顯影響[20]。但Liu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，外源性重組EGFL6蛋白可通過調(diào)控BMP-2/Smad4信號通路促進(jìn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化，這與Shen等[29]的研究結(jié)果相似。由于Shen等[29]使用的是含有EGFL6部分片段的重組蛋白，而本課題組使用的是EGFL6的全長蛋白，所以筆者初步猜想不同來源的重組EGFL6蛋白具有的分子差異性可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生差異的原因，同時(shí)也提示外源性EGFL6蛋白對成骨分化的生物效應(yīng)可能具有片段特異性。

2.4 EGFL6與其他分子 除上述列舉信號通路外，一些相關(guān)分子可能參與EGFL6對骨血管生成的調(diào)控。例如，在胚胎時(shí)期EGFL6通過與整合素β1結(jié)合激活ERK相關(guān)信號通路，參與脊椎動物胚胎血管發(fā)育[37]。轉(zhuǎn)錄因子Twist1可與EGFL6啟動子結(jié)合激活下游信號，隨著Twist1的表達(dá)量增加可在一定程度提高EGFL6的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)傷口血管生成及愈合[16]；非編碼RNA miR-6086可以直接與EGFL6 mRNA結(jié)合負(fù)向調(diào)控卵巢癌的腫瘤生長和血管生成[38]，描述了EGFL6可能的上游調(diào)控機(jī)制。經(jīng)典的促血管生成因子VEGF-A在過表達(dá)EGFL6的BMSCs中表達(dá)上調(diào)，而在敲除EGFL6的BMSCs中表達(dá)下降[30]，可以猜測成骨細(xì)胞分化過程中EGFL6可能是VEGF-A的上游調(diào)節(jié)劑，二者相互協(xié)作以調(diào)節(jié)骨微環(huán)境中的血管生成和成骨。腎連蛋白（NPNT）與EGFL6相似，擁有EGF樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域，能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、礦化以及骨血管的生成[39-40]，有研究顯示，皮膚毛囊缺乏NPNT可導(dǎo)致EGFL6代償性地表達(dá)上調(diào)[19]。骨血管生成是一個多因素交叉作用的復(fù)雜過程，多種信號通路與相關(guān)分子可能同時(shí)參與了此過程的調(diào)控，隨著未來研究的深入，期待更多EGFL6調(diào)控網(wǎng)絡(luò)新成員的發(fā)現(xiàn)。

3 EGFL6 調(diào)控骨血管生成相關(guān)的動物模型

選擇合適的動物模型有助于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的開展，對揭示EGFL6的作用機(jī)制具有重要意義。因繁殖周期短、成本較低、遺傳背景明確等優(yōu)點(diǎn)，嚙齒類動物是骨修復(fù)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選動物模型[41]。其中，大鼠、小鼠是目前用于研究EGFL6調(diào)控骨修復(fù)的主要動物。

牽張成骨模型與其他模型相比，能從時(shí)間和空間角度反應(yīng)骨重建的病理過程，可以更直觀地表現(xiàn)骨重塑部位血管生成的情況。Shen等[29]在大鼠脛骨中段建造了牽張成骨模型，隨后將外源性的EGFL6蛋白注入牽張間隙中，利用影像學(xué)、組織學(xué)及免疫學(xué)方法發(fā)現(xiàn)EGFL6同時(shí)促進(jìn)了H型毛細(xì)血管及新生骨的形成，新血管能沿著新生骨組織圍繞成柱狀，向著牽張間隙延伸從而加速骨愈合。該大鼠模型實(shí)驗(yàn)提示，提高局部EGFL6的濃度可能是促進(jìn)骨缺損修復(fù)和骨折愈合的方法，為未來EGFL6的臨床應(yīng)用提供了動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但最適蛋白濃度、是否存在其他調(diào)節(jié)因子代償以及是否對人體有效仍需進(jìn)一步研究。

另一方面，本課題組利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了EGFL6敲除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下EGFL6的缺失不影響小鼠正常骨表型的發(fā)展，EGFL6敲除小鼠意外地表現(xiàn)出與對照組無明顯差異的身高、體重以及骨小梁、骨皮質(zhì)參數(shù)[30]。這或許表明EGFL6在生理狀態(tài)下的骨發(fā)育過程中不占主要地位，亦或提示存在其他代償性的血管因子彌補(bǔ)了EGFL6的缺失，所以解決哪些因素可以彌補(bǔ)EGFL6的損失也是未來的工作方向之一。而在EGFL6敲除小鼠制造脛骨單皮質(zhì)骨缺損后，缺損區(qū)域的H型血管和表達(dá)Runx2的成骨細(xì)胞顯著減少，導(dǎo)致骨愈合延遲，表明骨修復(fù)的病理狀態(tài)下，EGFL6作為一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子對骨與血管的生成至關(guān)重要。

4 總結(jié)與展望

目前針對EGFL6的研究多見于腫瘤領(lǐng)域，但隨著研究的深入，其在骨修復(fù)重塑中的作用越發(fā)引人注目。血管生成是骨生長、骨重塑以及病理性骨疾病的重要組成部分。EGFL6或許在正常生理狀態(tài)下對骨生長不起主要作用，但在病理狀態(tài)下的骨缺損修復(fù)過程中則是不可或缺的，其可經(jīng)多種信號通路及相關(guān)分子調(diào)控成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的交互，偶聯(lián)成骨與血管生成，促進(jìn)骨組織的修復(fù)與再生。但對于EGFL6的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步挖掘，如EGFL6是通過內(nèi)源性還是外源性的方式促進(jìn)成骨分化；除上述通路外是否還存在其他作用通路，有無某條優(yōu)勢通路在EGFL6調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用；EGFL6上游的調(diào)控機(jī)制、具體的分子靶點(diǎn)及其在其他骨疾病中的作用等。

綜上所述，深入研究EGFL6在骨微環(huán)境中調(diào)控血管生成的作用機(jī)制，加深對骨重建及血管再生的認(rèn)識，有助于為骨愈合受損、骨壞死等臨床骨病的治療提供一個理想的靶點(diǎn)。