降溫速率對斑石鯛無水保活過程中生理應(yīng)激的影響

華茂圳，黃寶生 ，俞濤濤，蔣樂霞，張家國 ，張長峰，孫崇德

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2. 山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250103；4. 廣東海洋大學(xué)，廣東 湛江 524000）

0 引言

【研究意義】斑石鯛（Oplegnathus punctatus），俗稱斑鯛、花金鼓、黑金鼓，極具食用與醫(yī)用價(jià)值，肉質(zhì)獨(dú)特，口感豐富，富含多種氨基酸與不飽和脂肪酸，可用于治療脾腎虛寒、產(chǎn)后腰痛、陰虛消渴等，食用方法以刺身為主，在日本料理中具有“刺身絕品”之譽(yù)[1]，是極具商業(yè)價(jià)值的優(yōu)質(zhì)海水魚。其中鮮活斑石鯛售價(jià)最高，可達(dá)200 元·kg?1[2]。但當(dāng)前斑石鯛的運(yùn)輸還是停留在有水運(yùn)輸階段，運(yùn)輸過程需要大量的水輔助，運(yùn)輸途中由于斑石鯛的呼吸和排泄，水質(zhì)快速惡化，斑石鯛產(chǎn)生嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)，損傷免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致大量死亡，運(yùn)輸成活率偏低。因此如何減緩運(yùn)輸途中的應(yīng)激反應(yīng)，提高成活率，滿足市場需求，具有重要研究價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】無水活運(yùn)技術(shù)是一種綠色環(huán)保、無污染、安全、優(yōu)質(zhì)和高效的新型冷鏈活體物流技術(shù)[3]。該技術(shù)是通過物理降溫手段使活體處于休眠或半休眠狀態(tài)，降低新陳代謝速率，減緩應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)長時間運(yùn)輸?shù)耐瑫r，提高存活率[4?6]。研究表明[7?10]，物理降溫誘導(dǎo)休眠可以有效提高牙鲆（Paralichthysolivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、鯽 魚（Carassius auratus auratus）、珍珠 龍 膽 石 斑 魚 （♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus）、鯪魚（Cirrhinus molitorella）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）等魚類的運(yùn)輸時長和存活率，保證肌肉品質(zhì)的同時，有效降低皮質(zhì)醇、腎上腺素等激素的質(zhì)量濃度，緩解應(yīng)激反應(yīng)和機(jī)體損傷。以上研究充分說明部分水產(chǎn)品可以通過降溫誘導(dǎo)休眠的方式無水保活，但降溫方式多采用循環(huán)水系統(tǒng)或冷水機(jī)降溫，方式粗糙，難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)恒定降溫速率降溫。降溫速率的變化對魚類的應(yīng)激反應(yīng)和品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，張玉晗[4]等發(fā)現(xiàn)不同降溫速率對花鱸無水?；钚Ч町愶@著，3 ℃·h?1降溫處理的花鱸肝臟損傷程度低于1、5 ℃·h?1降溫組，這與加州鱸、鯽魚的研究結(jié)果一致[10?11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中生理應(yīng)激反應(yīng)的影響還缺乏相關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心自主研發(fā)的鮮活水產(chǎn)品智能冷馴化喚醒箱，精準(zhǔn)控制降溫速率，通過比較不同降溫速率條件下不同?；顣r間對魚體生理代謝指標(biāo)和應(yīng)激反應(yīng)的代表性激素變化情況，確定合理的降溫方法，為斑 石鯛無水?；钐峁├碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用斑石鯛購自山東萊州明波水產(chǎn)公司，挑選健康活躍、體表無損傷、大小均勻的60 尾成魚用于試驗(yàn)，個體初始體重（330 ± 46） g，暫養(yǎng)于國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心水產(chǎn)品控溫循環(huán)水過濾系統(tǒng)中，水溫（18 ± 1 ）℃，溶氧為6 mg·L?1以上，pH 為7～8，鹽度為31‰，暫養(yǎng)2 d 后進(jìn)行試驗(yàn)。

魚皮質(zhì)醇（Cortisol）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、魚腎上腺素（E）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒、乳酸（LAC）測試盒、糖原（Glycogen）測定試 劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動生化分析儀BK-280，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；紫外分光光度計(jì)T9S，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；Multiscan MK3 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)H205OR，湖南湖儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；醫(yī)用低溫保存箱DW-86L626，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；鮮活水產(chǎn)品智能冷馴化/喚醒箱，山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)（專利號ZL201310447777.8）；人工氣候箱QHX-300BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；水產(chǎn)養(yǎng)殖及循環(huán)水處理系統(tǒng)，青島中科海水處理設(shè)備工程有限公司；高速振蕩機(jī)CM-1000，上海愛朗儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S4，金壇市醫(yī)療儀器廠；電子天平JZ-06-004，上海菁海儀器有限公司；優(yōu)普系列超純水器UPR-11-10T；塑料自封袋、充氣泵、數(shù)字溫度計(jì)、秒表、5 mL 注射器 、解剖刀、紗布、抗凝管。

1 .3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冷馴化處理 通過自主設(shè)計(jì)的冷馴化智能降溫裝置完成對斑石鯛的冷馴化[12]。裝置按照1、3、5 ℃·h?1降溫速率將暫養(yǎng)池中的水溫從17.5～18.5 ℃降至生態(tài)冰溫點(diǎn)10 ℃，各組降溫時長分別為7.8 h、2.5 h、1.6 h，此時斑石鯛呼吸頻率（33±3） 次·min?1，失去平衡，腹部向上，魚鰓不能完全閉合，應(yīng)激反應(yīng)微弱，呼吸不規(guī)律，伴隨魚體劇烈扭動，對觸及反 應(yīng)已無明顯響應(yīng)。

1.3.2 無水?；?冷馴化處理后的斑石鯛裝入內(nèi)壁濕潤的自封袋內(nèi)，將空氣排空后，用封口機(jī)對塑料袋封口，充入氧氣，放進(jìn)人工氣候箱進(jìn)行無水?；?，?；顪囟雀鶕?jù)前期的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)定為10 ℃。試驗(yàn)組共分為3 組，每組樣品30 條。取樣時間點(diǎn)為：無水?；? h、2 h、4 h、6 h，各個時間點(diǎn)觀察記錄一次 成活率并隨機(jī)取出3 尾魚取樣進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.3 指標(biāo)測定 斑石鯛從人工氣候箱中取出后，尾靜脈取血，用規(guī)格為1 mL 的一次性注射器取血5 mL 以上，取出的血液在4 ℃冰箱放置5 h 后，4 ℃、12 000 r·min?1離心15 min，取上清液放入 80 ℃冰箱保存，取完血的斑石鯛放置在盛有冰塊的托盤中解剖，取出肝臟和肌肉，放入80 ℃冰箱保存。

（1）血清中皮質(zhì)醇、腎上腺素的測定

分別采用魚皮質(zhì)醇（Cortisol）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、魚腎上腺素（EPI）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測血清中皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度（ng·mL?1）和腎上腺素質(zhì)量濃度（ng·mL?1）。測定斑石鯛降溫前腎上腺素和皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度值分別為（45.34 ± 2.16） ng·mL?1、（58.09 ± 4.07） ng·mL?1。

（2）肝糖原、肌糖原、乳酸含量的測定

采用糖原（Glycogen）測定試劑盒分別檢測肝臟中肝糖原含量（mg·g?1）和肌肉中肌糖原含量（mg·g?1）；采用乳酸（LAC）測試盒檢測血清中乳酸含量（mmol·L?1）。測定斑石鯛降溫前肝糖原、肌糖 原、乳 酸 含 量 分 別 為（15.17 ± 2.56） mg·g?1、（1.38 ± 0.11） mg·g?1、（4.34 ± 0.46） mmol·L?1。

（3）血清生化指標(biāo)的分析

制備好的血清采用全自動生化分析儀測定生化指標(biāo)，項(xiàng)目包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血糖（GLU）；采用丙二醛（MDA）測試盒檢測血清中丙二醛含量（nmol·mL?1）。測定斑石鯛降溫前谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血糖、丙二醛 含 量 分 別 為（113.06 ± 4.27） U·L?1、（17.45 ±2.47） U·L?1、（4.35 ± 1.24） mmol·L?1、（1.45 ± 0.23）n mol·mL?1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異采用Duncan 多重比較法，圖表的繪制采用O rigin 2018 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中存活率的影響

如表1 所示，斑石鯛經(jīng)過冷馴化后無水?；?，各處理組存活率明顯下降，分別為60%、76.7%、46.7%。其中，5 ℃·h?1降溫組在保活2 h 便出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且隨著?；顣r間的延長，存活率不斷下降，為3 個處理組中最低。3 ℃·h?1降溫處理組經(jīng)過6 h 無水保活過程后，存活率最高，但仍與業(yè)界期望值存在差距。

表1 不同降溫速率下斑石鯛?；畈煌瑫r間的存活率Table 1 Survival rates of O. punctatus chilled at various temperature lowering rates out-of-water for different durations

2.2 不同降溫速率對斑石鯛無水保活過程中腎上腺素和皮質(zhì)醇的影響

如表2 所示，與斑石鯛降溫前腎上腺素質(zhì)量濃度（45.34 ± 2.16） ng·mL?1相比，各處理組試驗(yàn)魚無水?；? h，血清腎上腺素質(zhì)量濃度均明顯升高。無水?；钸^程中，3、5 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素呈下降趨勢，1 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素質(zhì)量濃度顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）；無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素質(zhì)量濃度顯著低于1 ℃·h?1降溫處理組，與5 ℃·h?1降溫處理組無顯著差異（P＞0.05）。無水?；钸^程中，3 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素質(zhì)量濃度除無水?；? h 外，均顯著低于1 ℃·h?1降溫處理組（P＜0.05）。同時，比較無水保活4～6 h， 1、3、5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛腎上腺素含量分別下降了56.9%、11.24%、25.26%。

表2 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钪醒迥I上腺素和皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度的影響Table 2 Effects of chilling rate on serum epinephrine and cortisol contents in survived O. punctatus under treatments

如表2 所示，冷馴化結(jié)束后，各處理組對比斑石鯛降溫前皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度[（58.09 ± 4.07）ng·mL?1]均升高。1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度隨保活時間延長總體呈現(xiàn)上升趨勢，5 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)下降趨勢。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）。保活4 h 后，1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇分別上升27.17%、30.98%。無水?；? h，5 ℃·h?1處理組血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著低于1 ℃·h?1處 理組（P＜0.05）。

2.3 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中AST、ALT 和MDA 活力的影響

如表3 所示，無水保活0 h，1、3、5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛AST、ALT 活力均明顯高于初始值[（113.06 ± 4.27） U·L?1、（17.45 ± 2.47） U·L?1]。同時，各試驗(yàn)組血清AST、ALT 活力呈現(xiàn)上升趨勢。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛血清AST、ALT 活力整體低于1、5 ℃·h?1降溫組。無水保活2～6 h，3 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛血清AST、ALT 活力顯著降低（P＜0.05）。

表3 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钪醒骞炔蒉D(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和丙二醛活力的影響Table 3 Effects of chilling rate on serum AST, ALT, and MDA activities in survived O. punctatus under treatments

如表3 所示，冷馴化結(jié)束后，試驗(yàn)組MDA 含量較降溫前（1.45 ± 0.23） nmol·mL?1均增加，且隨著保活時間的延長，MDA 含量呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，3 ℃·h?1降溫處理組MDA 增長速度整體平穩(wěn)于1、5 ℃·h?1降溫處理組。無水?；? h 及6 h，3 ℃·h?1降溫處理組 MDA 含量顯著低于1、5 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）。

2.4 同降溫速率對不斑石鯛無水?；钸^程中血糖、肝糖原、肌糖原和乳酸的影響

如表4 所示，各組降溫結(jié)束后斑石鯛血糖含量明顯高于降溫前含量[（4.35 ± 1.24） mmol·L?1]，隨?；顣r間的延長，1、5 ℃·h?1處理組血糖呈先上升后下降的趨勢，3 ℃·h?1處理組呈上升趨勢。無水保活0 h，5 ℃·h?1降溫處理組血糖含量顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）。無水?；? h，1、5 ℃·h?1降溫處理組對比無水?；? h，血糖含量分別下降7.5%、39.09%，3 ℃·h?1降溫處理組血糖含量繼續(xù)上升。

表4 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钪醒?、肝糖原、肌糖原和乳酸含量的影響Table 4 Effects of chilling rate on GLU, hepatic glycogen, muscle glycogen, and LAC contents in survived O. punctatus under treatments

如表4 所示，無水?；? h，各降溫試驗(yàn)組斑石鯛肝糖原均明顯低于降溫前含量[（15.17 ± 2.56）mg·g?1]，隨著?；顣r間的延長，3 個試驗(yàn)組呈現(xiàn)下降的趨勢，與血糖的趨勢相反。無水?；?～6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組肝糖原開始出現(xiàn)明顯上升趨勢，3 ℃·h?1降溫處理組肝糖原含量繼續(xù)下降。

如表4 所示，無水?；? h，各降溫處理組斑石鯛肌糖原含量均明顯低于降溫前含量[（1.38 ± 0.11）mg·g?1]。各降溫處理組肌糖原含量隨?；顣r間的延長呈下降趨勢，分別下降52.67%、44.92%、46.79%，1 ℃·h?1降溫處理組肌糖原下降幅度明顯高于3、5 ℃·h?1降溫組。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫組肌糖原顯著高于5 ℃·h?1降溫組。

如表4 所示，降溫結(jié)束后，各降溫試驗(yàn)組斑石鯛血清乳酸含量明顯高于降溫前含量[（4.34 ± 0.46）mmol·L?1]。各降溫試驗(yàn)組血清乳酸含量均隨?；顣r間的延長呈先下降后上升的趨勢。無水保活2 h，各處理組乳酸含量較0 h 下降，無水保活2～6 h，乳酸含量快速上升。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組乳酸含量顯著低于1、5 ℃·h?1降溫處理組（P＜0 .05）。

3 討論

3.1 不同降溫速率對斑石鯛無水保活過程中應(yīng)激反應(yīng)的影響

當(dāng)魚類受到刺激、損傷或死亡信號等指令，頭和腎作為主要組織，由嗜鉻細(xì)胞釋放大量的兒茶酚胺類激素（Catecholamine），導(dǎo)致血液中腎上腺素（EPI）含量顯著升高，使心跳加速、呼吸加快、血壓升高，為魚體活動提供更多能量并將血壓及時輸送至重要器官[13]；而后腦垂體受下丘腦釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（Corticotrophin releasing factor）刺激，分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic hormone）傳遞給腎間組織，由腎間組織產(chǎn)生以皮質(zhì)醇（Cortisol）為主的皮質(zhì)類固醇，并釋放到血液中，血液中皮質(zhì)醇含量的升高，可以加強(qiáng)能量動員，提高血糖水平，短期內(nèi)增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，相反，皮質(zhì)醇分泌過多，也會抑制機(jī)體免疫能力，導(dǎo)致機(jī)體受損[14]。因此腎上腺素和皮質(zhì)醇的檢測是機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后的常規(guī)檢測，也是直接判斷是否發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)和機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[15?16]。

孟振等[17]研究急性熱應(yīng)激對大菱鲆（Scophthalmus maximus）血液生化指標(biāo)時，發(fā)現(xiàn)溫度變化會使大菱鲆腎上腺素濃度升高，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說明斑石鯛在冷馴化過程中，受長時間低溫脅迫，嗜鉻細(xì)胞釋放腎上腺素提供能量，抵御低溫，維持生命活動。無水?；钸^程中，3、5 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素呈下降趨勢，因?yàn)榘呤犜谇捌诶漶Z化過程中，一直處于高速率降溫條件下，釋放了大量腎上腺素提供能量。1 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因?yàn)槔漶Z化過程中較低的降溫速率使斑石鯛逐漸適應(yīng)了慢性應(yīng)激源，自身能量維持生命活動的前提下，釋放少量腎上腺素進(jìn)行能量輔助[18]，而無水保活過程中靜態(tài)的溫度環(huán)境被斑石鯛側(cè)線器官感知引起腦神經(jīng)興奮，刺激腎上腺素的分泌，使得含量上升；5 ℃·h?1降溫處理組冷馴化結(jié)束后，血清腎上腺素質(zhì)量濃度明顯高于1、3 ℃·h?1降溫組，是因?yàn)榻禍厮俾矢撸禍刂辽鷳B(tài)冰溫點(diǎn)時間短，斑石鯛產(chǎn)生強(qiáng)烈應(yīng)激，大量釋放了頭和腎組織中嗜鉻細(xì)胞貯存的兒茶酚胺類激素，血液中腎上腺素濃度顯著升高。席峰[19]在研究環(huán)境脅迫對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的影響時發(fā)現(xiàn)應(yīng)激10 min 后，虹鱒血清腎上腺素升高了23 倍，這與本研究結(jié)果一致。無水?；钸^程中，3 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素含量一直維持在穩(wěn)定水平，同時，比較無水保活4～6 h，各降溫處理組斑石鯛腎上腺素濃度分別下降了56.9%、11.24%、25.26%，說明斑石鯛分泌腎上腺素的能力開始下降，意味著?；? h，魚體不同程度地受到了損傷，而3 ℃·h?1降溫組魚體損傷程度最低。

徐鋼春等[20]研究鹽度對長江刀鱭（Coilia nasus）運(yùn)輸脅迫應(yīng)激指標(biāo)的影響時發(fā)現(xiàn)，刀鱭經(jīng)過運(yùn)輸前處理后，血清皮質(zhì)醇含量顯著高于未處理組（P＜0.05），這與本研究結(jié)果一致，表明冷馴化使斑石鯛產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，且馴化結(jié)束后神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)不能及時恢復(fù)到應(yīng)激前的狀態(tài)。1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度總體呈現(xiàn)上升趨勢，表明斑石鯛通過動態(tài)冷馴化后，對溫度的變化產(chǎn)生適應(yīng)性，此時，斑石鯛進(jìn)行無水?；?，等同于人為因素將動態(tài)環(huán)境轉(zhuǎn)為靜態(tài)，誘使腎間組織分泌皮質(zhì)醇，使其達(dá)到較高水平來應(yīng)對不利因素；5 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)下降趨勢，表明隨著?；顣r間的延長，處于高值的血清皮質(zhì)醇會抑制斑石鯛免疫能力，使得腎間組織分泌皮質(zhì)醇的能力下降，這與鮭鱒魚類的研究一致[21]。無水保活0 h，5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組，這可能是因?yàn)槎虝r間快速降溫對斑石鯛產(chǎn)生的應(yīng)激更為劇烈。隨著?；顣r間的延長，1、3 ℃·h?1降溫組皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著上升（P＜0.05），這與劉驍?shù)萚22]研究團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）無水?；罱Y(jié)果一致。保活4 h 后，1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇分別上升27.17%、30.98%，Chen 等[23]發(fā)現(xiàn)將鯉魚置于4 ℃的水中6 h，皮質(zhì)醇含量快速上升，表明持續(xù)的低溫會使魚類皮質(zhì)醇含量上升。無水?；? h，5 ℃·h?1處理組血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著低于1 ℃·h?1處理組（P＜0.05）。以上研究表明，經(jīng)過5 ℃·h?1冷馴化后的斑石鯛，在無水?；钸^程中機(jī)體免疫能力受損，導(dǎo)致皮質(zhì)醇分泌能力下降，無法應(yīng)對不利因素維持正常生命活動[24]，合理解釋了無水?；顣r間的延長，降低了斑石鯛的存活率。3 ℃·h?1的降溫速率較1 、5 ℃·h?1更適用于斑石鯛降溫休眠。

3.2 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中肝臟的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是魚體細(xì)胞內(nèi)重要的功能酶，是魚類代謝過程中必不可少的催化劑，主要存在于肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性增加，AST和ALT 會被釋放到血液中，因此血清中AST 和ALT被認(rèn)為是肝功能和心臟是否正常的最具特異性和廣泛使用的指標(biāo)[25]。當(dāng)魚類在無水保活過程中一直處于不利環(huán)境，自身會遭受傷害，該過程體內(nèi)活性氧會不斷積累進(jìn)而誘發(fā)膜脂過氧化，膜脂過氧化的產(chǎn)物有脂類過氧化物、丙二醛（MDA）、乙烷等，其中MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可以通過測定 MDA 的含量了解膜脂過氧化的程度，以間接測定肝臟細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度[26]。

吳勝澤等[27]研究對鯽魚（Carassius auratus）無水?；顥l件下生理生化指標(biāo)的變化時發(fā)現(xiàn)，鯽魚經(jīng)過梯度降溫后，血清AST、ALT 活性顯著高于對照組，表明降溫處理會損傷肝臟，這與本研究結(jié)果一致。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛血清AST、ALT 活力整體低于1、5 ℃·h?1降溫組，是因?yàn)? ℃·h?1的降溫速率對斑石鯛進(jìn)行冷馴化，所需要的時間短、溫差小，能適當(dāng)減緩斑石鯛無水?；钸^程中的肝臟損傷，這與何蓉等[28]研究不同溫度無水活運(yùn)中華鱉（Trionyx Sinensis）結(jié)論一致。?；钸^程中，3 個試驗(yàn)組血清AST、ALT 活力均呈現(xiàn)上升趨勢，表明無水?；顣r間和降溫速率會對斑石鯛肝臟造成損傷，3 ℃·h?1降溫條件下的斑石鯛肝臟損傷程度最低。

冷馴化結(jié)束后，3 個試驗(yàn)組MDA 濃度均增加，且隨著?；顣r間的延長，MDA 濃度呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢。無水保活0 h，3 ℃·h?1降溫處理組MDA 濃度顯著低于1、5 ℃·h?1降溫組（P＜0.05），表明3 ℃·h?1降溫能夠有效降低斑石鯛體內(nèi)活性氧的積累，減輕氧化應(yīng)激。張玉晗等[4]研究低溫預(yù)處理對花鱸（Lateolabrax japonicus）無水活運(yùn)時間的影響時發(fā)現(xiàn)，不同的降溫速率會對花鱸無水運(yùn)輸產(chǎn)生劇烈脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成肝組織細(xì)胞大量損傷和凋亡，這與本研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果顯示，冷馴化速率和無水保活時間會對斑石鯛肝臟造成損傷，這可能是 斑石鯛無法進(jìn)行長時間無水?；畹闹匾?。

3.3 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中能量代謝的影響

血糖作為血液中最重要的能源物質(zhì)，是魚類各種生命活動所需能量的直接來源[29]。血糖在常態(tài)下會在血液中保持一個正常范圍，但是發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，肝糖原會分解為葡萄糖，使魚體血糖含量升高[30]。無水?；钸^程中，魚類為了保持正常狀態(tài)，以血糖代謝為主，將糖原物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，使葡萄糖含量增加，以此抵御寒冷。隨著?；顣r間的延長，葡萄糖被進(jìn)一步分解提供能量，此時葡萄糖濃度下降，機(jī)體與肝臟組織抵抗寒冷的能力也下降[31]。肌糖原是機(jī)體新陳代謝得以維持的重要能量來源，主要存在于肌肉中，是反應(yīng)外界環(huán)境應(yīng)激程度的重要指標(biāo)，其變化規(guī)律能清晰反映機(jī)體對環(huán)境的適應(yīng)情況[32]。乳酸是反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞是否缺氧的敏感標(biāo)志物，是肌糖原在缺氧狀態(tài)下，通過一系列酶促反應(yīng)產(chǎn)生的糖代謝產(chǎn)物，只能在肝臟和腎臟中清除，當(dāng)肝、腎受損時，會導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增高，血清乳酸含量升高。

各試驗(yàn)組降溫結(jié)束后斑石鯛血糖含量顯著高于降溫前，表明冷馴化過程中，斑石鯛為了御寒，將糖原物質(zhì)分解為葡萄糖。隨著?；顣r間的延長，各試驗(yàn)組呈先上升后下降的趨勢，說明葡萄糖被進(jìn)一步分解供能，這與范秀萍[33]研究低溫休眠對珍珠龍膽石斑魚（♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus）的脅迫響應(yīng)和機(jī)制時的結(jié)果一致。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫試驗(yàn)組血糖含量顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05），這可能是因?yàn)? ℃·h?1降溫組降溫速率高，溫差大，需要足夠多的葡萄糖供能。無水保活6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組較?；? h，血糖含量分別下降7.5%、39.09%，說明隨著?；顣r間的延長，斑石鯛為了維持正常生命活動，體內(nèi)葡萄糖被分解提供能量。紀(jì)利芹等[34]研究連續(xù)降溫對大菱鲆代謝機(jī)能時發(fā)現(xiàn)，溫度持續(xù)的降低，會加劇ATP 的消耗，活化葡萄糖酶，使葡萄糖含量下降，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。3 ℃·h?1降溫處理組血糖含量繼續(xù)上升，說明斑石鯛以3 ℃·h?1的速率冷馴化，應(yīng)激程度較1、5 ℃·h?1降溫組弱，葡萄糖酶處于低值。

張麗[35]研究大黃魚（Larimichthys crocea）?；钸\(yùn)輸技術(shù)時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過降溫后的大黃魚，肝糖原含量顯著低于未降溫組（P＜0.05），降溫引起大黃魚強(qiáng)烈應(yīng)激，誘使糖原磷酸化酶分解肝糖原，這與本研究結(jié)果一致。隨著?；顣r間的延長，3 個試驗(yàn)組呈現(xiàn)下降的趨勢，與血糖的趨勢相反，說明持續(xù)的低溫脅迫威脅斑石鯛生命，肝糖原分解提供能量，增強(qiáng)機(jī)體抗低溫脅迫能力。無水?；?～6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組肝糖原開始出現(xiàn)明顯上升趨勢，說明此時血液中葡萄糖被分解完全，而葡萄糖的來源一般是肝糖原分解提供，因此肝臟增加了肝糖原的合成。3 ℃·h?1降溫處理組肝糖原含量繼續(xù)保持下降，表明3 ℃·h?1冷馴化的斑石鯛體內(nèi)肝糖原的儲存量能夠滿足無水保活過程中的消耗，無需肝臟額外合成，同時對環(huán)境改變的適應(yīng)能力也更強(qiáng)，更適合無水?；?。

無水?；? h，各降溫試驗(yàn)組斑石鯛肌糖原含量均顯著低于降溫前，表明溫度下降使斑石鯛產(chǎn)生應(yīng)激，為了抵御寒冷壓力，利用糖原分解產(chǎn)生的能量供能。Nie 等[36]分析大菱鲆冷馴化過程生理學(xué)變化時發(fā)現(xiàn)，溫度迅速下降會使大菱鲆分解糖原和糖基化供能，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。而后，隨保活時間的延長，各降溫試驗(yàn)組肌糖原顯著降低，這可能是因?yàn)榘呤犜跓o水?；钸^程中呼吸方式為鰓部直接與空氣接觸，而該方式效率上不明確[37]，從而導(dǎo)致缺氧，肌糖原分解為乳酸。?；罱Y(jié)束，各降溫處理組肝糖原含量分別下降52.67%、44.92%、46.79%，1 ℃·h?1降溫處理組肌糖原下降幅度顯著高于3、5 ℃·h?1降溫組，可能是1 ℃·h?1降溫組冷馴化時間長，對斑石鯛肝臟產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致肌糖原的分解效率下降[38]。

降溫結(jié)束后，各降溫試驗(yàn)組斑石鯛血清乳酸含量明顯高于降溫前，說明斑石鯛接近生態(tài)冰溫點(diǎn)時應(yīng)激劇烈，導(dǎo)致肌糖原分解，乳酸含量升高，這與王彩霞等[11]探索加州鱸（Micropterus salmoides）生態(tài)冰溫點(diǎn)時的結(jié)果一致。整個無水保活過程，各降溫試驗(yàn)組血清乳酸含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。無水?；? h，各試驗(yàn)組乳酸含量下降，可能是斑石鯛新陳代謝緩慢，呼吸頻率逐漸減弱，且處于相對富氧的狀態(tài)。無水?；?～6 h，乳酸含量顯著上升（P＜0.05），說明斑石鯛長時間處于無水環(huán)境中，肝臟和腎臟嚴(yán)重?fù)p傷，無氧代謝加劇，乳酸在體內(nèi)無法及時清除產(chǎn)生積累。Virani 等[39]研究缺氧對墨西哥灣刺魚（gulf killifish）個體乳酸變化時發(fā)現(xiàn)，隨著缺氧時間的延長，墨西哥灣刺魚體內(nèi)乳酸呈上升趨勢，這與本研究結(jié)果一致。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組乳酸含量顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組，說明5 ℃·h?1降溫對斑石鯛機(jī)體損傷大，不適合作為斑 石鯛降溫休眠速率。

4 結(jié)論

本研究通過不同降溫速率開展斑石鯛的無水保活試驗(yàn)表明，斑石鯛可以通過冷馴化的方式進(jìn)行無水?；?，其中3 ℃·h?1降溫處理對斑石鯛產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)弱、肝臟損傷小，可以實(shí)現(xiàn)無水保活6 h。下一步可以借助現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，研究魚類應(yīng)激誘導(dǎo)生命體征波動與無水?；顣r間的動態(tài)關(guān)聯(lián)機(jī)制，闡明降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中生理應(yīng)激的影響調(diào)控機(jī)制。