歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞凋亡及自噬的影響

王利瑩，陸玉成，王麗娟，王蒙恩，韋志永，車峰遠(yuǎn)

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261000；2.臨沂市人民醫(yī)院生物樣本庫(kù)，山東 臨沂 276000；3.臨沂市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276000；4.臨沂市人民醫(yī)院病理科，山東 臨沂 276000)

膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，占腦惡性腫瘤的81%[1]，主要起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞[2]。膠質(zhì)瘤有豐富的新生血管網(wǎng)絡(luò)支持其浸潤(rùn)生長(zhǎng)，導(dǎo)致其生長(zhǎng)迅速且侵襲性高。目前，膠質(zhì)瘤的治療方法主要是手術(shù)切除輔以化學(xué)治療和放射治療，但化學(xué)治療的不良反應(yīng)和腫瘤的耐藥性嚴(yán)重影響患者的治療效果[3]。膠質(zhì)瘤患者平均生存期僅10.2～14.6個(gè)月，惡性膠質(zhì)瘤患者5 a生存率低于5%[4-5]。膠質(zhì)瘤患者的年齡、病灶切除范圍和病理類型等均可影響患者的生存率和復(fù)發(fā)率[6]。因此，迫切需要研究新的治療策略來(lái)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤患者的治療效果并延長(zhǎng)其生存時(shí)間。歐當(dāng)歸內(nèi)酯A(levistilide A，LA)是從傳統(tǒng)中藥川穹根里分離出來(lái)的一種天然化合物，由2個(gè)藁本內(nèi)酯聚合而成[7-8]。目前已有研究證實(shí)，LA通過(guò)活性氧介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑可促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。本研究旨在探討LA對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡及自噬的影響，以期為膠質(zhì)瘤的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。LA購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，滅活胎牛血清和青、鏈霉素雙抗及胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)和蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司，聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購(gòu)自美國(guó)APEXBIO公司。兔抗人p53一抗、鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白一抗、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)一抗、兔抗人caspase-3一抗、兔抗人微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(light chain 3，LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)-羊抗兔二抗和HRP-羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。Canto II流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，F(xiàn)luorchem E成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Proteins simple公司，ECLIPSE Ti顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將U251細(xì)胞接種于含有體積分?jǐn)?shù)10%熱滅活胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青、鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的全濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代，共傳代15次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞接種于96孔板中，每孔4 000個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)于含0、30、60、90 μmol·L-1LA的培養(yǎng)基中，干預(yù)24、48、72 h時(shí)加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃下培養(yǎng)2～3 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度，以吸光度值表示細(xì)胞增殖能力，吸光度值越大表示細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)U251細(xì)胞增殖抑制較弱的24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)LA作用時(shí)間。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞接種于6孔板中，每孔鋪150 000個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組，每組2個(gè)復(fù)孔，分別于含0、30、60、90 μmol·L-1LA的培養(yǎng)基中干預(yù)24 h，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)沖洗貼壁細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化，收集細(xì)胞，重懸后加入400 μL Annexin V結(jié)合液，加入5 μL FITC/PI室溫避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 3-MA抑制劑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞自噬能力根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)U251增殖能力影響較弱的1 mmol·L-1作為3-MA實(shí)驗(yàn)濃度，對(duì)U251細(xì)胞活性影響最大的90 μmol·L-1作為L(zhǎng)A單獨(dú)用藥濃度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞接種于96孔板中，每孔4 000個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、3-MA組、90 μmol·L-1LA組、30 μmol·L-1LA+3-MA組、60 μmol·L-1LA+3-MA組、90 μmol·L-1LA+3-MA組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入相應(yīng)濃度的3-MA和LA各50 μL，干預(yù)24 h，再加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)2～3 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度，以吸光度值表示細(xì)胞活性，吸光度值越大表示細(xì)胞活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡蛋白p53、Bax、Bcl-2、caspase-3和自噬蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表達(dá)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞接種于6孔板中，每孔鋪150 000個(gè)細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組，每組2個(gè)復(fù)孔。分別于0、30、60、90 μmol·L-1LA的培養(yǎng)基中干預(yù)24 h，用細(xì)胞刮板收集加藥干預(yù)后的U251細(xì)胞，置于離心管中，使用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用BCA法定量后，將蛋白質(zhì)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～15%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶封閉1 h，用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution with tween-20，PBST)清洗后加入p53(滴度11 000)、Bax(滴度11 000)、Bcl-2(滴度1：2 000)、caspase-3(滴度11 000)、LC3-Ⅰ(滴度11 000)、LC3-Ⅱ(滴度11 000)一抗及內(nèi)參GAPDH，4 ℃冰箱過(guò)夜孵育；第2天，PBST洗滌3次，室溫下加入HRP-羊抗兔二抗(滴度12 000)或HRP-羊抗鼠二抗(滴度13 000)，室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液試劑A和試劑B按11的比例混勻，每條PVDF膜加入200 μL混合液覆蓋，在暗室中使用Fluorchem E成像系統(tǒng)拍照獲取蛋白條帶照片，應(yīng)用Image J系統(tǒng)分析各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LA對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用比較結(jié)果見(jiàn)表1。培養(yǎng)24、48、72 h，30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組和90 μmol·L-1LA組的細(xì)胞增殖能力顯著低于空白組，60 μmol·L-1LA組和90 μmol·L-1LA組細(xì)胞增殖能力顯著低于30 μmol·L-1LA組，90 μmol·L-1LA組細(xì)胞增殖能力顯著低于60 μmol·L-1LA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。30 μmol·L-1LA組培養(yǎng)72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力顯著高于培養(yǎng)24、48 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24 h與48 h 時(shí)的細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。60 μmol·L-1LA組培養(yǎng)48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力顯著低于培養(yǎng)24 h時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)48 h與72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。90 μmol·L-1LA組培養(yǎng)48、72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力顯著低于培養(yǎng)24 h時(shí)，培養(yǎng)72 h時(shí)的細(xì)胞增殖能力顯著低于培養(yǎng)48 h時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組U251細(xì)胞增殖能力比較

2.2 不同濃度LA對(duì)U251細(xì)胞凋亡率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1?？瞻捉M、30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率分別為(2.89 ± 0.26)%、(13.5 ± 2.12)%、(22.74 ± 1.58)%、(25.75 ± 0.93)%?？瞻捉M、30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.600，P<0.05)。30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組，60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率顯著高于30 μmol·L-1LA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；60 μmol·L-1LA組與90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：空白組；B：30 μmol·L-1LA組；C：60 μmol·L-1LA組；D：90 μmol·L-1LA組。

2.3 6組U251細(xì)胞活性比較結(jié)果見(jiàn)表2。90 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA+3-MA組細(xì)胞活性低于空白組、3-MA組、30 μmol·L-1LA+3-MA組和60 μmol·L-1LA+3-MA組，90 μmol·L-1LA組細(xì)胞活性低于90 μmol·L-1LA+3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組、3-MA組、30 μmol·L-1LA+3-MA組、60 μmol·L-1LA+3-MA組細(xì)胞活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 6組U251細(xì)胞活性比較

2.4 4組U251細(xì)胞中p53、Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表3。30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組和90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中p53和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白組，30 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白組，90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白組、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；30 μmol·L-1LA組和60 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量及60 μmol·L-1LA組caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中p53、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于30 μmol·L-1LA組和60 μmol·L-1LA組，90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于30 μmol·L-1LA組，90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于60 μmol·L-1LA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；90 μmol·L-1LA組與60 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。60 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于30 μmol·L-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；60 μmol·L-1LA組與30 μmol·L-1組U251細(xì)胞中p53、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1:空白組；2：30 μmol·L-1 LA組；3：60 μmol·L-1 LA組；4：90 μmol·L-1 LA組。

表3 4組U251細(xì)胞p53、Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

2.5 4組U251細(xì)胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅱ比值比較結(jié)果見(jiàn)圖3和表4。4組U251細(xì)胞中LC3-Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著高于空白組和30 μmol·L-1LA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；30 μmol·L-1LA組與空白組U251細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，60 μmol·L-1LA組與 90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1:空白組；2：30 μmol·L-1 LA組；3：60 μmol·L-1 LA組；4：90 μmol·L-1 LA組。

表4 4組U251細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比較

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種生存率低且復(fù)發(fā)性高的惡性腫瘤，按細(xì)胞類型分為星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤或室管膜瘤[10]。近幾年來(lái)針對(duì)膠質(zhì)瘤的新型治療方法層出不窮，但其長(zhǎng)期治療效果仍不能令人滿意，且新型治療方法普及范圍局限。因此，對(duì)膠質(zhì)瘤的治療目前仍需要積極探索新的有效藥物。LA是從中藥川芎根中提取出來(lái)的一種抗腫瘤藥。研究表明，LA可通過(guò)活性氧途徑誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]；在乳腺癌細(xì)胞中可逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白介導(dǎo)的表達(dá)，增加對(duì)阿霉素和長(zhǎng)春新堿的敏感性[11]；同時(shí)也通過(guò)泛素途徑降低多藥耐藥蛋白1的表達(dá)來(lái)協(xié)同增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的K562/dox細(xì)胞凋亡[12]。

本研究結(jié)果顯示，30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組和90 μmol·L-1LA組的細(xì)胞增殖能力顯著低于空白組，60 μmol·L-1LA組和90 μmol·L-1LA組細(xì)胞增殖能力顯著低于30 μmol·L-1LA組，90 μmol·L-1LA組細(xì)胞增殖能力顯著低于60 μmol·L-1LA組；30 μmol·L-1LA組培養(yǎng)72 h時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著高于24、48 h時(shí)，60 μmol·L-1LA組培養(yǎng)48、72 h 時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著低于24 h時(shí)，90 μmol·L-1LA組培養(yǎng)48、72 h 時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著低于24 h，培養(yǎng)72 h時(shí)細(xì)胞增殖能力顯著低于48 h時(shí)；30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組，60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組細(xì)胞凋亡率顯著高于30 μmol·L-1LA組；90 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA+3-MA組細(xì)胞活性顯著低于空白組、3-MA組、30 μmol·L-1LA+3-MA組和60 μmol·L-1LA+3-MA組，90 μmol·L-1LA組細(xì)胞活性顯著低于 90 μmol·L-1LA+3-MA組。以上研究結(jié)果提示，LA能夠抑制U251細(xì)胞的增殖，促進(jìn)U251細(xì)胞的凋亡及自噬，且與作用濃度和時(shí)間有一定相關(guān)性。

細(xì)胞主要有內(nèi)源性和外源性2種凋亡途徑[13]，caspase-3在2種途徑中均起一定作用。p53可誘導(dǎo)大量基因參與細(xì)胞凋亡，其既可通過(guò)誘導(dǎo)BH3-only蛋白導(dǎo)致線粒體外膜通透化參與內(nèi)源性凋亡途徑，也可通過(guò)Fas和Dr5參與外源性凋亡途徑[13-15]。Bcl-2蛋白家族能夠調(diào)節(jié)內(nèi)源性凋亡途徑[15]，Bax作為Bcl-2蛋白家族的成員之一，在凋亡中起著重要的促進(jìn)作用[16]。Bcl-2則屬于抗凋亡蛋白，通過(guò)螯合Bim來(lái)阻止Bax和Bak的激活來(lái)抗凋亡[14]。Bcl-2、Bax在腫瘤中的表達(dá)量是否平衡決定凋亡過(guò)程的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，30 μmol·L-1LA組、60 μmol·L-1LA組和90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中p53和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白組，30 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白組，90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白組、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白組；90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中p53、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量低于30 μmol·L-1LA組和60 μmol·L-1LA組，90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于 30 μmol·L-1LA組， 90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于 60 μmol·L-1LA組，60 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞中Bax、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量高于 30 μmol·L-1組。這一結(jié)果說(shuō)明，LA通過(guò)增加p53、Bax、caspase-3蛋白和減少Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量調(diào)控U251細(xì)胞的凋亡，且與作用濃度有一定相關(guān)性，但完整的機(jī)制、信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

在腫瘤發(fā)生的早期，自噬可阻止腫瘤的發(fā)生并抑制癌癥的進(jìn)展[17]；一旦腫瘤發(fā)展到晚期，作為動(dòng)態(tài)降解和再循環(huán)系統(tǒng)的自噬將有助于腫瘤的存活和生長(zhǎng)，且可增加癌癥的侵襲性[18]。LC3在細(xì)胞自噬成熟過(guò)程中被自噬相關(guān)基因(autophagy-related gene，ATG)4切割產(chǎn)生LC3-Ⅰ，ATG7和ATG3將LC3-Ⅰ結(jié)合到磷脂酰乙醇胺上形成脂溶性LC3-Ⅱ[18]。自噬體中LC3的存在以及轉(zhuǎn)化成向下遷移的 LC3-Ⅱ是形成自噬小體的關(guān)鍵步驟，也是自噬發(fā)生的標(biāo)志[19]。在應(yīng)激條件下，自噬可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，而凋亡途徑阻止癌細(xì)胞的存活，自噬和凋亡作為2種分解代謝途徑，對(duì)腫瘤微環(huán)境至關(guān)重要且聯(lián)系復(fù)雜。Bcl-2被認(rèn)為為自噬和凋亡的中樞調(diào)節(jié)因子，在應(yīng)激條件下，c-Jun氨基酸末端激酶-1被激活，該酶調(diào)節(jié)Bcl-2的磷酸化，使Bcl-2從Beclin-1和Bax中被取代出來(lái)，以分別誘導(dǎo)自噬和凋亡[20-22]。此外，caspase家族作為眾所周知的凋亡蛋白，也參與了自噬的過(guò)程，它們通過(guò)與自噬相關(guān)蛋白的相互作用和切割來(lái)阻礙或增強(qiáng)自噬[23]。本研究結(jié)果顯示，4組U251細(xì)胞LC3-Ⅰ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；60 μmol·L-1LA組、90 μmol·L-1LA組U251細(xì)胞LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-II/LC3-I比值顯著高于空白組和30 μmol·L-1LA組；說(shuō)明，LA可能通過(guò)LC3途徑影響自噬通路，但其上下游相關(guān)分子還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，LA能夠通過(guò)增加凋亡蛋白p53、Bax、caspase-3和減少Bcl-2蛋白的表達(dá)，以及增加自噬蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)，抑制U251細(xì)胞的增殖，促進(jìn)U251細(xì)胞的凋亡及自噬，這為臨床上LA治療膠質(zhì)瘤提供了理論依據(jù)。但關(guān)于LA促進(jìn)U251細(xì)胞的凋亡及自噬完整的機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。