LncRNA GATA3-AS1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖遷移及其機(jī)制

江 琪，習(xí)一清，魏 蕾

1. 武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室（武漢 430071）

2. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院甲乳外科（武漢 430071）

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)已超肺癌，位居女性癌癥發(fā)病人數(shù)的首位[1]。2020年，我國女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡例數(shù)分別位列第一及第四位，嚴(yán)重威脅女性健康[2]。近幾十年來，盡管包括手術(shù)切除、化放療、靶向治療等在內(nèi)的綜合治療手段有效改善了乳腺癌患者的預(yù)后，但局部進(jìn)展及合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的中位生存期仍然較短（約24個(gè)月）[3]，因此加強(qiáng)對乳腺癌新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的深入探索具有重要的意義。

LncRNA是一類超過200個(gè)堿基，且?guī)缀鯚o法編碼蛋白質(zhì)的RNA[4]。LncRNA涉及多種生物事件，并可參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展，是敏感和特定的癌癥生物標(biāo)志物之一[5-8]。根據(jù)鄰近編碼基因的染色體區(qū)域，可將LncRNA分為正義LncRNA、反義LncRNA、雙向LncRNA、內(nèi)含子LncRNA和基因間LncRNA五類[9]。研究表明，越來越多的反義LncRNA在腫瘤中起調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用[10]。例如，LncRNA FEZF1-AS1通過靶向miR-30a/Nanog軸促進(jìn)乳腺腫瘤的發(fā)生[11]；LncRNA PCNA-AS1在肝細(xì)胞癌中促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]；LncRNA AFAP1-AS1在非小細(xì)胞肺癌中促進(jìn)細(xì)胞遷移[13]等。

LncRNA GATA3-AS1是一種新型反義LncRNA，與T細(xì)胞發(fā)育和分化有關(guān)[14]。GATA3-AS1已被證實(shí)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖和遷移[15]，但其在乳腺癌中的作用及其機(jī)制報(bào)道較少，因此本文擬研究GATA3-AS1在乳腺癌中的生物作用并對其分子機(jī)制進(jìn)行初步探索，為乳腺癌新型生物標(biāo)志物與藥物靶點(diǎn)的探索提供新思路。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

通過 UALCAN在線數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）和 bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫（http://bcgenex.ico.unicancer.fr/BC-GEM/GEM-requete.php）分析多種腫瘤組織和乳腺癌中GATA3-AS1與GATA3的表達(dá)情況，以及不同臨床和病理參數(shù)乳腺癌患者中GATA3-AS1與GATA3的表達(dá)差異。運(yùn)用lncATLAS在線數(shù)據(jù)庫（https://lncatlas.crg.eu/）預(yù)測GATA3-AS1的細(xì)胞定位，并通過starBase數(shù)據(jù)庫（https://starbase.sysu.edu.cn/）在線預(yù)測GATA3-AS1與GATA3的表達(dá)相關(guān)性。GATA3-AS1與GATA3的生存分析由Kaplan-Meier Plotter數(shù) 據(jù) 庫（https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast）中提供的乳腺癌數(shù)據(jù)分析獲得。以上結(jié)果均認(rèn)為P＜0.05時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺上皮細(xì)胞MDA-MB-10A和兩種乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、MCF-7）購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。MDAMB-10A細(xì)胞在37℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞均在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中添加1%的青霉素和鏈霉素。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

特異性shRNA和NC-shRNA購于GenePharma公司，使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，美國）對 MDA-MB-231和 MCF-7細(xì)胞中的LncRNA GATA3-AS1進(jìn)行沉默。

1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞按照每孔2×103個(gè)的密度接種于96孔板，使用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔中加入10 μL的CCK8試劑（北京莊盟生物），37℃孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞450 nm處的吸光度值。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞2×105個(gè)/mL接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%密度時(shí)，使用黃色移液器直線刮擦細(xì)胞，PBS洗滌劃痕處兩次除去漂浮細(xì)胞，于0 h拍攝劃痕寬度，在含5%血清培養(yǎng)基中持續(xù)孵育48 h后，再次拍攝并計(jì)算劃痕寬度及傷口愈合率。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，加入transwell小室（康寧公司）的上腔室，并在transwell下腔室中加入600 μL含1%雙抗和10%胎牛血清的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后固定細(xì)胞，并用0.5%結(jié)晶紫染色，擦去上腔室內(nèi)部細(xì)胞后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)下腔表面的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR

采用TRIzol試劑（Invitrogen，美國）從細(xì)胞中提取總RNA，通過觀察瓊脂糖凝膠電泳中28S條帶與18S條帶的比值檢測RNA的純度和完整性；使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo，美國）將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在CFX96 real-time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR程序；使用10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Bio-Red，美國）、200 nM正向和反向引物、100 ng cDNA模板，用雙蒸餾水使最終反應(yīng)體系為20 μl。PCR條件設(shè)置為：95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，50個(gè)周期。目的基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt法測定，并以GAPDH為內(nèi)參，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。其中引物訂購于武漢擎科生物公司。

1.2.7 核質(zhì)分離

使用Ambion PARIS?（Thermo）試劑盒，按照說明書內(nèi)容從細(xì)胞中分離細(xì)胞質(zhì)和核RNA，并進(jìn)行純化。使用qRT-PCR檢測GATA3-AS1的表達(dá)水平。

1.2.8 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

首先，使用增強(qiáng)的RIPA裂解緩沖液（北京索拉博）從細(xì)胞中提取總蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒（上海翊圣生物）對提取的蛋白進(jìn)行定量；其次，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，采用濕轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上；再次，使用5%脫脂牛奶對膜進(jìn)行封閉處理，且敷育相應(yīng)的抗體；最后經(jīng)TBST沖洗后，用顯像液顯像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，研究數(shù)據(jù)以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)和方差分析比較各組數(shù)據(jù)之間的差異，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GATA3-AS1在乳腺癌中的表達(dá)量與預(yù)后相關(guān)

通過UALCAN在線數(shù)據(jù)庫對GATA3-AS1進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)GATA3-AS1在多種腫瘤組織中存在差異表達(dá)（圖1-A），且相較正常乳腺組織，GATA3-AS1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯升高（圖1-B）。根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的兩個(gè)GATA3-AS1探針（240192_at和 240827_at），Kaplan-Meier生存曲線提示GATA3-AS1表達(dá)與乳腺癌總生存期顯著負(fù)相關(guān)，即高表達(dá)GATA3-AS1的乳腺癌患者預(yù)后較差（圖1-C）。

圖1 GATA3-AS1的表達(dá)水平與預(yù)后分析Figure 1. The relationship between the expression level of GATA3-AS1 and the prognosis of breast cancer

利用bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫分析不同臨床和病理參數(shù)乳腺癌患者中GATA3-AS1的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)GATA3-AS1的表達(dá)與乳腺癌患者年齡之間存在顯著相關(guān)性，年齡≤51歲的患者GATA3-AS1表達(dá)水平明顯低于年齡＞51歲的患者（圖2-A）。同時(shí)，GATA3-AS1的表達(dá)與Scarff-Bloom-Richardson（SBR）等級（圖2-B）以及P53基因突變（圖2-C）也存在顯著相關(guān)性。此外，GATA3-AS1在人類表皮生長因子受體2陰性（HER2-）、雌激素受體陽性（ER+）和孕激素受體陽性（PR+）的乳腺癌患者中表達(dá)量明顯上調(diào)（圖2-D、圖2-E和圖2-F）。相較于基底細(xì)胞樣型（Basallike）和三陰性乳腺癌（TNBC），GATA3-AS1在非基底細(xì)胞樣型和非三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平更高（圖2-G和圖2-H）。綜合數(shù)據(jù)庫中GATA3-AS1在乳腺癌各類分子亞型中表達(dá)水平可看出，激素受體A陽性（luminal A）乳腺癌GATA3-AS1表達(dá)水平顯著高于其他亞型（圖2-I）。另外，lncATLAS在線數(shù)據(jù)庫顯示GATA3-AS1在人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）中主要分布于細(xì)胞核內(nèi)（圖2-J），表明該LncRNA可能參與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

圖2 bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫關(guān)于GATA3-AS1的表達(dá)水平與乳腺癌不同臨床病理特征關(guān)系的分析Figure 2. The relationship between the expression level of GATA3-AS1 and different clinicopathological features of breast cancer was analysed via bc-GenExMiner online database

2.2 GATA3-AS1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移

本研究通過qRT-PCR對人類乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231和MCF-7）以及正常乳腺上皮細(xì)胞系（MCF-10A）中GATA3-AS1的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與MCF-10A細(xì)胞相比，GATA3-AS1在MDA-MB-231和MCF-7中顯著高表達(dá)（P＜0.001，圖3-A）。核質(zhì)分離提示GATA3-AS1主要位于MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞核內(nèi)（圖3-B），推測GATA3-AS1可能通過影響乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，通過shRNA獲得低表達(dá)GATA3-AS1的乳腺癌細(xì)胞株，對該細(xì)胞株的多種生物功能變化進(jìn)行觀察，qRT-PCR證實(shí)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的GATA3-AS1可被shRNA有效沉默（P＜0.001），且sh1的沉默效率高于sh2，達(dá)到80%（圖3-C）。因此，本研究使用sh1進(jìn)行后續(xù)體外功能實(shí)驗(yàn)。

圖3 GATA3-AS1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移Figure 3. GATA3-AS1 promotes breast cancer cell proliferation and migration

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，沉默GATA3-AS1后， MDA-MB-231和MCF-7的增殖速度明顯下降（P＜0.001，圖3-D）。后續(xù)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默GATA3-AS1明顯抑制了乳腺癌細(xì)胞的二維及三維遷移能力（P＜0.001，圖3-E、圖3-F）。

2.3 乳腺癌組織中GATA3的表達(dá)與GATA3-AS1正相關(guān)

starBase和 UALCAN數(shù)據(jù)庫均發(fā)現(xiàn) GATA3-AS1的蛋白編碼基因GATA3在乳腺癌中的表達(dá)與GATA3-AS1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖4-A），且GATA3在乳腺癌中表達(dá)水平高于正常乳腺組織（P＜0.001，圖4-B）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，GATA3的表達(dá)與乳腺癌的總生存期顯著正相關(guān)（圖4-C）。利用bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫分析不同臨床和病理參數(shù)的乳腺癌患者GATA3的表達(dá)差異，結(jié)果顯示GATA3在年齡≤51歲的患者中表達(dá)水平明顯低于年齡＞51歲者（圖5-A），且與SBR等級（圖5-B）以及P53基因突變（圖5-C）存在顯著相關(guān)。此外，GATA3在乳腺癌各分子分型上的表達(dá)差異與GATA3-AS1的表達(dá)趨勢基本一致（圖5-D、圖5-I）。

圖4 與GATA3-AS1表達(dá)相關(guān)基因的預(yù)測Figure 4. Prediction of genes that associated with GATA3-AS1 expression

圖5 bc-GenExMiner在線數(shù)據(jù)庫對GATA3的表達(dá)水平與乳腺癌不同臨床病理特征關(guān)系的分析Figure 5. The relationship between the expression level of GATA3 and different clinicopathological features of breast cancer was analysed via bc-GenExMiner online database

2.4 沉默GATA3-AS1導(dǎo)致GATA3蛋白水平上升

本研究對GATA3-AS1與其蛋白編碼基因GATA3所表達(dá)的蛋白進(jìn)行相關(guān)性分析。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默GATA3-AS1后，MDAMB-231和MCF-7細(xì)胞中的GATA3蛋白水平隨之上升（圖6，P＜0.01）。

圖6 沉默GATA3-AS1之后GATA3蛋白水平上升Figure 6. The protein level of GATA3 increases after the silencing of GATA3-AS1

3 討論

LncRNA在細(xì)胞生長和分化、免疫激活/失活、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[16]。近期研究證實(shí)多種LncRNA參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，如LncRNA HOTAIR通過激活STAT3信號通路，參與乳腺癌組織的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]；LncRNA FGF13-AS1通過抑制乳腺癌細(xì)胞糖酵解和干性特性起腫瘤抑制作用[18]。作為基因反義鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，反義LncRNA也參與了疾病復(fù)雜的病理生理過程[19]。GATA3-AS1作為一種新型反義LncRNA，在人類CD4+T細(xì)胞亞群中首次被發(fā)現(xiàn)[20]。Zhu等應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對人類膀胱癌組織中的LncRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GATA3-AS1在膀胱癌組織中顯著上調(diào)[21]。Luo等研究也證實(shí)GATA3-AS1可通過沉默抑癌基因促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]。

本研究對乳腺癌細(xì)胞中GATA3-AS1表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示相較正常的乳腺細(xì)胞，GATA3-AS1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，GATA3-AS1高表達(dá)的乳腺癌患者預(yù)后較差，推測在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中，GATA3-AS1發(fā)揮促癌作用。bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫分析顯示，GATA3-AS1在非基底細(xì)胞樣型和非三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平顯著高于基底細(xì)胞樣型和三陰性乳腺癌，而共識認(rèn)為三陰性乳腺癌往往預(yù)后較差。導(dǎo)致結(jié)果矛盾的原因可能為：首先，在UALCAN數(shù)據(jù)庫中有關(guān)GATA3-AS1生存分析的對象是未分層的全體乳腺癌患者，未對乳腺癌亞型進(jìn)行分層預(yù)測；其次，不同數(shù)據(jù)庫間納入的樣本存在差異，結(jié)果不具有嚴(yán)格意義上的可比性；最后，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受多基因多因素綜合調(diào)控，且不同亞型乳腺癌中，LncRNA發(fā)揮的作用可能不盡相同。盡管如此，上述生物信息學(xué)分析結(jié)果提示GATA3-AS1作為潛在生物標(biāo)志物，在乳腺癌早期預(yù)測、療效評價(jià)及預(yù)后評估方面具有一定價(jià)值。然而，GATA3-AS1與乳腺癌預(yù)后關(guān)系及其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制，仍需大樣本、分層深入的研究。

本研究還利用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7對GATA3-AS1進(jìn)行了體外功能實(shí)驗(yàn)，下調(diào)GATA3-AS1的表達(dá)抑制了MDA-MB-231和MCF-7的增殖和遷移能力，證實(shí)GATA3-AS1可能在乳腺癌的進(jìn)展中起促癌作用。研究進(jìn)一步對GATA3-AS1在乳腺癌中發(fā)揮的作用機(jī)制進(jìn)行探討。通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GATA3-AS1的蛋白編碼基因GATA3在乳腺癌中的表達(dá)與GATA3-AS1呈正相關(guān)。有研究表明，反義LncRNA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與其蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并在一起，可能與mRNA的基因啟動(dòng)子或近端增強(qiáng)子存在競爭關(guān)系，進(jìn)而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄過程[22-24]。

GATA3在淋巴細(xì)胞、乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)耳和甲狀旁腺等多種人體組織中均有表達(dá)，且其表達(dá)是這些器官發(fā)育的基礎(chǔ)，它的失調(diào)與急性T細(xì)胞淋巴樣白血病、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、感音神經(jīng)性耳聾和甲狀旁腺機(jī)能減退等多種疾病相關(guān)[25]。其中，GATA3的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)已有一定研究基礎(chǔ)。Mehra等報(bào)道了高表達(dá)GATA3患者10年生存率高于低表達(dá)患者（84% vs. 55%），表明低表達(dá)GATA3提示預(yù)后不良[26]。另一項(xiàng)為期10年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，與低表達(dá)GATA3腫瘤相比，高表達(dá)GATA3的腫瘤發(fā)生激素?zé)o反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)降低了近90%，且預(yù)后更好[27]。GATA3作為腫瘤抑制因子[28-29]，是GATA3-AS1的蛋白編碼基因，且又與GATA3-AS1共享一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域[30]。此外，核質(zhì)分離證實(shí)GATA3-AS1定位于MDA-MB-231和MCF-7的細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)一步通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中下調(diào)GATA3-AS1表達(dá)后，GATA3蛋白水平明顯上升，即二者的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。然而，此結(jié)果與starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果相反。究其原因，一方面可能是在運(yùn)用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測二者表達(dá)量之間關(guān)系時(shí)，是在mRNA水平分析獲得，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在蛋白水平上實(shí)踐得出，結(jié)果之間可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控所致的表達(dá)差異；另一方面，GATA3被認(rèn)為是乳腺建立和發(fā)育過程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子，在乳腺癌中參與多種分子調(diào)控機(jī)制[31-35]，因此GATA3蛋白的表達(dá)受多基因影響，并不一定完全由GATA3-AS1調(diào)控。由此猜測GATA3-AS1可能通過抑制其蛋白編碼基因GATA3的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展，可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

生存分析顯示，高表達(dá)GATA3的乳腺癌患者預(yù)后更好，與既往研究一致。此外，通過bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫對不同臨床和病理參數(shù)的乳腺癌患者GATA3的表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示具有抑癌作用的GATA3與具有促癌機(jī)制的GATA3-AS1在表達(dá)量方面與乳腺癌患者的臨床病理特征間的相關(guān)性趨勢十分相似。這是否意味著GATA3-AS1與GATA3之間存在某種平衡，尚有待進(jìn)一步研究。

基于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)可知，GATA3-AS1在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。GATA3-AS1可能通過抑制其蛋白編碼基因GATA3的表達(dá)，參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。