氯化鈷誘導(dǎo)缺氧環(huán)境對肝癌MHCC97-H細(xì)胞的影響

蘇曉茹　　貴志芳　　柯強(qiáng)　　鄭高明　　潘峰

[摘要] 目的 探討CoCl2誘導(dǎo)缺氧環(huán)境對肝癌MHCC97-H細(xì)胞產(chǎn)生的影響，研究CoCl2處理下MHCC97-H細(xì)胞中相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化及細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。方法 分別在對照組（21% O2）和實驗組（20 μmol/L CoCl2）處理下培養(yǎng)MHCC97-H細(xì)胞，用Western-blot法檢測細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)（HIF2α、G9a、Reptin），于0 h、6 h、24 h、48 h、72 h用CCK8法檢測細(xì)胞增殖，于6 h、24 h時用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果 與對照組相比，CoCl2處理的MHCC97-H細(xì)胞中HIF2α、G9a、Reptin蛋白質(zhì)表達(dá)顯著升高（P<0.05），細(xì)胞活力降低，72 h細(xì)胞活力顯著低于對照組（P<0.05），24 h后細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.05）。 結(jié)論 CoCl2處理可對肝癌MHCC97-H細(xì)胞產(chǎn)生明顯影響，20 μmol/L CoCl2即可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著變化，影響細(xì)胞的活力和凋亡。

[關(guān)鍵詞] 氯化鈷;肝癌MHCC97-H細(xì)胞;細(xì)胞活力;細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R73? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）09-0026-04

Effect of cobalt chloride-induced hypoxic environment on hepatocarcinoma MHCC97-H cells

SU Xiaoru GUI Zhifang KE Qiang ZHENG Gaoming PAN Feng

Department of Laboratory Medicine， the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University， Hangzhou? ?310015， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of CoCl2-induced hypoxic environment on the hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells， and to study the changes of related protein expression levels， cell viability， and apoptosis in MHCC97-H cells treated with CoCl2. Methods MHCC97-H cells were cultured under the treatment of the control group （21% O2） and the experimental group （20 μmol/L CoCl2）. The protein expression （HIF2α， G9a， Reptin） in the cells was detected by the Western-blot method. Cell proliferation was detected by the CCK8 method at 0 h， 6 h， 24 h， 48 h， and 72 h. Cell apoptosis was detected by flow cytometry at 6 h， 24 h. Results Compared with the control group， HIF2α， G9a， and Reptin protein expression was significantly increased （P<0.05）， cell viability was decreased， cell viability was significantly lower （P<0.05） at 72 hours， and apoptosis was significantly increased （P<0.05） after 24 hours in CoCl2-treated MHCC97-H cells. Conclusion CoCl2 treatment can have a significant effect on hepatocarcinoma MHCC97-H cells. 20 μmol/L CoCl2 can cause significant changes in the expression of related proteins in the cells and affect cell viability and apoptosis.

[Key words] Cobalt chloride; Hepatocarcinoma MHCC97-H cell; Cell viability; Apoptosis

原發(fā)性肝癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，主要包括肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）和肝內(nèi)膽管癌兩種組織學(xué)類型，其中HCC占肝臟惡性腫瘤的75%～85%，是我國較為常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高、預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1-3]。手術(shù)治療仍為首選手段，但效果并不十分理想，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%[4]，如何降低HCC轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點[5-6]。

缺氧是HCC最常見的微環(huán)境，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤等均密切相關(guān)[7-9]。研究缺氧環(huán)境癌細(xì)胞的生長特性有助于了解轉(zhuǎn)移、浸潤的本質(zhì)。用CoCl2誘導(dǎo)缺氧，適于快速建立穩(wěn)定的體外細(xì)胞缺氧模型。而不同腫瘤細(xì)胞對CoCl2反應(yīng)劑量可能不同[10-11]。目前關(guān)于肝癌MHCC97-H細(xì)胞對CoCl2反應(yīng)劑量的報道較少。本研究旨在探討CoCl2誘導(dǎo)缺氧對MHCC97-H細(xì)胞產(chǎn)生的影響，探討細(xì)胞中相關(guān)蛋白質(zhì)水平變化及細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況，為未來利用CoCl2構(gòu)建MHCC97-H相關(guān)缺氧模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞和試劑

人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H購于上海酶研生物科技有限公司（批號：CC-Y1613）。FBS（批號：E600001）、DMEM培養(yǎng)基（批號：E600003）、氯化鈷（批號：A600316）、CCK-8試劑盒（批號：E606335）、Annexin V 凋亡檢測試劑盒（批號：E606336）均來自BBI生命科學(xué)有限公司，HIF2α抗體（批號：ab207607）、G9a抗體（批號：ab185050）、Reptin抗體（批號：ab196027）均來自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞用10% FBS加DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2濃度培養(yǎng)箱中，生長到90%以上時傳代。將對數(shù)生長期的細(xì)胞在96孔板中配置100 μL 2×104個/ml的細(xì)胞懸液。設(shè)對照組（21% O2）和實驗組（20 μmol/L CoCl2），每組5個復(fù)孔。

1.3 Western blot檢測

按實驗分組培養(yǎng)細(xì)胞24 h，加100 μL裂解液使細(xì)胞裂解。取10 μL裂解物加入10 μL 2×SDS-PAGE loading buffer，100℃，5 min，冰上冷卻3 min。室溫12 000 g離心10 min去除不溶性沉淀，提取總蛋白并測定蛋白濃度。

用10% SDS-PAGE電泳分離樣本。結(jié)束后，將PVDF膜在甲醇中浸泡1 min，用Transfer Buffer浸泡凝膠、濾紙和在甲醇中浸泡過的PVDF膜10 min，制備轉(zhuǎn)移三明治。使用Semi-Dry Cell進(jìn)行半干電泳轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移完畢，用1×Ponseau S solution染色并標(biāo)記蛋白質(zhì)條帶位置。用Blocking Buffer封閉轉(zhuǎn)印膜2 h。加入稀釋一抗，4℃過夜。加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。用Super Signal West Pico Chemiluminent Substrates進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，對X線片曝光。經(jīng)顯影定影后，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，用Gel-Pro Analyzer軟件分析。

1.4細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞預(yù)先培養(yǎng)24 h（37℃，5% CO2）。對照組（21% O2）加正常培養(yǎng)液，實驗組加20 μmol/L CoCl2，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段時間（6 h、24 h、48 h、72 h）。按照試劑盒說明書，向每孔加10 μLCCK8溶液，在培養(yǎng)箱孵育1 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，計算細(xì)胞活力并繪制生長曲線。

1.5細(xì)胞凋亡檢測

采用 PBS 洗細(xì)胞培養(yǎng)板兩次，用胰酶消化，1000 rpm 離心5 min，棄去培養(yǎng)液，各管加10 ml PBS，輕柔地懸浮細(xì)胞，計數(shù)1×105細(xì)胞，放入100 μl 1× Binding Buffer，加入ANNEXIN V 5 μl孵育20 min，加PI 3 μl 孵育10 min，室溫避光，加入400 μl Binding Buffer，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

以上實驗重復(fù)至少三次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用Graphpad prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Bonferroni′s 多重比較檢驗分析方法（Bonferroni′s multiple comparisons test），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組與對照組MHCC97-H細(xì)胞形態(tài)觀察

按照實驗分組培養(yǎng)肝癌MHCC97-H細(xì)胞，24 h后，顯微鏡下觀察：對照組MHCC97-H細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞的胞漿豐富，呈多邊形，相鄰細(xì)胞多緊密融合成片，而實驗組培養(yǎng)基中漂浮細(xì)胞較多，細(xì)胞則變得相對稀疏，見圖1。

2.2實驗組與對照組MHCC97-H細(xì)胞相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)情況

按照實驗分組培養(yǎng)肝癌MHCC97-H細(xì)胞，24 h后提取總蛋白，Westernblot方法檢測細(xì)胞中HIF2α、G9a、Reptin表達(dá)，結(jié)果表明，與對照組相比，CoCl2處理的MHCC97-H細(xì)胞中HIF2α，G9a和Reptin蛋白表達(dá)均顯著升高（P<0.05），尤其HIF2α表達(dá)量極顯著，見圖2～3）。

2.3實驗組與對照組MHCC97-H細(xì)胞活力比較

按照實驗分組培養(yǎng)肝癌MHCC97-H細(xì)胞，分別選取0 h、6 h、24 h、48 h、72 h檢測細(xì)胞的吸光度，結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組MHCC97-H細(xì)胞活力降低，72 h細(xì)胞活力顯著低于對照組（P<0.05），且隨著時間延長，兩組間差異逐漸增大，見圖4。

2.4實驗組與對照組MHCC97-H細(xì)胞凋亡情況

按照實驗分組培養(yǎng)MHCC97-H細(xì)胞，分別在6 h、24 h用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明：與對照組相比，實驗組MHCC97-H細(xì)胞凋亡增加，隨著時間延長，24 h后細(xì)胞凋亡顯著增加（P<0.05）。見圖5、圖6。

3 討論

HCC是中國癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。HCC的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[12-13]，闡明其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的調(diào)控機(jī)制仍非常重要。由于腫瘤細(xì)胞生長迅速，癌細(xì)胞多處于缺氧環(huán)境中，缺氧激活缺氧誘導(dǎo)因子，改變細(xì)胞的代謝方式，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、浸潤等均密切相關(guān)[14]。因此，探究缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞的生長特性至關(guān)重要。人肝癌細(xì)胞系取材于原發(fā)肝癌組織，并不改變其生物學(xué)特性，廣泛應(yīng)用于肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性、浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制等方面的研究。CoCl2是常見的化學(xué)模擬缺氧的物質(zhì)，可利用CoCl2構(gòu)建肝癌細(xì)胞缺氧模型。然而目前關(guān)于肝癌MHCC97-H細(xì)胞對CoCl2反應(yīng)劑量的報道較少。

研究發(fā)現(xiàn)，不同類型腫瘤細(xì)胞所需CoCl2濃度可能不相同，在乳腺癌細(xì)胞中CoCl2對乳腺癌MCF-7細(xì)胞的最佳濃度是150 μmol/L，而對MDA-MB-231細(xì)胞的最佳濃度僅為25 μmol/L[11]。翁苓苓等[10]研究了0～800 μmol/L CoCl2處理，對HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402肝癌細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，CoCl2在 200 μmol/L內(nèi)對肝癌細(xì)胞的生長無明顯作用。其認(rèn)為200 μmol/L是CoCl2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞化學(xué)性缺氧的最佳濃度。而本文發(fā)現(xiàn)，肝癌MHCC97-H細(xì)胞對CoCl2的反應(yīng)性不同于以上四種細(xì)胞株，20 μmol/L CoCl2即對MHCC97-H細(xì)胞產(chǎn)生明顯影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF2α，G9a和Reptin蛋白表達(dá)顯著升高、細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡增加。

有研究表明，CoCl2作用機(jī)制與氧濃度無關(guān)，其比常規(guī)缺氧模型更穩(wěn)定，能調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，具有與缺氧相同的調(diào)節(jié)作用[10]。也有研究指出，CoCl2主要通過鈷的積累導(dǎo)致HIF1α表達(dá)來模擬缺氧[15]，而本研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)缺氧同樣會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HIF2α表達(dá)顯著增多。據(jù)報道，HIF2在肝癌細(xì)胞中普遍表達(dá)[16]，比HIF1α更易促進(jìn)腫瘤生長[17]。此外，Reptin是一種ATP酶，參與染色質(zhì)的重塑和DNA的損傷修復(fù)等[18]。研究發(fā)現(xiàn)，Reptin沉默與DNA損傷會協(xié)同降低肝癌細(xì)胞的活力[19]。而本研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧導(dǎo)致肝癌MHCC97-H細(xì)胞活力降低，此時Reptin表達(dá)是顯著增高的，這可能是因Grigoletto 等[19]選用肝癌HuH7細(xì)胞，與本研究所用細(xì)胞系不同導(dǎo)致，這意味著Reptin與肝癌細(xì)胞活力的關(guān)系可能因細(xì)胞系的不同而不同，值得深入研究。

此外，有文獻(xiàn)報道，G9a增多是缺氧依賴的，缺氧條件下Reptin第67位賴氨酸被G9a甲基化，甲基化Reptin結(jié)合到HIF1α的啟動子上，負(fù)向調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性[20]，而本研究表明，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境下MHCC97-H細(xì)胞內(nèi)G9a表達(dá)增多，且Reptin表達(dá)增多，可能會導(dǎo)致更多Reptin被G9a甲基化，同時由于HIF2α表達(dá)也增多，甲基化Reptin就可能結(jié)合到HIF2α的啟動子上，參與調(diào)節(jié)HIF2α下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞活力降低、細(xì)胞凋亡增加，以上提示肝癌中HIF2α和Reptin的聯(lián)系值得研究。

本研究為未來利用CoCl2構(gòu)建肝癌MHCC97-H細(xì)胞缺氧相關(guān)模型奠定基礎(chǔ)，并為探究肝癌中HIF2α和Reptin的關(guān)系提供了依據(jù)，然而由于條件有限，并未研究CoCl2濃度與MHCC97-H細(xì)胞間的劑量依賴關(guān)系。這也將是筆者后續(xù)的研究重點之一。

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（收稿日期：2021-08-22）