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    綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)

    2022-04-27 12:59:04劉松曹孟會(huì)李芹梅張?zhí)熘{李文祥黃美娟黃海泉
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:低溫脅迫相關(guān)性分析

    劉松 曹孟會(huì) 李芹梅 張?zhí)熘{ 李文祥 黃美娟 黃海泉

    摘要:為探析綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理適應(yīng)性,本研究在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以20℃為對(duì)照,分別在2℃和0℃處理0、12、24、48、72h,測(cè)定其細(xì)胞傷害率(CIR)、葉綠素和丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及脯氨酸(PRO)等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量等指標(biāo),并進(jìn)行相關(guān)性分析,以期為綠萼鳳仙花開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。結(jié)果表明,隨溫度的降低及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花的傷害程度不斷加劇。2℃和0℃低溫脅迫下,綠萼鳳仙花的CIR及MDA、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量均呈上升趨勢(shì),在脅迫72h時(shí)分別高于對(duì)照3.18倍和5.09倍、80.85%和2.31倍、1.02倍和1.24倍、2.39倍和4.93倍,差異極顯著;POD活性、葉綠素含量呈下降趨勢(shì),在脅迫72h時(shí)分別顯著低于對(duì)照43%和71%、53%和60%,差異極顯著;SOD、CAT活性及PRO含量均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后降低趨勢(shì),溫度越低,越快達(dá)到峰值。相關(guān)性分析結(jié)果表明,CIR、葉綠素含量、MDA含量、SP含量和POD活性可作為綠萼鳳仙花耐寒性鑒定的主要指標(biāo),SOD和CAT活性、PRO和SS含量可作為輔助指標(biāo)。綜合來(lái)看,綠萼鳳仙花對(duì)2℃低溫具有一定的耐性,在0℃低溫下生長(zhǎng)受抑并表現(xiàn)出一定的寒害特征。本研究結(jié)果可為綠萼鳳仙花的引種馴化、雜交育種及抗寒育種提供一定的理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:綠萼鳳仙花;低溫脅迫;細(xì)胞傷害率;抗氧化生理指標(biāo);滲透調(diào)節(jié)物質(zhì);相關(guān)性分析

    隨著全球氣候變化加劇,極端天氣如極端高溫、極端低溫等氣候事件頻繁發(fā)生[1]。而溫度是決定植物地理分布、影響其品質(zhì)和生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素,因此,探究植物對(duì)低溫和高溫的適應(yīng)性及生理機(jī)制具有重要意義和作用[2]。

    低溫脅迫會(huì)引起植物新陳代謝紊亂,通過(guò)探析植物對(duì)低溫的生理響應(yīng)來(lái)研究和評(píng)價(jià)其耐寒性是較常見(jiàn)的方法。Plazek等[3]發(fā)現(xiàn)抗寒植株在低溫脅迫下的細(xì)胞膜變化比低溫敏感植株小,電導(dǎo)率增幅小。低溫脅迫下的細(xì)胞外結(jié)冰現(xiàn)象可使胞內(nèi)水向胞外轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致細(xì)胞受到程度更為嚴(yán)重的滲透脅迫,電導(dǎo)率升高[4]。Airaki等[5]將辣椒葉片在8℃低溫下脅迫1~3d發(fā)現(xiàn)低溫脅迫使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化加重,誘導(dǎo)了氧化脅迫。為此,植物通過(guò)啟動(dòng)一系列抗氧化酶系統(tǒng)來(lái)清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS),從而減低氧化脅迫對(duì)其造成的傷害[6]。另外,低溫脅迫下,植物體內(nèi)也能積累更多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白,從而增強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力,提高對(duì)逆境脅迫的耐受性[7,8]。

    鳳仙花屬植物種類(lèi)豐富,在我國(guó)分布范圍廣,因花型奇麗、顏色和形態(tài)多樣性高,極具觀賞價(jià)值,但目前在花卉園藝中開(kāi)發(fā)利用的品種還較少。綠萼鳳仙花(ImpatienschlorosepalaHand.Mazz.)為一年生或多年生草本花卉[9],主要分布于貴州、廣東、廣西等地,常生于疏林溪旁或山谷水旁陰處[10],具有低矮、分枝能力強(qiáng)、花大色艷、花期長(zhǎng)、一年多次開(kāi)花等特點(diǎn),是可開(kāi)發(fā)為園林地被植物的優(yōu)良植物材料。因此,研究綠萼鳳仙花在低溫脅迫下的生理適應(yīng)性,對(duì)其引種馴化和抗寒品種選育具有重要指導(dǎo)意義。

    目前尚未見(jiàn)有關(guān)綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)的研究報(bào)道。因此,本研究在前期研究基礎(chǔ)上,設(shè)置2℃和0℃兩種低溫處理,以20℃為對(duì)照,通過(guò)分析不同處理時(shí)間葉片中相關(guān)抗氧化生理指標(biāo)的變化動(dòng)態(tài),探析綠萼鳳仙花對(duì)低溫脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制,以期為其開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)用綠萼鳳仙花于2020年7月分株于西南林業(yè)大學(xué)樹(shù)木園。2021年1月選取長(zhǎng)勢(shì)一致且健康的成年植株進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2試驗(yàn)方法

    將所選綠萼鳳仙花植株分別在20、2℃和0℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)處理0、12、24、48、72h,以20℃為對(duì)照(CK),共計(jì)15個(gè)處理,每個(gè)處理3盆植株。選取當(dāng)年生莖上的成熟葉洗凈并擦干,用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo),每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3生理指標(biāo)及測(cè)定方法

    1.3.1細(xì)胞傷害率(CIR) 參考Chen等[11]的方法進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算公式:

    CIR(%)=[(R-CK)/(R0-CK)]×100。式中,R為組織殺死前外滲液的電導(dǎo)率值;R0為組織殺死后外滲液的電導(dǎo)率值;CK為處理0h的外滲液電導(dǎo)率值。

    1.3.2葉綠素含量 采用直接浸提法進(jìn)行測(cè)定[12]。

    1.3.3抗氧化物酶活性和丙二醛(MDA)含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定,超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測(cè)定,過(guò)氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定,過(guò)氧化氫酶(CAT)活性用過(guò)氧化氫還原法測(cè)定[13]。

    1.3.4滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 脯氨酸(PRO)含量采用酸性茚三酮法測(cè)定,可溶性糖(SS)含量用蒽酮比色法測(cè)定,可溶性蛋白(SP)含量用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測(cè)定[14]

    1.4數(shù)據(jù)處理

    用MicrosoftExcel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖,用SPSS26.0軟件進(jìn)行多重比較(Duncan’s法)和Spearman相關(guān)分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花細(xì)胞傷害率的影響

    由圖1可知,20℃條件下,CIR隨處理時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升,但上升幅度很小,處理72h的CIR僅11%。2℃低溫下,48h內(nèi)的CIR與對(duì)照相當(dāng),但48h后急劇上升,72h達(dá)到46%,顯著高于對(duì)照。0℃低溫下,CIR在處理后即急劇上升,至12h已上升至37%,之后增幅略緩,至72h達(dá)到67%,與其他兩處理間差異顯著(P<0.05)。可見(jiàn),綠萼鳳仙花的細(xì)胞傷害率受脅迫溫度和時(shí)間的共同影響。

    2.2低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉綠素含量的影響

    由圖2可知,2℃和0℃低溫處理顯著降低綠萼鳳仙花的葉綠素含量(P<0.05),但兩種低溫處理間差異不顯著;低溫脅迫12~48h內(nèi)各溫度處理的葉綠素含量無(wú)顯著差異,至72h降至最低,分別低于CK(20℃)53%和60%。CK處理下,綠萼鳳仙花葉片中的葉綠素含量波動(dòng)較小,均在12~15μmol·g-1FW。

    2.3低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉片保護(hù)酶活性的影響

    由圖3A可知,除2℃脅迫12h的SOD活性與CK差異不顯著外,兩種低溫脅迫均能使綠萼鳳仙花SOD活性顯著升高(P<0.05),且2℃處理的SOD活性顯著高于0℃處理;隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng),2℃和0℃處理的SOD活性先升高,并分別于24、12h達(dá)到最高值,之后逐漸下降,72h時(shí)仍顯著高于CK57%和31%。CK處理的綠萼鳳仙花SOD活性在72h內(nèi)呈下降趨勢(shì),但降幅很小,為0.89%~17.86%。

    與CK相比,0℃低溫脅迫顯著降低綠萼鳳仙花的POD活性,且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸降低趨勢(shì),至72h時(shí)低于CK71%;2℃低溫脅迫下48h內(nèi)的POD活性與CK差異不顯著,呈先升后降變化趨勢(shì),72h時(shí)大幅降低,顯著低于CK43%(P<0.05)。CK的POD活性在72h內(nèi)呈緩慢下降后又緩慢上升狀態(tài),降幅為0.43%~16.52%,處理48h的值最低(圖3B)。

    處理0~12h,2℃和0℃低溫處理對(duì)綠萼鳳仙花CAT活性的影響與CK無(wú)顯著差異,但均在24h顯著提高CAT活性,達(dá)到峰值;處理48h時(shí),兩低溫處理的CAT活性仍高于CK,其中2℃處理仍顯著高于CK;至72h,兩低溫處理的CAT活性分別低于CK10%和53%,其中,0℃處理與CK間差異顯著(P<0.05)。兩低溫處理間比較,0~12h兩者間CAT活性無(wú)顯著差異,24~72h0℃處理的CAT活性顯著低于2℃處理(P<0.05)。20℃條件下,處理72h內(nèi)綠萼鳳仙花的CAT活性為1.09~1.23U·g-1FW,呈小幅上升趨勢(shì)(圖3C)。

    2.4低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉片MDA含量的影響

    由圖4可知,2℃和0℃低溫處理能夠促進(jìn)綠萼鳳仙花的MDA積累,且積累量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。2℃條件下處理72h的積累量顯著高于CK80.85%;而0℃條件下處理12h的積累量即顯著高于CK(P<0.05),72h時(shí)則高于CK2.31倍。CK處理的MDA含量變化很小,在1.28~1.41μmol·g-1FW范圍內(nèi)波動(dòng)。

    2.5低溫脅迫對(duì)綠萼鳳仙花葉片細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

    由圖5A可知,2℃脅迫12~72h的PRO含量均高于CK,并在脅迫24h后達(dá)到差異顯著水平;0℃脅迫12~24h的PRO含量顯著高于CK,之后逐漸下降,72h時(shí)略低于CK,差異不顯著。隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),2℃和0℃處理的PRO含量均先升高后下降,分別于處理48h和12h達(dá)到峰值。CK的PRO含量在72內(nèi)無(wú)明顯變化,穩(wěn)定在13~14μg·g-1。

    由圖5B可知,2℃脅迫0~72h的SS含量先下降后上升,24h時(shí)最低,顯著低于CK24.31%,48~72h則顯著高于CK,尤其72h時(shí),比CK高1.02倍;0℃處理下,隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),SS含量呈先上升后下降再上升的變化趨勢(shì),12~24h顯著高于CK,48h時(shí)則顯著低于CK,之后快速上升,72h時(shí)顯著高于對(duì)照1.24倍。CK的SS含量在0~72h內(nèi)先降低后上升,在218~255μmol·g-1FW范圍內(nèi)小幅變化。

    由圖5C可知,低溫脅迫能夠增加綠萼鳳仙花葉片中的SP含量,2℃處理48h后差異達(dá)顯著水平(P<0.05),尤其處理72h時(shí)達(dá)到CK的3.39倍;0℃條件使SP含量在處理12h時(shí)即顯著高于CK,之后隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,24h后增幅加大,72h時(shí)達(dá)到CK的5.93倍。CK的SP含量在處理的72h內(nèi)變化很小,保持在5.4~6.9μmol·g-1FW。

    2.6綠萼鳳仙花葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

    由表1可知,CIR與脅迫時(shí)間始終呈極顯著正相關(guān),表現(xiàn)為隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升,且溫度越低,兩者的相關(guān)性越高。2℃和0℃低溫脅迫下,CIR與SP和MDA含量一直呈極顯著正相關(guān),與葉綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān);POD在2℃低溫下與CIR顯著相關(guān),在0℃下則與CIR極顯著相關(guān);PRO在2℃低溫下與CIR呈現(xiàn)極顯著正相關(guān);SS和CAT在2℃和0℃低溫脅迫下與CIR相關(guān)不顯著。表明MDA、SP和葉綠素含量及POD活性在綠萼鳳仙花受低溫脅迫的不同階段對(duì)細(xì)胞損傷進(jìn)行有規(guī)律的響應(yīng),而SOD和CAT活性及PRO和SS含量對(duì)綠萼鳳仙花響應(yīng)低溫脅迫無(wú)明顯規(guī)律。

    3討論

    膜系統(tǒng)在植物抵御低溫冷害中起重要作用,冷害會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化,增加細(xì)胞膜透性,使電解質(zhì)滲透率提高[15,16]。有研究表明,隨低溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng),電解質(zhì)滲透率呈“S”形變化[17]。SOD、POD和CAT是植物抗氧化系統(tǒng)中清除活性氧的主要酶,在遭受逆境脅迫后,植物體首先啟動(dòng)SOD,將O·-2轉(zhuǎn)化為H2O2和O2,POD和CAT則進(jìn)一步將H2O2分解為H2O和O2,從而減輕活性氧對(duì)膜系統(tǒng)的傷害[18-21]。丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物,隨著脅迫溫度的降低其含量會(huì)不同程度地上升,是評(píng)價(jià)植物抗寒性強(qiáng)弱的參考指標(biāo)之一[22-24]。本研究結(jié)果表明,與20℃對(duì)照相比,2℃和0℃低溫處理能提高綠萼鳳仙花葉片中的SOD和CAT活性,溫度越低提高越快,說(shuō)明受到低溫脅迫后,綠萼鳳仙花快速啟動(dòng)活性氧清除系統(tǒng),以保護(hù)膜系統(tǒng)免受活性氧的傷害,此時(shí)MDA積累量較低,細(xì)胞傷害率(CIR)上升緩慢;但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),SOD、POD和CAT活性均降低,且溫度越低其活性越低,MDA含量顯著提高,CIR急劇上升,說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的低溫脅迫打破了植物體內(nèi)的活性氧“產(chǎn)生—清除”平衡,造成大量的活性氧積累,對(duì)膜系統(tǒng)造成嚴(yán)重傷害。這與在金花茶[25]、南天竹[26]、冰草屬植物[27]、大葉鐵線(xiàn)蓮[28]等中的研究結(jié)果基本一致。

    葉綠素含量的高低可反映植物光合能力的強(qiáng)弱[29]。低溫脅迫會(huì)抑制葉綠素合成相關(guān)酶的活性,從而使植物體內(nèi)葉綠素含量降低,影響其光合作用[30]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明,2℃和0℃低溫脅迫顯著降低綠萼鳳仙花葉片中的葉綠素含量,且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),可能是因?yàn)榫G萼鳳仙花對(duì)低溫的應(yīng)激反應(yīng)使體內(nèi)葉綠素合成相關(guān)酶活性快速降低,導(dǎo)致葉綠素含量急劇下降,而長(zhǎng)時(shí)間低溫脅迫使傷害進(jìn)一步加劇,導(dǎo)致葉綠素含量繼續(xù)降低。

    脯氨酸(PRO)、可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。SP在植物體內(nèi)起著維持滲透調(diào)節(jié)及防止原生質(zhì)體脫水的作用[31,32],低溫冷害會(huì)引起細(xì)胞蛋白質(zhì)的一系列變化,主要表現(xiàn)在SP含量增加,是植物產(chǎn)生抗寒性的重要過(guò)程[33];而冷馴化下,植物的抗寒性可因SS和PRO的累積而提高[34-36]。本研究結(jié)果表明,2℃和0℃低溫脅迫能提高綠萼鳳仙花葉片中的PRO、SP和SS含量。其中,2℃脅迫期間的PRO含量均高于對(duì)照,24h后差異顯著,而0℃脅迫24h內(nèi)的PRO含量顯著高于對(duì)照,之后與對(duì)照差異不顯著;兩低溫處理的PRO含量分別于脅迫12、48h達(dá)到峰值,溫度越低,達(dá)到峰值的時(shí)間越短,PRO含量下降越快。這與李慶華等[34]對(duì)不同基因型日本柳杉的抗寒性研究結(jié)果相似。SS含量在兩種低溫脅迫期間波動(dòng)變化,但均在脅迫72h時(shí)顯著高于對(duì)照,總體呈現(xiàn)溫度越低,SS積累越快,含量越高,這可能是因?yàn)榈蜏孛{迫會(huì)影響淀粉及蛋白質(zhì)分解酶的活性,進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的SS含量[37]。SP含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,均在脅迫72h時(shí)最高,且溫度越低,SP積累越快,含量越高,可能是因?yàn)榈蜏孛{迫使部分抗寒蛋白質(zhì)合成增加,從而提高植株內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)作用以減輕低溫對(duì)其的傷害。

    對(duì)不同溫度下綠萼鳳仙花各生理指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)CIR與脅迫時(shí)間始終呈極顯著正相關(guān),且相關(guān)性隨溫度的降低而升高。進(jìn)一步分析CIR與其他指標(biāo)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)MDA、SP和葉綠素含量及POD活性在綠萼鳳仙花受低溫脅迫的不同階段對(duì)細(xì)胞損傷響應(yīng)明顯。

    4結(jié)論

    2℃和0℃低溫處理72h能對(duì)綠萼鳳仙花造成一定傷害,且溫度越低、脅迫時(shí)間越長(zhǎng),傷害越重,0℃脅迫下生長(zhǎng)受抑并表現(xiàn)出一定的寒害特征,因此,綠萼鳳仙花引種時(shí)應(yīng)做好防寒保護(hù)措施,預(yù)防低于0℃的極端溫度傷害。CIR、葉綠素含量、MDA含量、SP含量和POD活性可作為綠萼鳳仙花耐寒性鑒定的主要指標(biāo),SOD和CAT活性、PRO和SS含量可作為次要指標(biāo)。本研究結(jié)果可為綠萼鳳仙花的引種馴化、花期調(diào)控、抗寒育種等提供參考。

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