呼吸道感染患兒EBV-DNA載量及與肝腎功能損傷的關(guān)系

崔佳麗 張巨平 劉秀珍

愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)主要經(jīng)由呼吸道傳染，入體后，可直接侵犯機(jī)體免疫系統(tǒng)而發(fā)生免疫反應(yīng)，并會(huì)累及全身若干器官和系統(tǒng)，相應(yīng)的臨床表現(xiàn)也復(fù)雜多樣，給診斷、治療造成較大障礙[1]。近年感染EBV的兒童有逐年增多的趨勢(shì)，且有數(shù)據(jù)顯示<4歲的兒童易感率尤其高[2]。EBV感染后的疾病發(fā)生率中，呼吸道疾病最多，研究顯示，EBV感染后的肝腎損傷概率也很高，但此種肝腎損傷并無易查的、特異性的臨床表現(xiàn)，而易被漏診、誤診[3,4]。所以，EBV感染后如能盡早檢查出肝腎功能是否損傷，對(duì)于保護(hù)患兒肝腎臟器功能，有效控制疾病，改善患者預(yù)后極其重要。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)是公認(rèn)的反映機(jī)體內(nèi)肝細(xì)胞損傷程度及肝組織炎癥變化情況的指標(biāo)，在臨床也是篩查、診斷和鑒別肝臟疾病的敏感、有效指標(biāo)[2，5,6]；同樣，胱抑素 C(CysC)、β2微球蛋白(β2-MG)是目前臨床用于評(píng)估腎功能適用性較高的參考指標(biāo)[7,8]。目前，病毒DNA載量檢測(cè)是對(duì)患者體內(nèi)病毒進(jìn)行檢測(cè)的較為先進(jìn)的方式，因其可較為科興、直觀地反映病毒感染狀況[9]。目前有關(guān)于EBV-DNA載量與呼吸道感染患兒肝腎功能損害關(guān)系的研究較少，因此本研究比較了不同性別、不同年齡組患兒的EBV-DNA陽(yáng)性率，同時(shí)分析EBV-DNA與肝腎功能指標(biāo)水平的關(guān)系，旨在為EBV呼吸道感染患兒肝腎損傷的評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2020年12月河北省邯鄲市中心醫(yī)院門診及住院治療且經(jīng)臨床確診的175例呼吸道感染兒童，其中男98例，女77例；年齡5個(gè)月～10歲，平均年齡(4.21±1.31)歲，<1歲39例，1～3歲41例，4～6歲69例，>6歲26例。其中亦發(fā)現(xiàn)肝功能異常46例，腎功能異常37例。根據(jù)的EBV-DNA載量水平將所收集患兒分為陽(yáng)性組(EBV-DNA>5.00E+3,n=117)和陰性組(EBV-DNA≤5.00E+3,n=58)；此外，陽(yáng)性組依據(jù)EBV-DNA載量水平不同分為3個(gè)亞組：低載量組(5.00E+35.00E+5,n=21)。本研究符合倫理學(xué)規(guī)范，已通過醫(yī)院相關(guān)審批。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)[10](1)患兒均經(jīng)我院首診為EBV感染，中途未轉(zhuǎn)院、未經(jīng)其他途徑治療；(2)呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)熱(體溫≥38℃)，并伴有咳嗽、咳痰、咽喉疼痛、乏力或全身酸痛等；(3)患兒無其他影響本研究的哮喘、肺結(jié)核等肺部疾病及惡性腫瘤；(4)患兒監(jiān)護(hù)人充分了解并自愿參與本研究。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)伴哮喘、肺結(jié)核等其他對(duì)本研究有影響的呼吸系統(tǒng)疾病的患兒；(2)中途轉(zhuǎn)院；(3)近期內(nèi)有服用影響肝腎功能藥物史；(4)近期內(nèi)應(yīng)用過免疫抑制劑；(5)患有其他肝腎疾病；(6)患兒監(jiān)護(hù)人不愿意參與本研究。

1.4 收集標(biāo)本 患兒于入院24 h內(nèi)采集外周血3 ml，以3 000 r/min，離心10 min后取上清液，放于-30℃冰箱中保存待測(cè)。

1.5 EBV-DNA 的提取 采用瑞士羅氏公司生產(chǎn)的cobas z480全自動(dòng)熒光定量PCR分析儀及其配套試劑檢測(cè)血清中EBV-DNA載量，血清中加入1 ml Trizol 溶液,抽吸均勻后按照試劑說明書操作。于含有 DNA 的 Trizol 溶液中加入 300 μl 純乙醇。顛倒混勻，4℃離心 5 min，轉(zhuǎn)速：2 000 r/min。去上清，向剩余的 DNA 沉淀中加入含 0.1mol檸檬酸鈉的 10%乙醇1.5 ml，室溫下旋轉(zhuǎn)放置 30 min。4℃下離心 5 min，轉(zhuǎn)速：2 000 r/min，去上清，以 0.1 mol檸檬酸鈉的 10%乙醇溶液重復(fù)洗滌一遍。給樣本中加入 75%乙醇溶液 1.5 ml，室溫下旋轉(zhuǎn)放置 20 min。后4℃下離心 5 min，轉(zhuǎn)速：2 000 r/min，去上清，室溫干燥約30 min。于管中加入 8 mmol氫氧化鈉 300 μl，4℃過夜。12 000 r/min離心 10 min，取上清入一新管，加入 30 μl 0.1 mol的 HEPES (Molecular Research Center公司，美國(guó))。取 DNA 2 μl 加入 98 μl 超純水中，進(jìn)行分光光度儀檢測(cè)，以超純水作為空白對(duì)照。配制擴(kuò)增體系20 μl/份，將上述DNA 25 μl溶液加入反應(yīng)體系；瞬時(shí)離心15 s，震蕩混勻10 s，再進(jìn)行瞬時(shí)離心15 s后轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)上機(jī)檢測(cè)。

1.6 生化指標(biāo)檢驗(yàn) 采用日本日立公司生產(chǎn)的7170全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)血清ALT、AST、CysC、β2-MG水平，檢測(cè)嚴(yán)格遵守試劑盒和儀器操作規(guī)程進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡、不同性別患兒EBV-DNA載量水平 男、女患兒EBV-DNA 峰值載量陽(yáng)性率(31.63% vs 35.06%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同年齡段(<1歲，1～3歲，4～6歲，>6歲)患兒EBV-DNA峰值載量陽(yáng)性率(61.54% vs 75.61% vs 79.71% vs 26.92%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同年齡、性別EBV-DNA 峰值載量比較 例(%)

2.2 EBV-DNA不同載量組間肝腎功能異常情況 EBV-DNA陰性組肝腎功能異?；颊叩臉?gòu)成比例(3.44%和1.72%)低于低載量組(19.67%和13.11%)、中載量組(48.57%和34.28%)和高載量組(66.66%和66.66%)(P<0.05)；低載量組低于中載量組、高載量組(P<0.05)；中載量組低于高載量組(P<0.05)。見表2。

表2 不同EBV-DNA分組與肝腎功能異常的關(guān)系 例(%)

2.3 EBV-DNA不同載量組患兒肝腎功能指標(biāo)水平比較 陰性組患兒血清ALT、AST、CysC、β2-MG水平低于EBV-DNA低載量組、中載量組、高載量組(P<0.05)；低載量組低于中載量組、高載量組(P<0.05)；中載量組低于高載量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 EBV-DNA不同載量患兒肝腎功能相關(guān)指標(biāo)水平比較

2.4 EBV-DNA 載量與肝腎功能指標(biāo)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，EBV-DNA 載量與血清ALT、AST水平呈正相關(guān)(r=0.683，P=0.022；r=0.759，P=0.010)，EBV-DNA 載量與血清CysC、β2-MG水平呈正相關(guān)(r=0.649，P=0.026；r=0.743，P=0.017)。

3 討論

EBV感染在一年四季中均會(huì)發(fā)病，但以晚秋至初春時(shí)節(jié)較多；該感染可以發(fā)生于世界各地，且多呈散發(fā)，在小范圍內(nèi)可呈流行狀態(tài)[8-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)展中國(guó)家內(nèi)，EBV初次感染患者的年齡段以嬰幼兒為主,在發(fā)達(dá)國(guó)家則以青少年階段為主[3,4];另有數(shù)據(jù)顯示，EBV 患者初次感染的年齡段和感染率在不同種族、不同社會(huì)階層及不同家庭間也存在較大差異[4,7]。普通人群對(duì)EBV的易感性較高，而其在人群中的血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率有可能達(dá)到90%[11]。

本研究中175例感染EB病毒的患兒中男性例數(shù)為98例、EBV-DNA陰性為31例，陽(yáng)性為67例，女性例數(shù)77例，陰性27例，陽(yáng)性50例，各組性別構(gòu)成均是男性高于女性，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而不同年齡階段患兒陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，1～6歲為高發(fā)年齡，這與既往研究數(shù)據(jù)顯示我國(guó) EB 病毒感染患者的高發(fā)年齡在3～5歲，并且感染率可高達(dá)90%[12]一致。

EB病毒大多情況下經(jīng)由呼吸道傳播,到達(dá)患兒口咽部后，在其上皮細(xì)胞中增殖后釋放,侵襲局部淋巴組織中的B細(xì)胞后進(jìn)行感染,而正常情況下，B細(xì)胞進(jìn)入人體血液后會(huì)引發(fā)全身性的EB 病毒感染癥狀[13]。EB病毒一般會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，因它的噬B細(xì)胞特性,若此時(shí)碰到的受體細(xì)胞具有內(nèi)吞作用時(shí)，那么EB病毒就會(huì)以這種方式非常容易地進(jìn)入到被感染細(xì)胞中[14]；一旦有細(xì)胞被感染，B細(xì)胞抗原也會(huì)隨之改變，然后激活T細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)化成有細(xì)胞毒性的效應(yīng)T細(xì)胞，最終達(dá)到引起相應(yīng)組織損傷的目的。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，EBV病毒可以將B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等感染,另外EBV編碼抗原中的VCA、EBNAs等，也能對(duì)T細(xì)胞發(fā)揮激活的作用[15]。

嚴(yán)格來講，EB病毒只是一種皰疹病毒,也是一種非嗜肝病毒,其在臨床上較易造成兒童肝臟損傷，發(fā)生肝功能損傷的患兒主要病理表現(xiàn)為細(xì)胞的凋亡[16]。肝功能出現(xiàn)損傷時(shí)，表現(xiàn)為肝細(xì)胞再生能力減弱,進(jìn)而會(huì)影響患者機(jī)體的基礎(chǔ)代謝水平和蛋白質(zhì)合成或降解進(jìn)程,直接導(dǎo)致肝臟儲(chǔ)備功能降低。相關(guān)的研究結(jié)果顯示,EB病毒感染時(shí)，可連帶促進(jìn)與機(jī)體免疫相關(guān)的因子發(fā)生增殖反應(yīng),導(dǎo)致患者的機(jī)體各臟器功能均有損傷[17]。另一方面，EB病毒感染時(shí)，亦能促進(jìn)人體中脂質(zhì)過氧化反應(yīng),出現(xiàn)自由基和活性氧等產(chǎn)物,進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生毒性作用,使肝細(xì)胞受到損傷,這也是患兒出現(xiàn)肝功能異常的原因之一[15]。ALT 和AST 是臨床中公認(rèn)的檢測(cè)肝功能損害時(shí)的敏感指標(biāo)，也可以在一定程度上反映肝功能受損的輕重水平。

在本研究中,EBV—DNA陰性組肝腎功能異?；颊叩臉?gòu)成比例低于低載量組、中載量組和高載量組(P<0.05)；低載量組中肝腎功能異?；颊叩谋壤陀谥休d量組、高載量組(P<0.05)；中載量組中肝腎功能異?；颊叩谋壤陀诟咻d量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明了EB病毒感染的患兒確實(shí)會(huì)有肝功能異常的現(xiàn)象,并與陶小娟等[18-20]研究結(jié)果相同。

EB病毒感染所引起的腎臟損傷迄今為止并無確切的流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)有研究指出，EB病毒感染相關(guān)性腎損傷的死亡率可達(dá)1.7%～15.7%，其中兒童期所出現(xiàn)的急性腎損傷較大可能與EB病毒感染相關(guān)[19]。血清CysC為內(nèi)源性小分子蛋白質(zhì)，循環(huán)血液內(nèi)CysC幾乎完全經(jīng)腎小球?yàn)V過而被清除，大部分被腎小管重吸收和降解，一次可有效反映腎功能損傷和腎小球?yàn)V過率變化情況。且血清CysC在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生速度恒定，各種液體中均存在，檢測(cè)取樣方便快捷。不容易受到其他因素的影響。血清CysC對(duì)EB病毒感染兒童腎損傷的有較佳的診斷效果[20]。本研究分別對(duì)各組患兒CysC、β2-MG進(jìn)行檢測(cè)且與EBV-DNA 的拷貝數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，EBV-DNA陽(yáng)性組患兒腎功能異常比率明顯高于陰性組，且DNA高載量組CysC、β2-MG明顯高于中載量組、低載量組及陰性組，中載量組高于低載量組及陰性組，低載量組高于陰性組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CysC、β2-MG與 EBV-DNA的拷貝數(shù)有很高的正相關(guān)性，EBV-DNA中、高載量組ALT、AST、CysC、β2-MG均明顯升高，提示患兒存在腎功能損傷。

由此可以認(rèn)為，EBV-DNA等在一定程度上可以反應(yīng)肝、腎功能的受損程度。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，EBV-DNA病毒還與人體受累器官損害程度及疾病的種類、嚴(yán)重度和病死率呈正相關(guān)[21]。因此，EBV-DNA病毒檢測(cè)可用于評(píng)估病情及療效。