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    晚期糖基化終產(chǎn)物受體阻斷劑FPS-ZM1減緩ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的作用△

    2022-04-26 10:26:18吳岳恒林吉進(jìn)
    嶺南心血管病雜志 2022年2期
    關(guān)鍵詞:油紅結(jié)構(gòu)域切片

    謝 妃,吳岳恒,林吉進(jìn),1

    [1.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣州 510006;2.廣東省心血管病研究所心內(nèi)科廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院),廣州 510080]

    動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種以血管壁纖維增生、慢性炎癥、脂質(zhì)積聚和免疫功能紊亂為特征的病理疾?。?]。隨著粥樣斑塊的不斷進(jìn)展,不穩(wěn)定斑塊容易破裂,導(dǎo)致急性心血管事件,而斑塊發(fā)生破裂則與局部的炎癥反應(yīng)、血栓形成以及蛋白降解有密切關(guān)系[2]。雖然低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)仍然是AS 最重要的危險(xiǎn)因素,但近年來(lái),AS 的免疫和炎癥機(jī)制引起了人們極大的興趣,目前針對(duì)炎癥反應(yīng)這一靶點(diǎn)來(lái)干預(yù)AS 發(fā)展的方法尚不成熟[1,3-4]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)是一類(lèi)屬于免疫球蛋白家族的多配體受體,能與晚期糖基化終末產(chǎn)物(ad?vanced glycation end products,AGEs)、S100/鈣粒蛋白家族、高遷移率族蛋白1(high mobility group box,HMGB1)等配體結(jié)合發(fā)揮促炎作用[5],并在AS 中起重要作用,在AS 患者中血漿AGEs、S100/鈣粒蛋白家族、HMGB1、RAGE 濃度均升高[6-8],同時(shí)伴隨各炎癥因子升高,其與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,深入探究RAGE 在AS 中的炎癥機(jī)制可為AS 治療提供新思路。

    1 材料和方法

    1.1 主要藥品與試劑

    FPS-ZM1 粉末(selleck,s8185),用DMSO 配備10 mg/mL 的FPS-ZM1 儲(chǔ)備液,臨用前用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)配置成工作液腹腔注射給藥;高脂飼料及純化對(duì)照飼料(江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司,XT108C);飽和油紅O染液(上海索萊寶生物科技有限公司,G1015);蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(上海愛(ài)必信生物科技有限公司,abs9217);RAGE抗體(Abcam,ab37647);小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(CUSABIO,CSB-E04741m);小鼠纖溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)ELISA 試劑盒(CSB-E07947m)。

    1.2 主要儀器

    XTL250 型體式顯微鏡,全自動(dòng)血生化分析儀(日本日立);病理切片機(jī)(賽默飛世爾科技);正置顯微鏡(奧林巴斯有限公司);成像系統(tǒng)(日本濱松);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Multiskan GO(Thermo Scien?tific)。

    1.3 動(dòng)物分組及給藥

    6 周齡雄性無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)ApoE-/-小鼠購(gòu)自廣東藥康生物科技有限公司,體質(zhì)量20~25 g,在華南理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng),檢疫1 周,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,ApoE-/-小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(CTRL組,純化對(duì)照飼料喂養(yǎng)),AS 模型組(AS 組,高脂飼料喂養(yǎng)),F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組(FZM1 組,高脂喂養(yǎng)加FPS-ZM1 腹腔注射),每組8 只。ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)8 周后,開(kāi)始腹腔注射給藥,連續(xù)4 周,F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組給予1 mg·kg-1·d-1的FPS-ZM1[9],其余組給予PBS 作為對(duì)照。每周根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥。

    1.4 小鼠血脂濃度測(cè)定

    摘除小鼠眼球取血,收集于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)采血管,分離血漿,分裝后-80 ℃保存直至使用。采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血漿三酰甘油(triacylglycerol,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cho?lesterol,HDL-C)濃度。

    1.5 小鼠主動(dòng)脈取材

    眼球取血后采用頸椎脫臼法將ApoE-/-小鼠處死,開(kāi)胸開(kāi)腹后剪除右心耳,用預(yù)冷的PBS 從左心室開(kāi)始灌流,直至肝臟發(fā)白,分離心臟,以主動(dòng)脈根部為起點(diǎn),沿脊柱旁仔細(xì)快速分離主動(dòng)脈至髂總動(dòng)脈分叉處為止,后轉(zhuǎn)移至體式顯微鏡下,于裝有預(yù)冷的PBS 的皿中操作,仔細(xì)剝離主動(dòng)脈周?chē)M織,自主動(dòng)脈根部上1 cm 處左右垂直分離主動(dòng)脈,近端主動(dòng)脈根部置于4%多聚甲醛溶液固定,用于包埋切片。遠(yuǎn)端主動(dòng)脈置于液氮速凍后保存于-80 ℃用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

    1.6 小鼠主動(dòng)脈切片油紅O、蘇木素伊紅染色

    將4%多聚甲醛固定的小鼠主動(dòng)脈根部置于蔗糖溶液脫水后,使用OCT 包埋,切片厚6 μm,每隔10 張收取3 張,每只小鼠取15 張,5 張用于油紅O 染色,5 張用于HE 染色,5 張用于免疫組化檢測(cè)RAGE表達(dá)[10]。用于油紅O染色的切片于60%異丙醇中漂洗20 s,取油紅O 貯備液6 mL,加蒸餾水4 mL,混合后靜置10 min,過(guò)濾后用于染色。油紅O 染色時(shí)間為5 min;60%異丙醇稍洗去多余染液,蒸餾水洗;Mayer 蘇木素淺染核1 min,1%鹽酸酒精稍分化,水漂洗10 min,用濾紙將切片周?chē)帜ǜ?,封片。HE染色按HE試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用Image pro plus 6.0軟件測(cè)量主動(dòng)脈斑塊面積比(%)。

    1.7 切片免疫組織化學(xué)染色

    測(cè)定小鼠主動(dòng)脈組織RAGE 表達(dá):各組主動(dòng)脈組織常規(guī)包埋、固定、切片,將切片脫蠟復(fù)水后,采用熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù),采用試劑盒進(jìn)行免疫組化染色,在光學(xué)正置顯微鏡非重疊視野下分別觀察組織著色情況。采用Image pro plus 6.0 軟件對(duì)主動(dòng)脈組織RAGE 表達(dá)情況進(jìn)行半定量。

    1.8 Western blot 檢測(cè)

    將小鼠主動(dòng)脈組織剪碎,加入組織裂解液抽提蛋白,用二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天)測(cè)定總蛋白濃度,加入一定比例的蛋白上樣緩沖液,95℃金屬浴10 min,取20 μg 蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,5%脫脂牛奶封閉1 h,進(jìn)行一抗(RAGE,1∶1 000)孵育,4℃過(guò)夜,洗膜3 次,每次5 min,進(jìn)行HRP 標(biāo)記的二抗(1∶1 000)孵育,4 ℃1 h,洗膜,最后化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色進(jìn)行掃描拍照,采用Imge J 計(jì)算灰度值來(lái)表示RAGE 的相對(duì)表達(dá)量。

    1.9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定

    將保存于-80 ℃的血漿逐級(jí)解凍,按照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定血漿樣本中TNF-α以及PAI-1的濃度。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用GraphPad Prism 8.0.2 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以()表示,單因素多樣本組間均數(shù)比較采用one-way ANOVA 分析,多因素多組間均數(shù)比較采用two-way ANOVA 分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 3 組小鼠血脂濃度比較

    與對(duì)照組(CTRL)比較,AS模型組ApoE-/-小鼠血漿TC、LDL-C濃度均顯著增高(P<0.05),但TG 濃度下降(P<0.05),HDL-C 濃度無(wú)明顯變化;FPSZM1 干預(yù)組(FZM1)血脂各指標(biāo)與對(duì)照組及AS 模型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

    圖1 3 組小鼠血漿TG、TC、LDL-C 和HDL-C 濃度比較柱狀圖(n=8)

    2.2 3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色、蘇木素伊紅染色比較

    油紅O 染色鏡下觀察正常對(duì)照組(CTRL)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下油紅O 染色紅色著色區(qū)少,AS 模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下紅色著色區(qū)顯著增加(P<0.01),F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組(FZM1)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下著色區(qū)域較AS 模型組減少(P<0.01),見(jiàn)圖2A和2C。HE 染色鏡下觀察正常對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整,AS 模型組小鼠主動(dòng)脈局部?jī)?nèi)膜明顯增厚,斑塊突向管腔,內(nèi)膜下有大量泡沫細(xì)胞聚集和脂質(zhì)沉積,中層彈力纖維破壞、排列紊亂,并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),且斑塊面積比例較AS 模型組顯著增加(P<0.01),而FPS-ZM1 干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈只有少量泡沫細(xì)胞,斑塊面積較AS 模型組明顯減低(P<0.01),見(jiàn)圖2B 和2D。

    圖2 3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色、HE 染色結(jié)果比較(比例尺=100 μm;n=8;A 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色鏡下圖像比較;B 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片HE 染色鏡下圖像比較;C 圖和D 圖分別為3 組小鼠主動(dòng)脈根部切片油紅O 染色、HE 染色結(jié)果比較柱狀圖)

    2.3 3組小鼠主動(dòng)脈Western blot、主動(dòng)脈切片RAGE免疫組化染色比較

    與對(duì)照組(CTRL)比較,AS 模型組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈Western blot 結(jié)果顯示RAGE 表達(dá)顯著增高(P<0.01),F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)組(FZM1)小鼠RAGE蛋白表達(dá)量較AS 模型組降低(P<0.05),見(jiàn)圖3A和3C。主動(dòng)脈切片免疫組化染色結(jié)果與蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)一致,AS 模型組小鼠主動(dòng)脈較對(duì)照組平均光密度值(AOD)顯著增加(P<0.01),而FPSZM1 干預(yù)組(FZM1)小鼠主動(dòng)脈免疫組化染色較AS 模型組有所減低(P<0.05),見(jiàn)圖3B 和3D。

    圖3 3 組小鼠主動(dòng)脈Western blot、主動(dòng)脈切片RAGE 免疫組化染色比較(比例尺=100 μm;n=8;A 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈RAGE 的Western blot 結(jié)果比較;B 圖為3 組小鼠3 組小鼠主動(dòng)脈切片RAGE 免疫組化染色鏡下圖像比較;C 圖為3 組小鼠主動(dòng)脈Western blot、主動(dòng)脈切片RAGE 免疫組化染色比較柱狀圖)

    2.4 3組小鼠血漿酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果比較

    與對(duì)照組(CTRL)比較,AS 模型組的ApoE-/-小鼠血漿中TNF-α、PAI-1 濃度均顯著升高(P<0.01);與AS 模型組比較,F(xiàn)PS-ZM1 干預(yù)后(FZM1)ApoE-/-小鼠血漿TNF-α、PAI-1 濃度下降(P<0.05),見(jiàn)圖4。

    圖4 3 組ApoE-/-小鼠血漿TNF-α 和PAI-1 的ELISA測(cè)定結(jié)果比較(n=8)

    3 討論

    AS 是導(dǎo)致心血管疾病最常見(jiàn)的病理基礎(chǔ),心血管疾病是以粥樣硬化斑塊形成為特點(diǎn)的大、中動(dòng)脈疾病,斑塊內(nèi)包括壞死組織、鈣化結(jié)晶、修飾的脂質(zhì)聚集、炎癥平滑肌細(xì)胞(SMCs)、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、白細(xì)胞和泡沫細(xì)胞。AS 斑塊的這些特征表明,AS 是一種復(fù)雜的疾病,血管、代謝和免疫系統(tǒng)的許多成分參與了這一過(guò)程。近年來(lái),AS 的免疫和炎癥機(jī)制引起了人們極大的興趣,炎癥因子與炎癥細(xì)胞在AS 中起重要作用[3]。

    AS 是大動(dòng)脈內(nèi)皮下脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性炎癥過(guò)程,ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)可以最大限度地模擬人類(lèi)各個(gè)階段的AS 病變。本研究采用主動(dòng)脈切片油紅O 染色、HE 染色觀察小鼠主動(dòng)脈AS 病理形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行AS 指標(biāo)定量檢測(cè),結(jié)果均表明12 周高脂飲食可誘發(fā)ApoE-/-小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高脂血癥和明顯的主動(dòng)脈病變。血脂檢測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)RAGE 拮抗劑FPS-ZM1 對(duì)ApoE 小鼠的高血脂各指標(biāo)均無(wú)影響,表明抑制RAGE 對(duì)AS 病變的影響與調(diào)控血脂無(wú)關(guān),這與Mitchell 等[11]的研究結(jié)果一致,RAGE 的敲除對(duì)循環(huán)中脂質(zhì)無(wú)影響。

    RAGE 是一種1 型跨膜糖蛋白,由于其胞外區(qū)域中存在多個(gè)Ig 樣結(jié)構(gòu)域,因而認(rèn)為是受體Ig 超家族的成員。細(xì)胞外區(qū)域包含三個(gè)Ig 結(jié)構(gòu)域,包括V 型結(jié)構(gòu)域,C1 型結(jié)構(gòu)域和C2 型結(jié)構(gòu)域。配體的結(jié)合主要發(fā)生在V 型結(jié)構(gòu)域中。細(xì)胞外區(qū)域后面是單個(gè)跨膜區(qū)域和一個(gè)短的,帶高電荷的胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)域(ctRAGE),其與胞內(nèi)銜接蛋白結(jié)合對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要[5,12]。RAGE 因能與AGE 結(jié)合而得名,后研究發(fā)現(xiàn)RAGE 基于電荷和多聚體狀態(tài)可結(jié)合許多內(nèi)源性非AGE 配體,比如S100/鈣粒蛋白家族、HMGB1 等等。S100/鈣粒蛋白家族、HMGB1、AGEs 均與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系,且在AS時(shí)表達(dá)有所增加[6,13-14]。這些配體與RAGE 結(jié)合可刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)、促炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子的產(chǎn)生和促血栓形成,活化核因子κB(nuclear factor Kappa-B,NF-κB)能進(jìn)一步上調(diào)RAGE 表達(dá),使得炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)持續(xù)發(fā)生,這些都與心血管疾病的病理生理有關(guān)[15]。FPS-ZM1 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RAGE V 型結(jié)構(gòu)域,阻礙RAGE 與其他配體結(jié)合,從而抑制RAGE 下游信號(hào)傳導(dǎo)[16],從而減弱其生物效應(yīng)。由于RAGE胞漿結(jié)構(gòu)域缺乏內(nèi)源性激酶活性,其發(fā)出信號(hào)并影響轉(zhuǎn)錄程序和細(xì)胞功能的方式一直不明確,直到發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物透明蛋白1(forin diaphanous-1,DIAPH-1)才得以闡明。RAGE 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域主要是氨基酸R366/Q367,通過(guò)與DIAPH-1 的福爾曼同源1(FH1)結(jié)構(gòu)域結(jié)合來(lái)傳導(dǎo)信號(hào);當(dāng)這些氨基酸突變?yōu)楸彼峄驅(qū)IAPH-1 敲除后會(huì)導(dǎo)致RAGE 與DIAPH-1無(wú)法結(jié)合[17],F(xiàn)PS-ZM1在RAGE 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與DIAPH-1相互作用中的影響有待探索。

    本實(shí)驗(yàn)中,在ApoE-/-小鼠中應(yīng)用FPS-ZM1抑制RAGE 信號(hào)后發(fā)現(xiàn)AS 斑塊有所減輕,且抑制促炎因子TNF-α 的釋放,減輕AS 的炎癥。組織纖溶酶原激活劑(t-PA)和PAI-1 是纖溶系統(tǒng)的一對(duì)重要的調(diào)節(jié)因子,主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞組織纖溶酶原激活劑/PAI-1 的動(dòng)態(tài)平衡被打破時(shí),血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加。RAGE抑制劑在AS 模型小鼠中的使用可減少PAI-1 的釋放,從而降低心肌梗死并發(fā)癥的可能性。

    綜上所述,本研究在高脂誘發(fā)的ApoE-/-小鼠AS 模型中,通過(guò)RAGE 阻斷劑FPS-ZM1 的干預(yù)減緩了AS 的進(jìn)展,且AS 斑塊的減少與血脂調(diào)控?zé)o關(guān),同時(shí)FPS-ZM1 抑制了促炎因子TNF-α 和促血栓因子PAI-1 的釋放。本研究結(jié)果將為開(kāi)發(fā)以RAGE 為靶點(diǎn)的預(yù)防AS 藥物提供理論基礎(chǔ)。

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