中性粒細(xì)胞通過分泌ATX激活整合素β3促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移*

張英楠，姚圣城，郭雯雯，史凌云，吳小進(jìn)

221000 江蘇 徐州，徐州市第一人民醫(yī)院 腫瘤中心放療科(張英楠、郭雯雯、史凌云、吳小進(jìn));221000 江蘇 徐州，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科(姚圣城)

我國肺癌發(fā)生率和死亡率居高不下，已成為惡性腫瘤之首，是我國重大的公共衛(wèi)生問題和巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)。肺癌也已超越肝癌成為死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌的治療手段不斷進(jìn)步，從手術(shù)治療、化療、放療、免疫治療到多種療法聯(lián)合應(yīng)用[2]，雖然取得一定的成效，但總體效果仍不令人滿意。因此，從根本上探明肺癌的發(fā)病機(jī)理具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

導(dǎo)致肺癌患者死亡的多數(shù)原因是癌細(xì)胞遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，例如腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等。由各種細(xì)胞和非細(xì)胞因素組成的腫瘤微環(huán)境在癌癥轉(zhuǎn)移中起著重要作用[3-4]。在肺癌組織中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等[5]。中性粒細(xì)胞是多形核細(xì)胞，約占白細(xì)胞總數(shù)的50%～70%，是機(jī)體固有免疫的重要組成部分。作為參與炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞，近年來腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用被研究者廣泛關(guān)注[6]。在癌癥微環(huán)境中，中性粒細(xì)胞可以通過產(chǎn)生抗腫瘤因子，如NO、H2O2和TSP-1來抑制腫瘤的發(fā)展[7-9]，但更多的報(bào)道是中性粒細(xì)胞作為腫瘤的幫兇，通過調(diào)節(jié)腫瘤的生存和遷移、免疫反應(yīng)和血管生成來促進(jìn)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[10-14]。中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)理尚不清楚，進(jìn)一步研究揭示中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的臨床意義。

自分泌運(yùn)動(dòng)因子(autotaxin，ATX)又稱外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員2(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 2，ENPP2)，具有磷脂酶D (phospholipases D，PLD)活性，能夠催化溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，LPC)向溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)的轉(zhuǎn)化。LPA通過細(xì)胞膜上的LPA受體激活細(xì)胞內(nèi)的G蛋白及其下游信號(hào)通路，從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的遷移[15]和多種腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)[16-18]。迄今為止的大多數(shù)研究都集中在針對(duì)ATX-LPA受體軸來治療各種炎癥相關(guān)疾病，但最近的研究指出，ATX不僅有磷脂酶的作用，還作為免疫細(xì)胞的一種外分泌的功能蛋白，以自分泌或旁分泌方式直接與靶細(xì)胞表面的整合素相互作用來調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的功能[19]。肺癌組織中有大量中性粒細(xì)胞浸潤，同時(shí)中性粒細(xì)胞作為ATX的主要來源之一，是否調(diào)控肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞ATX的合成與分泌，進(jìn)一步中性粒細(xì)胞來源的ATX與肺癌細(xì)胞整合素β3相結(jié)合從而激活下游SRC信號(hào)通路，增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力，本研究初步探討了中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，并嘗試為肺癌臨床治療提供了新靶點(diǎn)及策略。

1 材料和方法

1.1 材料

中性粒細(xì)胞由HL-60細(xì)胞系(購買自ATCC公司)加含有1.3% 二甲基亞砜的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)5～7天分化形成[20]；A549和H1299肺癌細(xì)胞系購買自ATCC公司、液氮冷凍保存；Transwell小室購買自美國Corning公司；ATX一抗、整合素β3一抗、Protein A/G beads購買自美國Santa cruz公司；SRC一抗、p-SRC一抗、β-Actin一抗購買自美國CST公司；ATX ELISA試劑盒購買自Cloud-Clone公司；DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自Thermo公司。

1.2 Transwell實(shí)驗(yàn)

侵襲實(shí)驗(yàn)：提前在超凈臺(tái)中將Transwell小室底層均勻鋪上Matrigel膠(用培養(yǎng)基稀釋終濃度為0.8 mg/mL)，放入培養(yǎng)箱5 h；胰酶消化肺癌細(xì)胞，PBS清洗2遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(1×105/mL)；中性粒細(xì)胞制備同前，PBS清洗2遍，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞(1×107/mL)；24孔板底部加入600 μL中性粒細(xì)胞懸液，預(yù)鋪Matrigel膠的小室加入100 μL肺癌細(xì)胞懸液，小室放入24孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；12 h后，用鑷子小心取出小室，吸凈上室液體，移到加入600 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min，下室中性粒細(xì)胞懸液2 000 rpm離心10 min，上清及細(xì)胞放-80℃冰箱備用；小心取出小室，吸凈上室液體，移到加入500 μL結(jié)晶紫的孔中，室溫染色20 min；取出小室，吸凈上室液體，用濕棉簽小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，用室溫PBS清洗數(shù)次；Transwell小室底面朝上，自然晾干后于顯微鏡下拍照；顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野拍照，ImageJ軟件計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。遷移實(shí)驗(yàn)步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)，但是小室不鋪Matrigel膠。

1.3 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集活化后中性粒細(xì)胞或共培養(yǎng)后肺癌細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑(1%)及苯甲基磺酰氟(1%)的RIPA裂解液冰上裂解30 min，提取總蛋白，測蛋白濃度，濃度一致后加入Loading buffer；SDS-PAGE凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜后一抗4℃孵育過夜；次日孵育二抗；化學(xué)發(fā)光法顯色；ImageJ軟件灰度分析。

1.4 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CO-IP)實(shí)驗(yàn)

共培養(yǎng)后收集肺癌細(xì)胞A549和H1299，RIPA冰上裂解30 min提取總蛋白；各組取出50 μL作為In-put組；余下部分分別加入等量整合素β3抗體，同源Normal IgG；4℃慢搖8 h；加入30 μL Protein A/G agarose beads，顛倒混勻，4℃慢搖過夜；1 000 g，4 ℃，離心5 min，棄上清，加入1×RIPA裂解液1 mL，重復(fù)以上步驟，洗滌4～5次；加入50 μL 2×SDS-PAGE Loading buffer蛋白上樣液，100℃加熱10 min，進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)，一抗孵育整合素β3和ATX。

1.5 ATX濃度測定

收集上述共培養(yǎng)活化上清，利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定ATX濃度，具體方法參照試劑盒說明書提供的檢測步驟。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移

為了驗(yàn)證中性粒細(xì)胞是否促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，我們利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測肺癌細(xì)胞的侵襲(小室預(yù)鋪Matrigel膠過夜)與遷移能力，肺癌細(xì)胞A549或H1299接種于Transwell上室，中性粒細(xì)胞接種于下室，對(duì)照組不接種中性粒細(xì)胞，12 h后對(duì)穿過的肺癌細(xì)胞進(jìn)行固定染色并計(jì)數(shù)，圖1A結(jié)果顯示，在侵襲實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng)組A549通過小室的細(xì)胞數(shù)為(117.4±4.0)個(gè)，對(duì)照未培養(yǎng)組通過的細(xì)胞數(shù)為(83.6±5.2)個(gè)；遷移試驗(yàn)中共培養(yǎng)組A549通過小室的細(xì)胞數(shù)為(123.0±9.2)個(gè)，對(duì)照未培養(yǎng)組通過的細(xì)胞數(shù)為(88.0±9.7)個(gè)；圖1B結(jié)果顯示，在侵襲實(shí)驗(yàn)中共培養(yǎng)組H1299通過小室的細(xì)胞數(shù)為(145.8±21.8)個(gè)，對(duì)照未共培養(yǎng)組通過的細(xì)胞數(shù)為(81.8±6.9)個(gè)，遷移試驗(yàn)中共培養(yǎng)組A549通過小室的細(xì)胞數(shù)為(265.0±13.4)個(gè)，對(duì)照未共培養(yǎng)組通過的細(xì)胞數(shù)為(142.6±8.8)個(gè)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。以上結(jié)果說明中性粒細(xì)胞顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移的能力。

圖1 中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移

2.2 肺癌細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞ATX合成與分泌

進(jìn)一步，為了探究中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的原因，我們?cè)?孔板中將肺癌細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)4 h，離心收集活化的中性粒細(xì)胞與上清。Western blot結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞激活中性粒細(xì)胞后，中性粒細(xì)胞ATX表達(dá)顯著升高(圖2)。因?yàn)锳TX可以作為分泌蛋白在胞外發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，所以我們利用ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)后ATX的水平顯著升高(圖2C和2D)。以上結(jié)果表明肺癌細(xì)胞激活中性粒細(xì)胞可以使中性粒細(xì)胞ATX產(chǎn)生和分泌增加。

圖2 肺癌促進(jìn)中性粒細(xì)胞ATX合成與分泌

2.3 中性粒細(xì)胞通過ATX促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移

中性粒細(xì)胞是否通過分泌的ATX促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移呢？進(jìn)一步，我們首先用ATX特異性抑制劑HA130孵育中性粒細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證抑制效率(圖3A)，然后再進(jìn)行Transwell試驗(yàn)。圖3B結(jié)果顯示，在侵襲實(shí)驗(yàn)中HA130組A549通過小室的細(xì)胞數(shù)為(68.4±5.1)個(gè)，對(duì)照組通過的細(xì)胞數(shù)為(135.8±6.4)個(gè)；在遷移試驗(yàn)中HA130組A549通過小室的細(xì)胞數(shù)為(118.6±4.0)個(gè)，對(duì)照組通過的細(xì)胞數(shù)為(170.8±6.4)個(gè)；圖3C結(jié)果顯示，在侵襲實(shí)驗(yàn)中HA130組H1299通過小室的細(xì)胞數(shù)為(42.0±2.4)個(gè)，對(duì)照組通過的細(xì)胞數(shù)為(66.6±7.0)個(gè)，在遷移試驗(yàn)中HA130組H1299通過小室的細(xì)胞數(shù)為(64.6±6.4)個(gè)，對(duì)照組通過的細(xì)胞數(shù)為(85.6±4.5)個(gè)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。以上結(jié)果說明中性粒細(xì)胞通過ATX的分泌促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移。

2.4 ATX與整合素β3結(jié)合激活肺癌細(xì)胞SRC通路

已有研究報(bào)道，ATX的N端SMB結(jié)構(gòu)域可與血小板和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)的整合素αIIbβ3相結(jié)合進(jìn)而激活下游信號(hào)通路增強(qiáng)靶細(xì)胞的遷移能力[21]，而肺癌細(xì)胞表面整合素β3的活化在肺癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[22]。因此，我們推測中性粒細(xì)胞分泌的ATX可以與肺癌細(xì)胞表面整合素β3結(jié)合，CO-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞A549或H1299在與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后，整合素β3與ATX發(fā)生蛋白與蛋白相互結(jié)合，而未培養(yǎng)對(duì)照組則沒有結(jié)合(圖4A)。進(jìn)一步，圖4B和圖4C結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞A549或H1299在與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后整合素下游信號(hào)SRC磷酸化增強(qiáng)。以上結(jié)果表明中性粒細(xì)胞分泌的ATX與肺癌細(xì)胞整合素β3相互結(jié)合激活下游SRC信號(hào)通路。

圖3 中性粒細(xì)胞通過ATX促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移

圖4 ATX與整合素β3結(jié)合激活肺癌細(xì)胞SRC通路

綜上，肺癌細(xì)胞激活中性粒細(xì)胞促進(jìn)中性粒細(xì)胞ATX分泌，ATX與肺癌細(xì)胞整合素相互結(jié)合激活下游SRC信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

3 討 論

除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等治療方式外，目前新興的靶向及免疫治療也為肺癌治療提供了新的手段，但是肺癌患者的總體治療效果仍不盡人意，其中導(dǎo)致肺癌患者治療失敗及死亡的主要原因仍是肺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[23]。揭示肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理具有重要的理論意義及現(xiàn)實(shí)意義。本研究首次發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過分泌ATX與肺癌細(xì)胞整合素β3結(jié)合進(jìn)而激活下游SRC信號(hào),增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力，ATX抑制劑HA130能夠有效反轉(zhuǎn)中性粒細(xì)胞促進(jìn)的肺癌細(xì)胞侵襲與遷移，或可為肺癌患者臨床抗轉(zhuǎn)移治療提供了新的靶點(diǎn)及策略。

腫瘤逐漸被人們認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病，中性粒細(xì)胞作為固有免疫的一線細(xì)胞，一些研究已經(jīng)表明腫瘤微環(huán)境浸潤的中性粒細(xì)胞促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。腫瘤浸潤中性粒細(xì)胞活化后通過分泌IL-8、IL-17、Arginase I等抑制機(jī)體免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[24-25]，同時(shí)還可以分泌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9、MMP-13等促進(jìn)癌細(xì)胞外基質(zhì)降解從而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可以早于腫瘤細(xì)胞在肺部聚集，形成早期轉(zhuǎn)移灶，靶向敲除中性粒細(xì)胞可以減少腫瘤肺轉(zhuǎn)移[28]。在肺癌移植瘤模型中，高中性粒細(xì)胞浸潤釋放過多的G-CSF從而引起前動(dòng)力蛋白2(Bv8)增多，促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化并且促進(jìn)血管生成，抑制Bv8的表達(dá)能夠減少中性粒細(xì)胞腫瘤浸潤，進(jìn)而降低肺癌血管生成和增殖能力[29]。但是腫瘤浸潤中性粒細(xì)胞是否會(huì)直接增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力尚缺乏報(bào)道，我們的研究證明肺癌細(xì)胞可以直接激活中性粒細(xì)胞，并且活化的中性粒細(xì)胞可以分泌ATX促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲與遷移，ATX抑制劑HA130可以顯著反轉(zhuǎn)中性粒細(xì)胞的促肺癌轉(zhuǎn)移能力(圖1)。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ATX可以與肺癌細(xì)胞整合素β3結(jié)合，導(dǎo)致整合素下游SRC磷酸化的增加(圖4)，進(jìn)而直接增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，最終導(dǎo)致肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

研究表明ATX不僅有磷脂酶的作用，還作為分泌蛋白，以自分泌或旁分泌方式直接與靶細(xì)胞表面的整合素相互作用來調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的生物功能[19]。與報(bào)道一致的是，我們研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞的確可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的ATX蛋白合成與分泌(圖2)。但是ATX是通過怎樣的途徑調(diào)控肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的呢？ATX蛋白N端SMB結(jié)構(gòu)域可與血小板和CHO細(xì)胞的整合素αIIbβ3相結(jié)合進(jìn)而激活下游信號(hào)通路增強(qiáng)靶細(xì)胞的遷移能力[21]，同時(shí)整合素β3參與肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控[22]。CO-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)ATX可以直接與整合素β3結(jié)合，說明腫瘤浸潤中性粒細(xì)胞來源的ATX通過自分泌或旁分泌的調(diào)控肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。這一機(jī)制對(duì)進(jìn)一步闡明中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有一定意義。

腫瘤患者自身免疫能力較差，常伴隨感染等風(fēng)險(xiǎn)，因此完全靶向消除中性粒細(xì)胞可能對(duì)患者本身的免疫功能造成一定負(fù)面影響[30]，這一問題不容忽視且需要進(jìn)一步研究，因此基于文獻(xiàn)報(bào)道和我們的研究結(jié)果，可以考慮靶向腫瘤特異性中性粒細(xì)胞ATX基因的肺癌治療策略，減弱中性粒細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，從而達(dá)到減弱中性粒細(xì)胞促進(jìn)肺癌進(jìn)展的治療目的。

綜上所述，中性粒細(xì)胞通過ATX調(diào)控整合素β3促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，ATX抑制劑HA130顯著減弱中性粒細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。為進(jìn)一步研究中性粒細(xì)胞與肺癌之間的關(guān)系及ATX的功能具有一定的指導(dǎo)意義。靶向中性粒細(xì)胞ATX基因可能為肺癌患者臨床治療提供新的思路。

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