不同甘藍(lán)類蔬菜材料對(duì)根腫病的抗性鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇

蔣順順 劉才銘 趙 宇 胡文惠 吳嘉炳 李勤菲 任雪松 宋洪元 司 軍

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

根腫病是由蕓薹根腫菌（Woron.）侵染引起的土傳性病害，主要在十字花科植物之間傳播，被侵染的植株根部會(huì)出現(xiàn)腫瘤，十字花科植物都有被侵染的可能（彭琦 等，2019）。根腫病最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，目前全世界均有分布（費(fèi)維新 等，2016）。我國20 多個(gè)省、市、自治區(qū)均有十字花科蔬菜根腫病發(fā)生，西南地區(qū)和中部地區(qū)發(fā)病最為嚴(yán)重，一般產(chǎn)量損失20%～30%（張紅 等，2021）。近年來，隨著蔬菜種植面積逐年擴(kuò)大，商品種子的相互調(diào)運(yùn)，致使我國蔬菜根腫病的發(fā)病面積逐年擴(kuò)大，嚴(yán)重危害了十字花科蔬菜生產(chǎn)（王靖 等，2011）。植株被根腫菌侵染后，根部腫大，阻礙水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸導(dǎo)致地上部分枯萎，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全株死亡（伍文憲 等，2015）。根腫菌的休眠孢子在土壤中可以存活十余年之久，并且可以借由農(nóng)事活動(dòng)或以風(fēng)、水為媒介進(jìn)行傳播（馬淑青 等，2006）。在眾多根腫病防治措施中，選育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的措施，因此現(xiàn)在全球范圍內(nèi)都在大力開展抗根腫病育種工作。但由于甘藍(lán)類蔬菜抗根腫病資源比較缺乏，且根腫菌生理小種較多，因此抗根腫病育種進(jìn)程緩慢。

對(duì)育種材料進(jìn)行抗性鑒定是抗病育種的基礎(chǔ)，張小麗等（2016）對(duì)446 份青花菜材料進(jìn)行根腫病抗性鑒定，其中1.12%表現(xiàn)為抗病。黃蓉等（2019）對(duì)291 個(gè)油菜品種進(jìn)行根腫病抗性鑒定，其中9 號(hào)生理小種侵染的所有品種均未感病，4 號(hào)生理小種侵染的有5.26%的品種表現(xiàn)抗病。司軍等（2009）對(duì)19 份甘藍(lán)材料進(jìn)行根腫病抗性鑒定，篩選到3 份抗病材料。甘彩霞等（2017）對(duì)100 份蘿卜種質(zhì)進(jìn)行根腫病抗性鑒定，抗病種質(zhì)占13%，包括8 份白皮蘿卜、3 份紅皮蘿卜和2 份綠皮蘿卜。在根腫病抗性鑒定的過程中，為了保證發(fā)病情況穩(wěn)定一致，通常采取人工接種的方法進(jìn)行鑒定，目前普遍采用的人工接種方法有菌土法（司軍 等，2003）、蘸根法（Johnston，1968）和灌根法（朱紅芳 等，2016）。菌土法和蘸根法操作較為繁瑣、耗時(shí)，不適合大量材料的篩選鑒定；灌根法操作簡便，發(fā)病穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用于根腫病抗性鑒定。

利用根腫病抗性基因進(jìn)行新品種選育是抗根腫病育種必不可少的工作內(nèi)容。目前已經(jīng)報(bào)道了8 個(gè)大白菜上的根腫病抗性基因，分別為、、、、、、和，這些基因都已被定位在大白菜染色體上，且均為單基因顯性 遺 傳（Suwabe et al.，2003；Hirai et al.，2004；Piao et al.，2004；Sakamoto et al.，2008）。Kato 等（2013）研究表明，位于標(biāo)記KB59N07 和B1005之間的CRb基因與SSR 標(biāo)記B0902 緊密連鎖，從而能夠輔助選擇十字花科作物對(duì)根腫病的抗性。西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所根據(jù)先正達(dá)（中國）投資有限公司專利公布的與甘藍(lán)根腫病抗性基因相關(guān)的RAPD 標(biāo)記，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)特異條帶進(jìn)行回收、克隆后，成功將RAPD 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記（OA）（何海艷，2018），并利用SCAR標(biāo)記對(duì)不同抗、感根腫病甘藍(lán)材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，與人工接種根腫病抗性鑒定結(jié)果表現(xiàn)一致（宋瑩 等，2019）。因此，可以利用人工接種抗性鑒定結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇增強(qiáng)對(duì)根腫病抗性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)采用灌根法人工接種根腫菌4 號(hào)生理小種，對(duì)西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供的29 份甘藍(lán)類蔬菜材料進(jìn)行根腫病抗性鑒定；并利用SSR標(biāo)記（B0902）和SCAR 標(biāo)記（OA）進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，驗(yàn)證人工接種抗病性鑒定的準(zhǔn)確性。旨在篩選抗病和耐病的甘藍(lán)類蔬菜材料，為十字花科蔬菜抗根腫病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試29 份甘藍(lán)類蔬菜材料由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供，其種類、熟性、來源及育性詳見表1；以西園4 號(hào)為感病對(duì)照。

表1 供試甘藍(lán)類蔬菜材料的種類、熟性、來源及育性

供試根腫菌采集于重慶市武隆區(qū)發(fā)病的甘藍(lán)腫根，經(jīng)Williams 鑒別系統(tǒng)鑒定為4 號(hào)生理小種；用自來水把甘藍(lán)腫根表面雜質(zhì)清洗干凈，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 人工接種抗病性鑒定

1.2.1 菌液的制備 取備用甘藍(lán)腫根40 g，加去離子水200 mL，攪拌機(jī)搗碎后用3 層紗布過濾，將濾液稀釋至1 000 mL；取1 mL 孢子懸浮液，稀釋10 倍，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)休眠孢子濃度，將休眠孢子懸浮液稀釋至2 × 10個(gè)·mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫◤埣t 等，2016）。

1.2.2 接種 2020 年10 月5 日，將29 份甘藍(lán)類蔬菜材料及感病對(duì)照在西南大學(xué)溫室內(nèi)分別播種，采用50 孔穴盤基質(zhì)（草炭∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1）育苗；播種后每3 d 澆1 次水，出苗14 d后進(jìn)行間苗；之后每2 d 澆1 次水，每7 d 噴施2次營養(yǎng)液，溫室內(nèi)溫度保持25 ℃左右；3 次重復(fù)，每重復(fù)10 株。10 月26 日、幼苗兩葉一心時(shí)，將制備好的根腫菌休眠孢子懸浮液稀釋5 倍，用移液槍吸取根腫菌休眠孢子懸浮液5 mL，注射在幼苗根部；之后正常管理，注意預(yù)防蚜蟲、白粉虱等蟲害，陰雨連綿天氣適當(dāng)補(bǔ)充光照。

1.2.3 根腫病病情調(diào)查 接種42 d 后調(diào)查根腫病發(fā)病情況。根腫病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用陳靜等（2016）的方法：0 級(jí)，根系生長正常，無腫瘤；1 級(jí)，主根不發(fā)病，部分側(cè)根或須根上有較小腫瘤；2 級(jí)，主根發(fā)病較輕，輕微膨大，部分側(cè)根或須根有腫瘤，或者主根不發(fā)病，較多側(cè)根或須根有明顯腫瘤；3 級(jí)，主根發(fā)病較重，異常膨大、龜裂，有明顯側(cè)根或須根；4 級(jí)，根系幾乎無側(cè)根或須根，主根異常膨大、龜裂或者腐爛。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）× 100%

病情指數(shù)（DI）=Σ（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)值）／（調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)值）× 100

群體抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用司軍等（2003）的方法：免疫（I），病情指數(shù)=0；高抗（HR），0 ＜病情指數(shù)≤5；抗病（R），5 ＜病情指數(shù)≤20；耐?。═），20 ＜病情指數(shù)≤30；感?。⊿），病情指數(shù)＞30。

1.3 分子標(biāo)記鑒定

1.3.1 DNA 的提取 采集人工接種抗病性鑒定表現(xiàn)抗病和耐病的甘藍(lán)類蔬菜材料的幼嫩葉片，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray &Thompson，1980）提取單株DNA 作為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，利用Nanodrop 2000 分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 本試驗(yàn)采用的SCAR 標(biāo)記引物為OA（何海艷，2018），其引物序列見表2。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：100 ng·L的DNA 模板1 μL，1.0 μmol·L的上、下游引物各0.5 μL，10 mmol·L的dNTP 0.5 μL，酶1 μL，最 后加ddHO 補(bǔ)齊至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，7 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，22 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 本試驗(yàn)采用的SSR 標(biāo)記引物為B0902（沈舒，2019），其引物序列見表2。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：100 ng·L的DNA 模板1 μL，1.0 μmol·L的上、下游引物各0.5μL，10 mmol·L的dNTP 0.5 μL，酶1 μL，最后加ddHO 補(bǔ)齊至25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

表2 OA 和B0902 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 人工接種抗病性鑒定

從表3 可以看出，感病對(duì)照西園4 號(hào)100%發(fā)病，病情指數(shù)為67.71，抗性分級(jí)為感病，說明本試驗(yàn)采用的接種方法準(zhǔn)確可靠。參試的29 份材料中，Cr7 表現(xiàn)免疫，綠抗9 號(hào)和青蓮甘藍(lán)表現(xiàn)高抗，S148、Cr5、Cr6 表現(xiàn)抗病，S146 和S296 表現(xiàn)耐病，其余材料表現(xiàn)為感病。

表3 29 份甘藍(lán)類蔬菜材料人工接種抗病性鑒定結(jié)果

2.2 分子標(biāo)記鑒定

對(duì)人工接種抗病性鑒定表現(xiàn)免疫、高抗、抗病、耐病的8 份甘藍(lán)類蔬菜材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定。

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1 所示，Cr5、綠抗9 號(hào)、青蓮甘藍(lán)、S296 等4 份材料擴(kuò)增出大小為500 bp 的特異條帶，而Cr6、Cr7、S148、S146沒有擴(kuò)增出特異條帶。由此可以判斷Cr5、綠抗9號(hào)、青蓮甘藍(lán)、S296 攜帶抗病基因。

圖1 OA 對(duì)8 份甘藍(lán)類蔬菜材料的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示，8 份材料都擴(kuò)增出大小為180 bp 的特異條帶，由此可以判斷這8 份材料都攜帶抗病基因CRb。

圖2 B0902 對(duì)8 份甘藍(lán)類蔬菜材料的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

十字花科植物的根腫病危害近年來呈擴(kuò)大趨勢(shì)，然而目前甘藍(lán)類蔬菜抗病資源缺乏，在根腫病防控方面，傳統(tǒng)的化學(xué)、生物和農(nóng)業(yè)防治措施效果欠佳。因此，選育抗根腫病品種是最有效的途徑，而篩選鑒定抗病材料是抗病育種的基礎(chǔ)。肖崇剛和郭向華（2002）、孫超等（2016）通過苗期人工接種抗性鑒定，篩選出不同抗性的甘藍(lán)材料，可應(yīng)用到抗病育種中。本試驗(yàn)從29 份甘藍(lán)類蔬菜材料中篩選出8 份抗根腫病材料，為甘藍(lán)類蔬菜抗根腫病育種奠定了基礎(chǔ)。

甘藍(lán)類蔬菜抗根腫病材料的人工接種鑒定易受環(huán)境影響、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，選擇準(zhǔn)確性不夠高，采取分子標(biāo)記輔助選擇可大大減少鑒定的工作量，明顯縮短育種進(jìn)程，加快新品種選育。戰(zhàn)宗祥等（2015）運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇成功選育了具有根腫病抗性的甘藍(lán)型油菜新品種華雙5 號(hào)；李倩等（2021）利用分子標(biāo)記輔助選擇培育了抗根腫病甘藍(lán)型油菜新品種華油雜62R；徐學(xué)忠等（2015）利用分子標(biāo)記輔助選擇培育了抗根腫病大白菜新品種CCR11242。在十字花科作物抗根腫病育種中，利用分子標(biāo)記輔助選擇多在甘藍(lán)型油菜和大白菜中應(yīng)用，在甘藍(lán)中報(bào)道較少，這與根腫病抗性基因多存在于蕪菁和大白菜中有關(guān)。本試驗(yàn)利用SCAR 標(biāo)記（OA）與SSR 標(biāo)記（B0902）對(duì)表現(xiàn)免疫、高抗、抗病、耐病的8 份甘藍(lán)類蔬菜材料進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)果表明4 份材料含有基因，8 份材料含有CRb基因，其中Cr5、綠抗9 號(hào)、青蓮甘藍(lán)、S296 含有基因和CRb基因2 個(gè)抗性位點(diǎn)，可將這4 份材料直接應(yīng)用到甘藍(lán)抗根腫病育種中，而Cr5、綠抗9 號(hào)、青蓮甘藍(lán)是雄性不育材料，需要利用專用恢復(fù)系進(jìn)行育性恢復(fù)，然后再應(yīng)用到抗病育種中（Li et al.，2021）。