淡水魚中3 種吸蟲囊蚴多重PCR 檢測方法的建立

高俊峰，王 鑫，毛瑞鋒，孫云異，王春仁，黃翠琴*

（1.龍巖學院生命科學學院/福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室/寄生蟲研究室，福建 龍巖 364012；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

魚源性吸蟲（Fishborne zoonotic trematodes，F(xiàn)BT）是食源性寄生蟲的一類，主要通過魚類傳播，人和動物通過食入生的或未熟的含有吸蟲囊蚴的魚而感染，其中多種吸蟲是對人類和動物造成嚴重危害的人獸共患寄生蟲[1]。據(jù)估計僅亞洲就有7.5 億人有感染魚源性吸蟲的風險，給公共衛(wèi)生安全帶來巨大的威脅[2]。本研究室在前期對烏裕爾河流域淡水魚的吸蟲囊蚴調(diào)查時發(fā)現(xiàn)并鑒定了3 種形態(tài)的吸蟲囊蚴，分別為華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）、東方次睪吸蟲（Metorchis orientalis）和日本全冠吸蟲（Holostephanus dubinini）[3]。

華支睪吸蟲（C. sinensis）是魚源性吸蟲的代表蟲種，全球約有3 500 萬人感染華支睪吸蟲病，主要分布于亞洲，是一種十分重要的人獸共患寄生蟲[4]。華支睪吸蟲寄生于宿主的膽囊和肝膽管內(nèi)，可引起宿主膽管炎、膽結(jié)石和肝硬化，還可誘發(fā)膽管上皮細胞癌，已被國際癌癥研究機構(gòu)分類為I 類生物致癌物[4]。東方次睪吸蟲（M. orientalis）主要寄生于家禽和一些哺乳動物（包括人）的膽囊和膽管內(nèi)，可引起與華支睪吸蟲相似的臨床癥狀。關(guān)于東方次睪吸蟲病的報道較少，我國報道主要見于江蘇省和福建省[5]。由于其與華支睪吸蟲的生活史和臨床癥狀極其相似，臨床上東方次睪吸蟲病極易被誤診為華支睪吸蟲病，因此，東方次睪吸蟲是一種易被忽視的人獸共患寄生蟲。日本全冠吸蟲（H. dubinini）是一種主要感染禽類的吸蟲，寄生于宿主的腸道，可引起宿主貧血，消瘦和共濟失調(diào)等臨床癥狀，關(guān)于該蟲的報道較少，中國偶有關(guān)于日本全冠吸蟲感染禽類的報道[6]。

雖然3 種吸蟲成蟲的形態(tài)易于區(qū)別，但寄生于淡水魚體內(nèi)的吸蟲囊蚴形態(tài)極其相似，需要具有豐富臨床經(jīng)驗的專業(yè)人員才可以區(qū)分，而且形態(tài)學鑒定為主觀判斷，易造成誤判。因此，依靠形態(tài)學鑒定淡水魚吸蟲囊蚴有很大局限。那璐等報道了一種檢測家禽糞便中東方次睪吸蟲蟲卵的PCR 方法，并對臨床樣品進行了檢測，該方法與已知陰陽性樣品的符合率為100%[7]。楊慶利等基于核糖體ITS 和線粒體COX1 基因建立了一種鑒別華支睪吸蟲囊蚴的分子診斷方法[8]。但是關(guān)于這3 種囊蚴的多重PCR 方法還未見報道。因此，本研究建立一種可以鑒別檢測華支睪吸蟲、東方次睪吸蟲和日本全冠吸蟲3 種吸蟲囊蚴的多重PCR 方法，為魚源性吸蟲囊蚴的檢測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 吸蟲囊蚴華支睪吸蟲囊蚴、東方次睪吸蟲囊蚴和日本全冠吸蟲囊蚴均收集于烏裕爾河流域淡水魚，由本實驗室分離鑒定并保存；鴨對體吸蟲、舟形嗜氣管吸蟲、橫川后殖吸蟲和卷棘口吸蟲由本實驗室保存。

1.2 主要試劑組織DNA 小劑量提取試劑盒購自O(shè)MEGA bio-tek 公司；ExTaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD18-T 均購自寶生物工程（大連）有限公司；DH5α 感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Gel Extraction Kit 和Plasmid Miniprep Kit 均購自康寧生命科學（吳江）有限公司。

1.3 引物設(shè)計根據(jù)GenBank 中登錄的華支睪吸蟲的線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位V（nad5）（KC170241）、東方次睪吸蟲的線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位II（nad2）（KT239342）和日本全冠吸蟲的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）（AY245707）基因序列，利用Primer5.0 分別設(shè)計特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 3種吸蟲囊蚴特異性引物序列信息Table 1 Specific primer sequences for the three kinds of trematode metacercariae

1.4 目的基因的擴增及重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建參照文獻[9]分別提取3 種吸蟲單囊蚴的總DNA，以其為模板進行單一PCR 擴增。反應體系均為25 μL：其中10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（500 nmol/L）各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ExTaqDNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O 調(diào)整總體積至25 μL。PCR反應條件為：92 ℃2 min；92 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增獲得的3 種吸蟲囊蚴的目的基因片段分別克隆于pMD18-T 載體，構(gòu)建的重組質(zhì)粒由生工生物工程（上海）有限公司測序，測序結(jié)果通過與GenBank 中登錄的相應基因序列進行BLAST 同源性對比分析無誤后，利用超微量核酸蛋白分析儀測定重組質(zhì)粒的濃度，計算的拷貝數(shù)后作為質(zhì)粒標準品用于后續(xù)試驗。

1.5 多重PCR 方法的建立及反應條件的優(yōu)化將3種吸蟲囊蚴質(zhì)粒標準品統(tǒng)一稀釋為107拷貝/μL 后等比混合作為模板，采用方陣法對多重PCR 反應的引物濃度（300 nmol/L～600 nmol/L）和退火溫度（49 ℃～53 ℃）進行優(yōu)化。每次試驗均設(shè)置ddH2O 陰性對照。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 特異性試驗以參照文獻[9]分別提取的鴨對體吸蟲、舟形嗜氣管吸蟲、橫川后殖吸蟲和卷棘口吸蟲4 種常見吸蟲的基因組DNA，以及華支睪吸蟲、東方次睪吸蟲、日本全冠吸蟲質(zhì)粒標準品等比混合后為模板，并以ddH2O 為陰性對照，采用已優(yōu)化的多重PCR條件進行檢測，以評價該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗將濃度為107拷貝/μL 的華支睪吸蟲、東方次睪吸蟲和日本全冠吸蟲質(zhì)粒標準品10倍倍比稀釋后，利用已優(yōu)化的多重PCR 方法進行檢測，以評價該方法的敏感性。

1.8 臨床樣品檢測于黑龍江各地隨機采集52尾淡水魚，采用組織DNA小劑量提取試劑盒提取其肌肉組織DNA為模板，利用本研究所建立的多重PCR方法檢測，同時利用魚肉消化法結(jié)合囊蚴形態(tài)學鑒定法[3]檢測，將檢測結(jié)果與本研究所建立方法的檢測結(jié)果比較分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR 反應條件的優(yōu)化結(jié)果通過對反應體系中引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，確定最佳反應體系為：10×Ex Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，3 種吸蟲囊蚴的引物各0.5 μL，質(zhì)粒DNA 模板各0.2 μL，ExTaqDNA 聚合酶0.2 μL，加ddH2O 調(diào)整總體積至25 μL。PCR 最佳反應條件為：92 ℃2 min；92 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃7 min。經(jīng)電泳檢測可觀察到在約500 bp（東方次睪吸蟲）、300 bp（華支睪吸蟲）和200 bp（日本全冠吸蟲）處各有單一的條帶，與預期產(chǎn)物大小相符（圖1）。采用3對引物對混合模板進行擴增，結(jié)果顯示，3 種吸蟲囊蚴均出現(xiàn)單一條帶，且易于區(qū)分（圖2），表明該多重PCR 方法可以用于不同吸蟲囊蚴的檢測。3 種重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果顯示3 條插入目的基因分別為508 bp，311 bp 和208 bp，基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄的相應吸蟲基因同源性均為100%，表明重組質(zhì)粒標準品構(gòu)建正確。經(jīng)計算重組質(zhì)粒濃度分別為1.03×108拷貝/μL、2.52×108拷貝/μL 和1.24×108拷貝/μL。

圖1 單一PCR擴增結(jié)果Fig.1 Results of single PCR amplification

圖2 多重PCR擴增結(jié)果Fig.2 Results of multiplex PCR amplification

2.2 多重PCR 方法的特異性試驗結(jié)果利用本研究建立的多重PCR 方法檢測3 種吸蟲囊蚴和其他4種常見吸蟲，結(jié)果顯示華支睪吸蟲、東方次睪吸蟲和日本全冠吸蟲均出現(xiàn)大小相符的目的條帶，而其他種吸蟲的擴增結(jié)果均為陰性（圖3），表明本研究建立的多重PCR方法具有較強的特異性。

圖3 多重PCR特異性試驗結(jié)果Fig.3 Specificity test of the multiplex PCR

2.3 多重PCR 方法的敏感性試驗結(jié)果本研究對5個稀釋度的3 種吸蟲囊蚴的重組質(zhì)粒標準品進行檢測。結(jié)果顯示，該方法對東方次睪吸蟲和華支睪吸蟲重組質(zhì)粒標準品的檢測下限為104拷貝/μL，而日本全冠吸蟲重組質(zhì)粒標準品DNA為103拷貝/μL 時仍能檢測出條帶（圖4）。表明3 種吸蟲囊蚴在模板濃度為104拷貝/μL 時均能檢測到目的條帶，因此本研究建立的多重PCR 檢測方法具有較高的敏感性。

圖4 多重PCR敏感性試驗結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of the multiplex PCR

2.4 臨床樣品的檢測利用本研究建立的多重PCR方法對52 尾淡水魚肌肉組織DNA 進行檢測，結(jié)果顯示共有30 尾淡水魚感染吸蟲囊蚴，感染率為42.3%。其中無東方次睪吸蟲囊蚴單獨感染的情況，華支睪吸蟲囊蚴單獨感染陽性樣品4 份，日本全冠吸蟲囊蚴單獨感染陽性樣品1 份，多數(shù)樣品呈兩種或3 種吸蟲囊蚴混合感染（表2）。本研究建立的多重PCR 檢測方法的結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的結(jié)果一致，表明本研究所建立的多重PCR方法可用于臨床樣品檢測，且表明淡水魚中這3種吸蟲感染率較高，應給予重視。

表2 臨床樣品多重PCR的檢測結(jié)果Table 2 The detection results of clinical samples by the multiplex PCR assay

3 討 論

本實驗室前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，烏裕爾河流域淡水魚中含有大量吸蟲囊蚴，主要為華支睪吸蟲囊蚴、東方次睪吸蟲囊蚴和日本全冠吸蟲囊蚴[3]。這些吸蟲囊蚴形態(tài)十分相似，易造成誤判。吸蟲囊蚴鑒定另一種可靠的方法是將囊蚴人工接種動物，進行動物還原實驗，再通過對成蟲的形態(tài)學鑒定，來反向鑒定囊蚴的種類，該方法雖然能對囊蚴準確鑒定，但耗時耗力，鑒定的數(shù)量和種類不易太多，存在不適合流行病學調(diào)查和大面積推廣等缺點[10]。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，PCR 技術(shù)已廣泛應用于病原的快速檢測。與常規(guī)檢測技術(shù)相比，該方法不僅縮短了檢測時間，而且節(jié)約了人力和物力，為病原的快速檢測提供了可靠的依據(jù)。因此，本研究建立了多重PCR 方法檢測這3 種淡水魚吸蟲囊蚴，該方法具有特異性強和敏感性高的優(yōu)勢，解決了常規(guī)檢測中誤檢、漏檢和耗時等問題，可準確檢測到3 種吸蟲囊蚴的存在。在建立多重PCR 方法中，特異性引物的設(shè)計是關(guān)鍵。本研究中由于華支睪吸蟲和東方次睪吸蟲均屬于后睪科成員，且基因序列十分相似。因此，在引物設(shè)計時通過大量標記基因的比對分析，最終確定了針對兩種吸蟲線粒體中變異性較大的nad2和nad5基因設(shè)計引物，經(jīng)多次重復實踐改良，最終選取了特異性最強的引物，避免了引物二聚體的產(chǎn)生，并且目的片段清晰。特異性試驗結(jié)果也證實了本研究選擇引物的特異性，且該方法與其他常見寄生蟲無交叉反應。

先前研究表明PCR 方法可檢測到單個蟲卵1∶16倍稀釋后的樣品濃度[7]，本方法敏感性試驗表明3 種吸蟲囊蚴在模板濃度為104拷貝/μL時均能檢測到目的條帶，可見本研究建立的多重PCR檢測方法可滿足檢測到一個囊蚴的要求，具有較高的敏感性。

本研究建立的多重PCR 方法可同時檢測華支睪吸蟲、東方次睪吸蟲和日本全冠吸蟲，操作簡單快速，且具有較好的敏感性和特異性。利用該方法對淡水魚樣品進行檢測，結(jié)果顯示該方法與傳統(tǒng)的形態(tài)學檢測方法結(jié)果一致。本研究首次建立的該多重PCR 方法為魚源性吸蟲病的快速檢測及鑒別診斷提供了重要的技術(shù)手段，為預防魚源性寄生蟲病奠定了基礎(chǔ)，具有重要的社會公共衛(wèi)生學意義。