紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠的作用及機(jī)制

巴慶華 崔傳舉

1）河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000 2）鄭州市第一人醫(yī)院，河南 鄭州 450000

腦卒中具有較高的發(fā)病率、致殘率和病死率，嚴(yán)重威脅中老年人健康，特別是肥胖且伴高血壓人群［1］。尋找具有明確療效且作用機(jī)制清晰的預(yù)防和治療腦卒中的藥物是目前研究的前沿課題。研究報(bào)道，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）激活的核因子紅細(xì)胞相關(guān) 因 子（nuclear factor erythroid related factor-2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，其中ERK1/2信號(hào)通路的激活能夠介導(dǎo)Bcl-2表達(dá)增加，減少谷氨酸毒性的同時(shí)減少氧化應(yīng)激反應(yīng)與神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)功能保護(hù)作用［2］。紅景天苷為薔薇科草本植物紅景天（Rhodiold rosea L.）干燥根莖中的主要成分，目前研究顯示該成分具有顯著的氧自由基清除、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗炎癥反應(yīng)作用［3］。此外，紅景天苷能夠改善腦缺血再灌注大鼠缺血區(qū)水腫程度，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化水平，減少炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而提高大鼠神經(jīng)功能，發(fā)揮腦保護(hù)作用［4］。研究顯示，紅景天提取物能夠介導(dǎo)ERK通路的上調(diào)并改善低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷［5］。通過(guò)中動(dòng)脈栓塞后再灌注方法建立模型，基于ERK 1/2 激活的Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，研究紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，為紅景天苷應(yīng)用于臨床治療的合理使用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只7 周齡SD 雄性大鼠，體質(zhì)量（170±5）g，購(gòu)自于南京君科生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0056。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（24±2）℃，房間內(nèi)濕度（60±5）%，光照時(shí)間為12 h/12 h日夜，自由攝食飲水，3只/籠。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 紅景天苷（西安開來(lái)生物公司，純度≥98%）；尼龍圓頭線栓（廣州佳靈生物科技公司）；2，3，5-三苯基氯化銨（TTC）染料（武漢塞維爾生物公司）；RIPA 裂解液，β-actin 抗體（上海碧云天生物科技公司）；GSH-PX試劑盒、SOD 試劑盒、MDA試劑盒、BCA 試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物科技公司；t-ERK1/2、p-ERK1/2、Caspase-3、cleaved- Caspase-3、Bcl-2、Bax 均購(gòu)自于北京博奧森生物公司；t-Nrf2、Nuclear-Nrf2、HO-1、GAPDH均購(gòu)自于美國(guó)Affinity公司。羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與建模 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham）、腦缺血組（MCAO）、紅景天苷組（50 mg·kg-1，salidroside）和紅景天苷+PD98059組（50 mg·kg-1+1 mg·kg-1）。參考文獻(xiàn)［6］中造模方法對(duì)大鼠進(jìn)行中動(dòng)脈腦缺血再灌注手術(shù)造模。各組大鼠完全麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，固定四肢，頸部去毛。自胸骨柄至下頜骨正中切開約0.5 cm縱向傷口，鈍性分離出肌肉組織并暴露出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈。永久性結(jié)扎頸外動(dòng)脈，暫時(shí)性封閉頸內(nèi)動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈結(jié)扎位點(diǎn)與分叉口之間開一小口，插入線栓并前進(jìn)至頸內(nèi)動(dòng)脈，固定線栓阻塞血液流通，2 h后拔出線栓，恢復(fù)頸動(dòng)脈供血。腦缺血手術(shù)前2 h 各組大鼠腹腔注射對(duì)應(yīng)劑量紅景天苷或等體積生理鹽水，此外，ERK1/2 抑制劑PD98059 為術(shù)前2 h 尾靜脈注射。腦缺血再灌注24 h 后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，之后深度麻醉大鼠取腦組織。

1.4 TTC染色 深度麻醉大鼠，斷頭后輕輕撥開腦殼，取出完整腦組織，-20 ℃冰凍10 min，以腦組織硬度適中，易于切片最為適宜。將腦組織連續(xù)切成冠狀切片，按順序鋪開并在2% TTC溶液中避光孵育15 min，以腦組織未梗死區(qū)域染成深紅色為終點(diǎn)，此時(shí)梗死區(qū)域呈白色，抽去TTC 染液，加入4%多聚甲醛溶液固定后拍照分析。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 腦缺血再灌注24 h 后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，應(yīng)用18 分量表法評(píng)估腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能損傷，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］：（1）在無(wú)刺激條件下，觀察5 min 內(nèi)大鼠在鼠籠中的自發(fā)運(yùn)動(dòng)情況（0～3 分）；（2）在身體懸空條件下，觀察大鼠四肢伸展情況（0～3 分）；（3）僅在后肢懸空條件下觀察大鼠靠前行走，前肢的伸展運(yùn)動(dòng)情況（0～3 分）；（4）將大鼠置于垂直鼠籠上，觀察大鼠攀爬鼠籠能力（1～3 分）；（5）將大鼠置于鼠籠中，用木棒刺激大鼠，觀察大鼠身體觸覺(jué)反射（1～3 分）；（6）將大鼠置于鼠籠中，用木棒觸碰大鼠觸須，觀察大鼠觸覺(jué)反射。

1.6 TUNEL 染色 深度麻醉大鼠，PBS 溶液灌注，沖盡血液，取完整腦組織，4 ℃條件下應(yīng)用4%多聚甲醛溶液固定至少48 h。取出腦組織，應(yīng)用蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水，待腦組織完全沉底，取出腦組織使用石蠟包埋，使用自動(dòng)切片機(jī)切成5 μm厚的切片組織并固定于載玻片上。60 ℃烘箱烤片，二甲苯脫蠟，應(yīng)用乙醇溶液梯度水化。滴加TUNEL 反應(yīng)混合液，濕盒中孵育2 h，PBS 洗滌3 遍，滴加DAB 溶液染色后，以蘇木精復(fù)染，最后中性樹膠封片。

1.7 抗氧化酶、氧化因子的檢測(cè) 深度麻醉大鼠，斷頭后輕輕撥開腦殼，取完整腦組織并鑷取缺血側(cè)皮層組織，加入PBS 溶液，4 ℃條件下超聲輔助微球勻漿破壁10 min，靜置30 min 后，12 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液應(yīng)用BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，嚴(yán)格遵守各試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組織中抗氧化酶、氧化因子表達(dá)。

1.8 Western blot 取完整腦組織并鑷取缺血側(cè)皮層組織，加入RIPA裂解液后，4 ℃條件下超聲輔助微球勻漿破壁10 min，再靜置30 min 讓蛋白充分裂解。12 000 r/min 條件下離心30 min，取上清液應(yīng)用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算各組蛋白濃度，應(yīng)用RIPA裂解液稀釋至蛋白定量，按照4∶1體積比加入上樣緩沖液，沸水浴10 min 使蛋白變性。應(yīng)用SDS-PAGE電泳分離蛋白，以30 μg蛋白等量上樣，設(shè)置條件恒壓60 V/30 min與120 V/60 min。電泳結(jié)束后，濕法將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，條件為恒流200 mA，60 min，冰水冷敷。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后脫脂奶粉封閉2 h，再孵育一抗，4 ℃條件下過(guò)夜。次日，TBST溶液洗滌，結(jié)束后加入二抗稀釋液，室溫孵育2 h 后，TBST洗凈條帶，均勻涂抹發(fā)光液顯影成像。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能未受影響，評(píng)分均為18分；與假手術(shù)組比較，腦缺血組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05）；與腦缺血組相比，紅景天苷組神經(jīng)功能評(píng)分升高（P＜0.05）。然而，與紅景天苷組相比，紅景天苷+PD98059 組神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與腦缺血組比較，*P＜0.05；與紅景天苷組比較，+P＜0.05Figure 1 Neurological scores of rats in each group.Compared with MCAO group，*P＜0.05；compared with salidroside group，+P＜0.05

2.2 紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織梗死面積的影響 假手術(shù)組TTC 染色全部為紅色，腦缺血組大鼠腦中出現(xiàn)白色梗死區(qū)域；與腦缺血組比較，紅景天苷組局部梗死面積減少（P＜0.05）；與紅景天苷組比較，紅景天苷+PD98059組大腦局部梗死面積增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腦組織梗死面積及量化統(tǒng)計(jì)與腦缺血組比較，*P＜0.05；與紅景天苷組比較，+P＜0.05Figure 2 Cerebral infarction area and quantitation of rats in each group. Compared with MCAO group，*P＜0.05；compared with salidroside group，+P＜0.05

2.3 紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦中神經(jīng)元凋亡的影響 TUNEL染色顯示，與假手術(shù)組比較，腦缺血組大鼠腦組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增加（P＜0.05）；與腦缺血組比較，紅景天苷組腦組織中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05）；與紅景天苷組比較，紅景天苷+PD98059 組大鼠腦中TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠腦組織TUNEL染色 與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與腦缺血組比較，*P＜0.05；與紅景天苷組比較，+P＜0.05 Figure 3 TUNEL staining in brain of rats in each group. Compared with sham group，#P＜0.05；Compared with MCAO group，*P＜0.05；Compared with salidroside group，+P＜0.05

2.4 紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組相比，腦缺血組大鼠腦中抗氧化酶SOD、GSH-PX活力顯著降低（P＜0.05），氧化因子MDA 含量顯著增加（P＜0.05）；與腦缺血組比較，紅景天苷組腦中抗氧化酶SOD、GSH-PX 活力增加（P＜0.05），且腦中MDA含量降低（P＜0.05）；與紅景天苷組相比，紅景天苷+PD98059 組抗氧化酶SOD、GSH-PX 活力降低（P＜0.05），MDA 含量升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦中凋亡相關(guān)蛋白的影響 與假手術(shù)組比較，腦缺血組大鼠腦中抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)增加（P＜0.05）；與腦缺血組大鼠比較，紅景天苷組腦組織中Bcl-2 表達(dá)增加（P＜0.05），Bax 與cleaved-caspase-3 表達(dá)減少（P＜0.05）；與紅景天苷組比較，紅景天苷+PD98059 組大鼠腦組織中Bcl-2 表達(dá)減少，Bax、cleaved-caspase-3表達(dá)增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠腦組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與腦缺血組比較，*P＜0.05；與紅景天苷組比較，+P＜0.05 Figure 5 Expression of apoptosis-related proteins in brain of rats in each group. Compared with sham group，#P＜0.05；compared with MCAO group，*P＜0.05；compared with salidroside group，+P＜0.05

2.6 紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦中ERK1/2激活的Nrf2 / HO-1 信號(hào)通路的影響 與腦缺血組相比，紅景天苷組大鼠腦中ERK1/2 磷酸化水平增加（P＜0.05），Nrf2 / HO-1 信號(hào)通路蛋白激活（P＜0.05）；與紅景天苷組對(duì)比，紅景天苷+PD98059 組腦組織中ERK1/2 激活受到抑制（P＜0.05），Nrf2 /HO-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠腦組織中ERK1/2 激活的Nrf2 / HO-1 信號(hào)通路蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與腦缺血組比較，*P＜0.05；與紅景天苷組比較，+P＜0.05Figure 6 Expression of ERK1/2-activated Nrf2/HO-1 signaling pathway proteins in brain of rats in each group.Compared with sham group，#P＜0.05；compared with MCAO group，*P＜0.05；compared with salidroside group，+P＜0.05

3 討論

目前，神經(jīng)元凋亡是缺血性腦卒中重要的病理特征，也是繼發(fā)神經(jīng)功能障礙的重要機(jī)制［8］。神經(jīng)元凋亡會(huì)誘導(dǎo)促細(xì)胞凋亡因子cleaved-caspase-3、Bax表達(dá)，抑制抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)［9］。腦缺血再灌注模型造成腦組織出現(xiàn)大面積梗死，且TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加，cleaved-caspase-3、Bax 表達(dá)增加，Bcl-2 表達(dá)減少，最終導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低，提示大鼠腦缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)功能損傷模型構(gòu)建成功。此外，紅景天苷減少了大鼠腦中TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與腦梗死體積，增加了大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。然而，ERK1/2 抑制劑PD98059 干預(yù)逆轉(zhuǎn)了紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠的治療效果，提示紅景天苷可能是基于ERK1/2激活改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能。

大部分研究報(bào)道，氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注誘發(fā)神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制［10-11］。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖整合、炎性細(xì)胞因子分泌和氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。Nrf2被認(rèn)為是氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)因子，Nrf2通常位于細(xì)胞質(zhì)中，與Keap蛋白結(jié)合且不表達(dá)活性［12］。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，Nrf2 與Keap 解聯(lián)且發(fā)生磷酸化反應(yīng)并移位至核內(nèi)，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)原件序列結(jié)合，增強(qiáng)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄［13］。HO-1作為Nrf2的靶分子，是生物體內(nèi)重要的抗氧化基因，外界受到氧化應(yīng)激時(shí)，HO-1在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)顯著增加，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究顯示，紅景天苷通過(guò)提高ERK1/2 磷酸化，激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化作用，主要表現(xiàn)為SOD 與GSH-PX 酶活力增加，MDA 含量降低。此外，紅景天苷在抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，也降低了促凋亡蛋白Bax 與cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)元凋亡，從而減少了大鼠局部梗死面積，增加大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。

研究顯示，ERK1/2 的活化是Nrf2 激活的抗氧化轉(zhuǎn)錄通路的中心環(huán)節(jié)［14］。ZHAO等［15］研究顯示，ERK抑制劑PD98059能夠拮抗Nrf2激活介導(dǎo)的抗炎抗氧化作用，逆轉(zhuǎn)炎癥因子的釋放與氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。WANG 等［16］研究顯示，大鼠腦中ERK 磷酸化增加能促進(jìn)低血管內(nèi)穿刺構(gòu)建的大鼠腦蛛網(wǎng)膜下腔部位水腫程度改善，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。此外，JIANG等［17］認(rèn)為抑制ERK1/2表達(dá)造成的細(xì)胞損傷可能與神經(jīng)炎癥相關(guān)，且神經(jīng)炎癥會(huì)誘發(fā)和加重缺氧缺血性腦損傷。正常生理?xiàng)l件下，ERK1/2與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)為無(wú)活性狀態(tài)，磷酸化水平表達(dá)較低。在腦缺血誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)條件下，ERK1/2激活，誘導(dǎo)Nrf2磷酸化，應(yīng)對(duì)機(jī)體大量產(chǎn)生的氧化因子，發(fā)揮抗氧化作用［18］。本研究顯示，ERK1/2 抑制劑明顯逆轉(zhuǎn)了紅景天苷對(duì)大鼠局部梗死的改善作用，升高氧化應(yīng)激因子MDA 含量，降低抗氧化應(yīng)激酶SOD 與GSH-PX 酶活力，加劇腦組織中的神經(jīng)元凋亡。

本研究采用中動(dòng)脈栓塞構(gòu)建腦缺血再灌注模型，模擬了臨床上急性腦卒中引起的不同程度腦組織缺血損傷，更接近臨床患者的病理生理，能夠用于臨床腦缺血損傷規(guī)律及藥物療效的等效評(píng)估。此外，本研究探究了紅景天苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠改善作用的機(jī)制，顯示紅景天苷可能通過(guò)ERK1/2激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，減少氧化應(yīng)激因子水平，逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元凋亡，從而改善大腦中動(dòng)脈栓塞誘發(fā)的缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷，為臨床上開發(fā)急性腦卒中誘發(fā)不同程度腦損傷藥物提供了一些思路。