他克林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用

蔡金霞，黃明光，胡傳活，張 鑫，梁瑩瑩，紀(jì)偉霞，馮 妮，葛晨玲，陳志英，李 珣，王曉曄

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西畜牧研究所，南寧 530001)

【研究意義】養(yǎng)殖場(chǎng)中動(dòng)物炎癥時(shí)有發(fā)生，而炎癥的存在對(duì)生殖會(huì)產(chǎn)生一定影響，如公畜的睪丸炎會(huì)抑制精子發(fā)生和成熟，降低其質(zhì)量和繁殖能力[1]；母畜的乳房炎導(dǎo)致泌乳能力下降，致使幼仔斷奶后成活率降低[2]，嚴(yán)重時(shí)甚至危及母畜生命，影響其利用價(jià)值和使用年限[3-4]。睪丸炎多由細(xì)菌感染引起，而脂多糖( Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，可引起動(dòng)物機(jī)體組織和細(xì)胞分泌炎性因子，動(dòng)物體內(nèi)極少量的LPS即可引起廣泛的炎癥反應(yīng)[5-6]。睪丸支持細(xì)胞(Sertoli cells，SCs)是眾多環(huán)境污染物作用于雄性生殖系統(tǒng)最重要的靶細(xì)胞，也是動(dòng)物體內(nèi)和體外試驗(yàn)中評(píng)價(jià)雄性生殖系統(tǒng)毒性損傷的良好模型[7]。由于SCs在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此任何影響或引起其功能異常的因素均可使精子發(fā)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致不育[8]。他克林是用于治療阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)的第1種藥物，具有很高的脂溶性，容易透過(guò)血腦屏障，具有抑制組織中乙酰膽堿酯酶活性、增加乙酰膽堿含量、作為受體激動(dòng)劑促進(jìn)乙酰膽堿釋放、促進(jìn)腦組織對(duì)葡萄糖利用而提高記憶力和學(xué)習(xí)能力及下調(diào)Kv2.1通道表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖等藥理作用[9]。廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，他克林在豬精子液態(tài)保存和冷凍保存方面具有很好的抗凋亡效果[10-11]。但是，目前關(guān)于他克林對(duì)雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞炎性損傷作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，分析他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞(Mouse testis sertoli cells，TM4)炎性損傷的保護(hù)作用，可為雄性動(dòng)物生殖疾病相關(guān)抗炎藥物的利用及精子質(zhì)量提高提供更多藥物選擇?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Hu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，0.05、0.10和0.15 mmol/L他克林均可顯著或極顯著提高豬精子的凍后質(zhì)量，其中0.10 mmol/L的處理效果最佳。黃明光等[11]研究表明，他克林對(duì)豬精液的常溫和低溫保存具有積極作用，以0.10 mmol/L的處理效果最佳，說(shuō)明稀釋液中他克林濃度為0.10 mmol/L時(shí)能延長(zhǎng)豬精子的壽命從而顯著改善其保存效果。SCs具有為生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、激素轉(zhuǎn)化、屏障隔離和吞噬等功能，外源性化合物對(duì)其影響較明顯[12]。已有研究對(duì)女貞子多糖在TM4炎性損傷中能量代謝的保護(hù)作用進(jìn)行探討[13]，但炎癥是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，女貞子多糖是否對(duì)TM4代謝功能具有直接調(diào)節(jié)作用，或者是通過(guò)對(duì)其他功能(如免疫功能)的調(diào)節(jié)間接影響代謝功能，還有待進(jìn)一步探究。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路是維持組織穩(wěn)態(tài)和防止炎癥病理的關(guān)鍵，與細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)[14]，TNF是激活核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的主要細(xì)胞因子，同時(shí)也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死[15-16]。Pan等[17]研究表明，SCs的免疫豁免特性為細(xì)胞、組織和器官的替代治療提供了新思路，當(dāng)SCs受到LPS刺激后NF-κB信號(hào)通路被激活，相應(yīng)的閉合蛋白表達(dá)下調(diào)，SCs細(xì)胞表面閉合蛋白內(nèi)化，血睪屏障完整性遭到破壞；腮腺炎病毒感染小鼠睪丸后會(huì)誘導(dǎo)TM4中TNF-α、白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6，IL-6)蛋白表達(dá)上調(diào)，在LPS誘導(dǎo)下，TM4分泌促炎因子TNF-α。Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用NF-κB抑制劑后，TNF-α和IL-6蛋白分泌減少，暗示NF-κB信號(hào)通路對(duì)這些細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)他克林對(duì)TM4保護(hù)作用相關(guān)信號(hào)分子(NF-κB、TNF-α和IL-6等基因mRNA和蛋白)表達(dá)變化情況的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以TM4為研究對(duì)象，從炎癥角度進(jìn)一步探索他克林對(duì)雄性動(dòng)物生殖相關(guān)細(xì)胞的抗炎保護(hù)作用，為雄性動(dòng)物生殖疾病相關(guān)藥物的利用及精子質(zhì)量的提高提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

TM4購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司；他克林購(gòu)自上海相輝醫(yī)藥有限公司；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和馬血清購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCK8試劑購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司，引物購(gòu)自華大基因科技有限公司，NF-κB抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

主要儀器設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)溫箱(賽默飛世爾科技有限公司)、倒置顯微鏡(CKX31，奧林巴斯科技有限公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海市求精生化有限公司)、96孔板和6 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿(廣州潔特生物過(guò)濾制品技術(shù)有限公司)、電子分析天平(生物卓精電子科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將TM4置于含有抗生素(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)、5%馬血清(HS)和2.5%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[19]。

1.2.2 LPS對(duì)TM4增殖的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期TM4，以密度為5×103個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。小心棄去上清，再加入含不同濃度LPS[0.00(空白組)、0.01、0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL]的DMEM/F12溶液，分別處理3.0、6.0、12.0和24.0 h后，每孔加入CCK8溶液，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定OD值，并計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率大于90.00%表明此濃度的LPS對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用[3]。將篩選出LPS對(duì)TM4損傷的最佳濃度和時(shí)間用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4損傷的保護(hù)作用 96孔細(xì)胞鋪板方法同1.2.2，后續(xù)操作如下：在上述1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時(shí)間基礎(chǔ)上，加入含不同濃度他克林的DMEM/F12溶液進(jìn)行保護(hù)。共9組細(xì)胞樣品，組1為未加任何藥物的空白組，組2～9分別為先用1.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)損傷12.0 h，再用他克林相應(yīng)濃度(100 000.00、10 000.00、1000.00、100.00、10.00、1.00、0.10和0.01 μg/mL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行后處理，每組6個(gè)重復(fù)孔。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)分別加入LPS進(jìn)行前保護(hù)處理0.5、1.0、2.0 h和加入LPS進(jìn)行后保護(hù)處理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 h后，每孔加入10.0 μL CCK8溶液。CCK8檢測(cè)方法同1.2.2。篩選出他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4損傷保護(hù)作用的最佳濃度和時(shí)間用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)IL-6和TNF-αmRNA基因表達(dá)情況 試驗(yàn)分為空白組、LPS組和藥物組共3組，其中，空白組加入DMEM/F12溶液3.0 mL，LPS組加入含LPS的DMEM/F12溶液3.0 mL，藥物組使用1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時(shí)間處理后，再加入經(jīng)1.2.3篩選出的他克林最佳保護(hù)濃度和時(shí)間處理的DMEM/F12溶液3.0 mL繼續(xù)培養(yǎng)6.0 h。細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄按照熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，以GAPDH為內(nèi)參基因，分析目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 TM4炎癥因子表達(dá)水平的熒光定量引物序列

1.2.5 ELISA法檢測(cè)TM4培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-6蛋白釋放量 按照1.2.4的細(xì)胞分組和處理方法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白樣品，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá) 共分析7組細(xì)胞樣品，組1為未加入任何藥物的空白組，組2為L(zhǎng)PS組(1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時(shí)間組)，組3為他克林組(1.2.3篩選出的他克林保護(hù)濃度和時(shí)間組)，組4～7分別為先采用1.2.2篩選出的LPS損傷濃度和時(shí)間，再用他克林(0.01、1.00、100.00和10 000.00 μg/mL)后處理6.0 h組。以1.2.4中提取的蛋白為目的蛋白，將配制好的一抗(以抗體∶PBST溶液1∶18 000稀釋)進(jìn)行免疫印跡，以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以單因素方差分析進(jìn)行組間差異性顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS對(duì)TM4增殖的影響結(jié)果

如表2所示，空白組的TM4增殖情況良好；隨著LPS濃度的升高，100.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)處理3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分別為70.00%、66.00%、70.00%和81.00%，均極顯著低于空白組(P<0.01，下同)；隨著LPS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度LPS誘導(dǎo)處理12.0和24.0 h的TM4增殖率均顯著或極低于空白組(P<0.05，下同)；各LPS濃度及相應(yīng)誘導(dǎo)時(shí)間分別處理的TM4增殖率存在差異，如0.01 μg/mL LPS誘導(dǎo)處理6.0 h的TM4增殖率為110.00%，極顯著高于空白組；而0.10、1.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)處理6.0 h的TM4增殖率分別為87.00%和89.00%，極顯著低于空白組；而在所有LPS濃度誘導(dǎo)處理中，1.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)處理12.0 h的TM4增殖率最低，為38.00%，極顯著低于空白組。說(shuō)明隨著LPS濃度的升高和誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS誘導(dǎo)損傷的趨勢(shì)逐漸增加，而在不同濃度不同處理時(shí)間下，LPS對(duì)TM4增殖的影響又存在一定的差異，其中1.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)TM4 12.0 h更容易產(chǎn)生炎性損傷。

表2 不同濃度LPS對(duì)TM4增殖率的影響

2.2 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4損傷的保護(hù)作用

如表3所示，10 000.00 μg/mL他克林預(yù)處理2.0 h的TM4增殖率為87.00%，顯著低于空白組，10 000.00、100 000.00 μg/mL他克林預(yù)處理0.5和1.0 h或后處理0.5、1.5、3.0、6.0、12.0和24.0 h的TM4增殖率分別為73.00%、68.00%、66.00%、80.00%、81.00%、30.00%、63.00%、75.00%和7.00%、13.00%、29.00%、36.00%、5.00%、15.00%、75.00%、40.00%，均極顯著低于空白組。

表3 不同處理時(shí)間、不同濃度他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4損傷的保護(hù)作用(TM4增殖率)

而隨著他克林濃度的降低及時(shí)間的延長(zhǎng)，如他克林濃度0.10、1.00、10.00和100.00 μg/mL后處理 24.0 h的TM4增殖率分別為117.00%、116.00%、116.00%、114.00%和他克林濃度0.01 μg/mL后處理 6.0 h的TM4增殖率為122.00%，均顯著高于空白組。說(shuō)明他克林不同濃度、不同處理時(shí)間對(duì)TM4增殖的影響存在差異，隨著他克林濃度的降低及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)TM4的保護(hù)作用趨于加強(qiáng)，其中0.01 μg/mL他克林后處理 6.0 h對(duì)TM4的保護(hù)效果最佳。

2.3 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)下TM4 IL-6 和TNF-α基因mRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，空白組TM4的IL-6(圖1-A)和TNF-α(圖1-B)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均較低；與空白組比較，LPS組TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別顯著和極顯著上調(diào)；與LPS組比較，藥物組TM4的IL-6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，TNF-α基因mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下調(diào)。說(shuō)明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，從而降低炎癥反應(yīng)。

#和##分別表示與LPS組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)；*和**分別表示與空白組相比差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同Compared with the LPS group，# represented significant difference(P<0.05),and ## represented extremely significant difference(P<0.01).Compared with the blank group,* represented significant difference(P<0.05),and ** represented extremely significant difference(P<0.01).The same as below圖1 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4 TNF-α和IL-6基因mRNA表達(dá)的影響Fig.1 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.4 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6蛋白釋放量的影響

如圖2所示，空白組TM4培養(yǎng)上清的IL-6(圖2-A)和TNF-α(圖2-B)蛋白表達(dá)量均較低；與空白組比較，LPS組TM4的培養(yǎng)上清的IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)；與LPS組比較，藥物組TM4培養(yǎng)上清的IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)。說(shuō)明他克林可在一定程度上降低TM4的IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量，從而降低炎癥反應(yīng)。

圖2 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4培養(yǎng)上清TNF-α和IL-6蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of tacrine on mRNA expression of TNF-α/IL-6 in LPS-induced TM4 cells

2.5 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4 NF-κB蛋白表達(dá)的影響

為探究他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4 NF-κB蛋白表達(dá)的影響，采用WB法檢測(cè)經(jīng)不同濃度他克林處理不同時(shí)間后TM4的NF-κB蛋白表達(dá)情況。從圖3-B可看出，與空白組(組1)相比，LPS組(組2)TM4的NF-κB蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)；與LPS組相比，他克林濃度為1.00(組5)、100.00(組6)和10 000.00 (組7)μg/mL后處理6.0 h可極顯著上調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)量，而0.01 μg/mL他克林后處理6.0 h(組4)可降低NF-κB蛋白表達(dá)量，但差異不顯著(P>0.05)。說(shuō)明0.01 μg/mL他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4損傷后處理6.0 h對(duì)降低NF-κB蛋白表達(dá)量效果不明顯,適當(dāng)降低他克林濃度或增加保護(hù)時(shí)間可能效果更佳。

圖3 他克林對(duì)LPS誘導(dǎo)TM4 NF-κB蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of tacrine on NF-κB expression in LPS-induced TM4 cells

3 討 論

他克林是一種西藥，臨床使用始于1993年，是由美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市用于AD治療的第一代藥物之一，具有細(xì)胞外老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)2種病理特征[21]。目前對(duì)AD的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為炎癥、代謝應(yīng)激和鈣超載等多種因素參與該病的暴發(fā)[22-23]。關(guān)于他克林的研究目前已證實(shí)其在AD治療方面效果理想，但長(zhǎng)時(shí)間高劑量服用存在肝臟毒性，而對(duì)其他疾病的治療效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證[24]。已有研究表明，他克林暴露在表達(dá)乙酰膽堿酯酶的細(xì)胞(例如神經(jīng)元)中可導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊的乙酰膽堿酯酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚，這種錯(cuò)誤折疊的酶不能轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體/質(zhì)膜，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫及其下游的未折疊蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24]。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的協(xié)同作用會(huì)增加線粒體膜電位損失，導(dǎo)致暴露于他克林的細(xì)胞失去穩(wěn)態(tài)，發(fā)生凋亡。鄭鑫[25]也研究發(fā)現(xiàn)，他克林通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的過(guò)量生成和谷胱甘肽耗竭，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA氧化性損傷和斷裂，還誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的微核形成增加，說(shuō)明他克林具有遺傳毒性。已知的他克林不良反應(yīng)還包括肝毒性[25]和消化道反應(yīng)，且僅對(duì)輕度和中度AD癥狀治療有效，對(duì)重度癥狀無(wú)效[21]。盡管如此，越來(lái)越多的證據(jù)表明，他克林對(duì)凋亡和氧化損傷也有一定的保護(hù)作用，且可促進(jìn)細(xì)胞增殖[26-29]。此外，他克林對(duì)細(xì)胞具有一定的增殖作用，其作用機(jī)制可能為K+外流減少引起的去極化可增加胞內(nèi)Ca2+濃度，加速細(xì)胞增殖[30]，因此，他克林可能對(duì)Ca2+增加后的細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用[9]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，0.01 μg/mL他克林可減少LPS對(duì)TM4造成的炎性損傷，而10 000.00和100 000.00 μg/mL他克林呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性，充分說(shuō)明他克林的細(xì)胞毒性和保護(hù)性與其濃度相關(guān)；與LPS組相比，藥物組的NF-κB蛋白表達(dá)量略低，但差異不顯著，再稀釋10或5倍梯度或者增加保護(hù)時(shí)間對(duì)TM4炎性損傷的保護(hù)作用可能更好。

他克林的化學(xué)結(jié)構(gòu)是平面、親水性結(jié)構(gòu)，很容易通過(guò)血腦屏障，且血腦屏障、血睪屏障和其他血液組織屏障均具有限制水、電解質(zhì)、離子、激素、旁分泌因子和其他外源生物分子的細(xì)胞旁(細(xì)胞間)和跨細(xì)胞擴(kuò)散的共同特征，產(chǎn)生這些屏障的結(jié)構(gòu)蛋白相似，在功能上也有相似之處[31]。如生物活性肽(F5肽、NC1肽、Lg3肽、Lg4肽和Lg5肽)可能在血腦屏障和其他血液—組織屏障中發(fā)揮作用，這些生物活性肽及其下游信號(hào)蛋白也可能影響其他血液—組織屏障的細(xì)胞旁和跨細(xì)胞藥物擴(kuò)散[31]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究中他克林對(duì)TM4炎性損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能是：①抑制TM4中乙酰膽堿酯酶活性，增加乙酰膽堿含量；②作為TM4中某種受體激動(dòng)劑，促進(jìn)乙酰膽堿釋放；③促進(jìn)TM4對(duì)葡萄糖的利用，促進(jìn)細(xì)胞增殖；④減輕TM4凋亡，從而改善炎性損傷。他克林改善TM4炎性損傷的具體機(jī)制是否與其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制相似，或是否通過(guò)穿過(guò)血睪屏障產(chǎn)生相應(yīng)的作用有待進(jìn)一步探究。

曾有研究發(fā)現(xiàn)，LPS抑制細(xì)胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性[32]且炎癥可使IL-6蛋白含量顯著升高[33]，但本研究發(fā)現(xiàn)，LPS抑制細(xì)胞活力不僅與抑制濃度和時(shí)間關(guān)系密切，且其誘導(dǎo)的TM4中TNF-α和IL-6基因mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高，推測(cè)他克林能通過(guò)調(diào)節(jié)TM4分泌TNF-α和IL-6等炎癥蛋白從而影響炎癥反應(yīng)。目前對(duì)于他克林的探索大多基于他克林的平面、親水性結(jié)構(gòu)進(jìn)行多功能藥物設(shè)計(jì)，采用多靶點(diǎn)定向配體方法有望開(kāi)發(fā)出有效的新藥[34]?；谒幬镩_(kāi)發(fā)史上“老藥新用”(由于發(fā)現(xiàn)新的作用機(jī)制，而不是增加適應(yīng)癥)的成功范例，他克林的多重作用及其可能的生理意義值得進(jìn)一步探討，從而為雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)疾病的治療乃至精子的生產(chǎn)和保存等提供更多的藥物選擇。

4 結(jié) 論

LPS對(duì)TM4增殖產(chǎn)生一定的影響，其中1.00 μg/mL LPS誘導(dǎo)處理12.0 h易于產(chǎn)生TM4炎性損傷；他克林對(duì)TM4炎性損傷具有一定的保護(hù)作用，其中0.01 μg/mL后處理6.0 h的保護(hù)作用最佳，其保護(hù)作用可能與IL-6和TNF-α基因mRNA及蛋白表達(dá)量下調(diào)有關(guān)。