超聲提取-高效液相色譜法測(cè)定土壤中聯(lián)苯胺的含量

那晶晶,戴玄吏,徐雪娟,夏飛

(江蘇新銳環(huán)境監(jiān)測(cè)有限公司,蘇州 215000)

聯(lián)苯胺又名4,4′-二氨基聯(lián)苯,是染料工業(yè)的重要合成中間體,在化工、印染和制藥等工業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。聯(lián)苯胺具有高毒性且有強(qiáng)烈的致癌作用[1],含有聯(lián)苯胺的化工制品在生產(chǎn)過程中會(huì)被逐漸釋放到環(huán)境中,通過環(huán)境遷移轉(zhuǎn)移至大氣、地表水和土壤中。土壤基質(zhì)具有吸附作用及物理化學(xué)吸收作用,使得聯(lián)苯胺極易在土壤中富集,其毒性大、難降解的特性對(duì)環(huán)境和生物造成持久性傷害[2]。隨著“土十條”的頒布,土壤污染問題受到政府和民眾的廣泛關(guān)注。對(duì)于聯(lián)苯胺這種危害大、分布廣的污染物的檢測(cè)需求也在日益增加,聯(lián)苯胺在土壤中往往是微量級(jí)的,因此提出一種高效、靈敏的檢測(cè)手段勢(shì)在必行。

聯(lián)苯胺的測(cè)定方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[3]、液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜法[5-6]等,而土壤中聯(lián)苯胺測(cè)定的研究并不多見。文獻(xiàn)[7]采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法對(duì)土壤中聯(lián)苯胺進(jìn)行測(cè)定,土壤樣品經(jīng)乙酸乙酯超聲提取,方法檢出限達(dá)到0.30μg·kg－1,加標(biāo)回收率為70.1%～90.4%。文獻(xiàn)[2]用加速溶劑萃取(ASE)-凝膠色譜凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定土壤中聯(lián)苯胺,方法檢出限為0.063 mg·kg－1,加標(biāo)回收率為90.6%～96.1%。2018年12月國(guó)家環(huán)境保護(hù)部發(fā)布了土壤中聯(lián)苯胺測(cè)定方法的征求意見稿[8]。在該征求意見稿中,土壤樣品經(jīng)超聲提取,采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定,方法檢出限為2.0μg·kg－1,加標(biāo)回收率為70.2%～108%。以上方法中液相色譜-質(zhì)譜法和GC-MS均具有假陽(yáng)性率低、精密度高等特點(diǎn),但因儀器昂貴、運(yùn)行成本高等問題,方法的廣泛普及受到一定限制。聯(lián)苯胺容易在氣相色譜進(jìn)樣口發(fā)生損失,GC-MS用于低含量聯(lián)苯胺的測(cè)定也并不適用[9]。與以上兩種方法相比,高效液相色譜-熒光檢測(cè)法具有靈敏度高、儀器價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),可作為聯(lián)苯胺檢測(cè)的一個(gè)更好選擇。本工作通過前處理方法的優(yōu)化,超聲提取后直接采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定土壤中聯(lián)苯胺的含量,方法簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確,以期為環(huán)境監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制與檢測(cè)提供一定的技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1260型高效液相色譜儀;HCS5404 型超聲波清洗器,功率0.4 k W;HGC-12A 型干式氮吹儀;HPFE 06型高通量加壓流體萃取儀;0.22μm 聚四氟乙烯針式過濾器。

聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.0 mg·L－1,用甲醇稀釋1 000 mg·L－1聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液而制得。

1 000 mg·L－1聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液;氮?dú)饧兌炔恍∮?9.999%;石英砂(74～150μm);甲醇、丙酮、正己烷、乙腈、氨水為色譜純;五水合硫代硫酸鈉為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

ZORBAX C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為體積比25∶75的乙腈-0.01 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液,等度洗脫;流量1.0 mL·min－1;柱溫40 ℃;激發(fā)波長(zhǎng)292 nm,檢測(cè)波長(zhǎng)395 nm;進(jìn)樣體積10.0μL。

1.3 試驗(yàn)方法

土壤樣品經(jīng)自然干燥或冷凍干燥后,稱取5.00 g置于40 mL棕色螺口玻璃瓶中,瓶口墊片為聚四氟乙烯材質(zhì),加入10 mL 含有1%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨水和50 mg·L－1硫代硫酸鈉的甲醇溶液(作為提取劑)旋緊瓶口,于渦旋振蕩器中將土壤樣品振蕩松散。超聲提取30 min,加冰保持溫度低于10 ℃,靜置10 min,取上清液2.0 mL,經(jīng)0.22μm聚四氟乙烯針式過濾器過濾后直接按照儀器工作條件分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

在高效液相色譜中流動(dòng)相的選擇是十分重要的,合適的流動(dòng)相可增加檢測(cè)的靈敏度和分辨率。試驗(yàn)首先選擇甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相體系進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在甲醇-水流動(dòng)相體系中,聯(lián)苯胺峰形較差,峰展寬嚴(yán)重,而在同樣比例的乙腈-水流動(dòng)相體系中,聯(lián)苯胺峰形有所改善,但仍然存在拖尾現(xiàn)象?？紤]到聯(lián)苯胺的極性和離子化,其在C18反相色譜柱上容易發(fā)生拖尾的現(xiàn)象,須在流動(dòng)相中添加緩沖鹽以抑制聯(lián)苯胺的離子化,增加聯(lián)苯胺在色譜柱上的保留能力。試驗(yàn)選擇將乙酸銨添加至乙腈-水流動(dòng)相體系中,結(jié)果表明在流動(dòng)相體系中添加緩沖鹽,聯(lián)苯胺的峰形尖銳、對(duì)稱,柱效高。不同流動(dòng)相體系中聯(lián)苯胺的色譜圖見圖1。經(jīng)優(yōu)化后,試驗(yàn)最終確定以體積比25∶75 的乙腈-0.01 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相體系中聯(lián)苯胺的色譜圖Fig.1 Chromatograms of benzidine in different mobile phase systems

2.2 提取方式的選擇

通過查閱文件資料發(fā)現(xiàn),土壤中聯(lián)苯胺的提取常采用超聲提取和ASE 這兩種方式[2,7-8]。試驗(yàn)分別用ASE和超聲提取法對(duì)空白石英砂樣品進(jìn)行提取,提取劑分別選擇體積比1∶1的正己烷-丙酮混合液和甲醇。ASE提取溫度為80 ℃,收集提取液,氮吹濃縮至1 mL,須將體積比1∶1的正己烷-丙酮混合液的提取劑置換成甲醇后定容至1 mL,提取液經(jīng)過濾后上機(jī)測(cè)定;超聲提取時(shí),水溫控制在10 ℃以下,加入提取劑甲醇20 mL,超聲30 min后靜置過濾,收集上層提取劑,重復(fù)提取2次,合并提取劑濃縮至1 mL,同理,若提取劑為體積比1∶1的正己烷-丙酮混合液時(shí),須將其置換成甲醇,提取液經(jīng)過濾后上機(jī)測(cè)定。試驗(yàn)考察了提取方式對(duì)聯(lián)苯胺回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 提取方式對(duì)聯(lián)苯胺回收率的影響Fig.2 Effect of extraction method on recovery of benzidine

由圖2可知,在使用相同提取劑的條件下,超聲提取的提取效率均要高于ASE的提取效率,原因是ASE提取時(shí)需要加熱,而聯(lián)苯胺不穩(wěn)定,不適合在加熱條件下提取。另外,ASE 儀器和耗材價(jià)格均較貴,運(yùn)行成本高,而超聲設(shè)備價(jià)格低廉,操作簡(jiǎn)單。甲醇作為提取劑不需要進(jìn)行溶劑置換,減少了一步濃縮過程,回收率要高于體積比1∶1的正己烷-丙酮混合液。因此,試驗(yàn)選擇以甲醇為提取劑,超聲提取土壤中聯(lián)苯胺。

2.3 超聲提取步驟的優(yōu)化

為進(jìn)一步提高聯(lián)苯胺的回收率,尋找影響回收率的關(guān)鍵步驟,分別對(duì)空白瓶、石英砂和土壤進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn),提取方式見上述2.2節(jié)超聲提取,提取劑為甲醇?？疾炝嗽诓煌|(zhì)和濃縮方式下超聲提取聯(lián)苯胺的回收率情況,結(jié)果見表1。

表1 不同基質(zhì)和濃縮方式下超聲提取聯(lián)苯胺的回收率Tab.1 Recovery of benzidine by ultrasonic extraction under different matrices and concentration methods

由表1 可知,在相同的濃縮方式(氮吹,水浴60 ℃)下,空白瓶中的回收率高于石英砂和土壤基質(zhì)的樣品,說明回收率的損失一部分來(lái)自于固體基質(zhì)的吸附和提取劑提取能力的影響?？瞻灼恐袥]有固體基質(zhì),回收率依舊不高,說明回收率的損失有一部分來(lái)自于濃縮定容過程。通過觀察加標(biāo)樣品的液相色譜圖發(fā)現(xiàn),相較于聯(lián)苯胺的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖,加標(biāo)樣品的目標(biāo)峰右側(cè)多出一個(gè)不明物質(zhì)峰。因聯(lián)苯胺具有不穩(wěn)定性,易被氧化成醌類化合物,加熱條件下可能會(huì)加劇這種反應(yīng),該峰可能為聯(lián)苯胺氧化后的產(chǎn)物。為驗(yàn)證這一假設(shè),試驗(yàn)在氮吹環(huán)節(jié)去除加熱過程,同時(shí)保持超聲提取溫度在10 ℃以下,對(duì)空白瓶的加標(biāo)樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰右側(cè)的峰消失,并且回收率上升至60.0%以上。上述結(jié)果表明,在聯(lián)苯胺的提取過程中,氮吹和水浴加熱過程是聯(lián)苯胺損失的最主要環(huán)節(jié),通過不加熱方式進(jìn)行氮吹雖然能升高回收率,但是處理時(shí)間過長(zhǎng)。綜合以上考慮,試驗(yàn)對(duì)提取步驟進(jìn)行調(diào)整,取消濃縮步驟,土壤樣品經(jīng)干燥后,加入10 mL 甲醇超聲提取,提取液經(jīng)過濾后直接上機(jī)測(cè)定,加標(biāo)回收率達(dá)到了70.0%以上。

2.4 提取劑的選擇

提取劑是影響提取效率的一個(gè)重要因素,試驗(yàn)比較了甲醇、甲醇-氨水、甲醇-氨水-硫代硫酸鈉這3種提取劑的提取效果。結(jié)果表明:添加氨水的甲醇溶液(甲醇-氨水)提取效率更好,提取效率在80.0%以上;硫代硫酸鈉的加入并不會(huì)影響提取效率,而且能夠防止聯(lián)苯胺的氧化。試驗(yàn)進(jìn)一步調(diào)節(jié)了提取劑中氨水比例,考察了含體積分?jǐn)?shù)分別為1%,3%,5%的氨水的甲醇溶液的提取效果,結(jié)果表明提高氨水的比例并沒有提高提取效率。因此,試驗(yàn)最終選擇含有1%氨水和50 mg·L－1硫代硫酸鈉的甲醇溶液作為土壤中聯(lián)苯胺的提取劑。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用甲醇逐級(jí)稀釋1.0 mg·L－1的聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成質(zhì)量濃度為0.50,2.00,5.00,10.0,50.0μg·L－1的聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,聯(lián)苯胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.50～50.0μg·L－1,線性回歸方程為y＝5.090×10－1x－1.314×10－1,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

對(duì)空白石英砂加標(biāo)樣品平行測(cè)定7次,加標(biāo)量為1.00μg·kg－1,根據(jù)HJ 168－2010《環(huán)境監(jiān)測(cè) 分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》計(jì)算方法的檢出限和測(cè)定下限。本方法中聯(lián)苯胺的檢出限為0.20μg·kg－1,測(cè)定下限為0.80μg·kg－1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

對(duì)空白土壤樣品進(jìn)行1.00,10.0,80.0μg·kg－1等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n=6)

由表2 可知,土壤樣品的加標(biāo)回收率為75.9%～99.1%,RSD 均小于4.0%,說明該方法的精密度和準(zhǔn)確度能夠滿足土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)的需求。

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)蘇州市土壤和沉積物樣品中的聯(lián)苯胺進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,樣品中均未檢出聯(lián)苯胺。

本工作采用超聲提取-高效液相色譜法測(cè)定土壤中聯(lián)苯胺的含量,對(duì)儀器方法和前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn),有效減少了前處理步驟,提高了提取效率。方法簡(jiǎn)單高效,靈敏度高,檢出限達(dá)到了0.20μg·kg－1,相較于文獻(xiàn)方法和征求意見稿[2,7-8],本方法的檢出限處于較低水平,能夠滿足土壤中微量聯(lián)苯胺的測(cè)定要求,同時(shí)高效液相色譜儀相對(duì)低廉的價(jià)格也利于方法的推廣。