新疆薄皮核桃污染霉菌的分離鑒定

侯琛元，白羽嘉,*，馮作山,*，常新萍，趙 瑾

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆果品采后科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052）

核桃常被稱為胡桃，植物學(xué)分類為胡桃科核桃屬[1-2]，在我國廣泛種植，并成為重點發(fā)展產(chǎn)業(yè)之一，主要的產(chǎn)區(qū)大致分布在新疆、四川、云南、貴州等地。新疆是我國核桃主產(chǎn)區(qū)[3-4]，因獨特的氣候條件，適宜多種核桃種群的生長，使核桃成為促進新疆經(jīng)濟發(fā)展的關(guān)鍵產(chǎn)業(yè)。新疆常見的核桃品種為溫138、新2、渾巴士、新巨豐、新萃豐、扎71號等，分布于阿克蘇、和田、喀什等主要產(chǎn)區(qū)[5-6]。

近年來，核桃因口感酥脆，且含有豐富的維生素、氨基酸、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分，成為了消費者喜愛的堅果類食品[7-8]。目前對核桃產(chǎn)品的貯藏是以干核桃為主，與高水分含量的鮮食核桃相比，不易出現(xiàn)品質(zhì)劣變等問題，有更長的貯藏期[9-12]。有學(xué)者對干核桃的貯藏進行研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件更有利于貯藏，在防止氧化哈敗現(xiàn)象出現(xiàn)的同時可減少黃酮、多酚類物質(zhì)的消耗[13]。同樣，有研究表明，核桃貯藏過程中最大的影響因素是溫度，其次是包裝材料和光照條件[14]。在核桃成熟后，由于薄皮核桃采后堆積、脫青皮、漂白、干燥等加工工序以及貯藏過程中受周圍環(huán)境的濕度、溫度的影響，核桃果殼開裂，極易受霉菌污染，降低產(chǎn)品品質(zhì)，限制了其商業(yè)發(fā)展。

食品受真菌污染后一方面會造成經(jīng)濟損失，另一方面真菌污染產(chǎn)生的毒素會危害人體健康。在研究干果類食品時發(fā)現(xiàn)，污染食品的真菌毒素主要由黃曲霉、鐮刀菌、鏈格孢菌等真菌的代謝物產(chǎn)生[15]。黃曲霉能夠污染糧谷類及油料，可產(chǎn)生被國際癌癥研究機構(gòu)列為毒性較強、致癌性較強的黃曲霉毒素AFB1，造成機體生殖細(xì)胞活性降低，增加患肝病、腎病的危險[16-17]。鐮刀菌主要產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素[18]。鏈格孢菌作為果蔬及谷物的致病菌，可產(chǎn)生至少10種有毒代謝物，造成嚴(yán)重的病害[19]。鐮刀菌的代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致玉米等糧食作物的減產(chǎn)，同時對人體造成嚴(yán)重的危害[20]。通過研究發(fā)現(xiàn)，影響核桃仁霉?fàn)€病的病菌較多，主要有細(xì)菌、鐮孢菌、青霉菌、鏈格孢菌和黑曲霉等[21]。目前對核桃的研究主要集中在貯藏期品質(zhì)變化和貯藏技術(shù)等方面，對于污染核桃真菌的分離鑒定的研究報道較少。為此，本研究對新疆薄皮核桃中的真菌進行分離鑒定，以期為發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)，解決核桃在貯藏、運輸期間品質(zhì)劣變等問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

核桃品種為新2，采自新疆阿克蘇地區(qū)溫宿縣。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無水乙醇（分析純），西安天茂化工有限公司；真菌DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；乳酸酚棉藍染色液，山東伊蘭博化玻儀器有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-30KBS型立式不銹鋼蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；FA10024B型電子天平，博科BIOBASE公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，上海躍進醫(yī)療器械廠；3730XL型測序儀，美國ABI公司；FR980型凝膠成像儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

挑選出100個表面發(fā)霉的帶殼核桃，用75%的酒精擦拭核桃殼表面，浸入裝有無菌水的無菌袋中浸泡12 h，取出瀝干后，分裝至無菌袋中于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

1.2.2 優(yōu)勢菌群分析

統(tǒng)計薄皮核桃霉菌發(fā)生情況，并采用涂布法、劃線法對核桃優(yōu)勢菌株進行分離保藏。

1.2.3 薄皮核桃污染霉菌的分離純化

將樣品置于超凈工作臺中，破殼選取不同程度發(fā)霉的核桃仁25 g，放入含有225 mL無菌水的錐形瓶中混勻，制成稀釋梯度為10-1、10-2、10-3的懸浮液，分別涂抹于PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)觀察，待長出菌落后，采用三點法再次接種于PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基上無其他雜菌開始，繼續(xù)在28℃純化培養(yǎng)3代，于4℃保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.4 真菌菌落生長直徑變化

采用點值法將所分離霉菌接種在PDA培養(yǎng)基上，每天觀察記錄菌落直徑變化情況。通過每天測量菌株生長直徑，計算該菌株直徑平均生長速率。

式中：Ln為菌株生長n天的直徑，cm；t為菌株生長的天數(shù)，d。

1.2.5 薄皮核桃污染霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

對純化菌株經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)法進行鑒定：采用點值法挑選較純的菌落接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7 d，每次做5個重復(fù)，每天用肉眼觀察并記錄菌落的生長特征，測量直徑變化。霉菌的生長變化主要有形態(tài)、色澤、菌落直徑、厚度等特征。

挑出少量純化的菌絲制片，先經(jīng)高倍顯微鏡觀察具體形態(tài)，再通過查找《真菌鑒定手冊》[22]和《中國真菌志》[23]對菌株的描述來確定菌株種屬。

1.2.6 真菌組DNA的提取

將分離菌株于28℃恒溫培養(yǎng)7 d后，收集菌絲體經(jīng)液氮研磨，放入離心管中，參照SK8259真菌DNA提取試劑盒說明進行相關(guān)操作提取菌株DNA。

1.2.7 真菌ITS區(qū)PCR擴增及序列測定

ITS通用擴增引物ITS1為5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’；ITS4為5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’。引物由生工生物工程股份有限公司合成，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（150 V，100 mA）檢測擴增產(chǎn)物，再送生工生物工程（上海）服務(wù)有限公司測序。

1.2.8 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

ITS測序序列：由NCBI網(wǎng)站中的BLAST在線進行比對，獲得親緣性高的基因序列，通過MEGA 6.0軟件，使用N-J法對親緣性較高的序列和目的基因建立進化樹，采用自舉法檢驗，重復(fù)1000次，確定真菌種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄皮核桃污染霉菌的分離純化

以薄皮核桃為原料，采用稀釋梯度為10-1、10-2、10-3的懸浮液，分離出霉菌于PDA培養(yǎng)基上純化得到米根霉、深綠木霉、擴展青霉、黑曲霉、黃曲霉、腐皮鐮刀菌、擬輪枝鐮刀菌、紅貝俄氏孔菌、歧皺青霉、交鏈格孢菌10株主要菌株，編號HT001～HT010。

2.2 薄皮核桃污染霉菌的優(yōu)勢菌群分析

為驗證薄皮核桃污染霉菌的優(yōu)勢菌株，對100個霉變的核桃放置5 d后進行觀察，霉菌發(fā)生率100%（表1）；其中菌株HT001、HT002、HT004和HT005在核桃上的發(fā)生率分別達到29%、19%、25%和21%，而其他菌株的發(fā)生率都低于10%?？梢娢廴竞颂业膬?yōu)勢霉菌分別為HT001、HT002、HT004和HT005菌株，對優(yōu)勢菌株進行分離純化，于4℃保存，用于進一步形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定。

表1 薄皮核桃污染霉菌發(fā)生率Table 1 The incidence of mold contamination in thin-skinned walnuts

2.3 薄皮核桃分離霉菌的菌落生長直徑測定

表2為新疆薄皮核桃中分離出的10株霉菌菌落生長直徑變化情況，采用點值法將霉菌接種在PDA培養(yǎng)基上?？梢钥闯?，HT001和HT002菌株較其他菌株生長快，平均生長速率達到2.615 cm/d和2.719 cm/d,分別在第4天和第5天時長滿整個培養(yǎng)基；HT004和HT005兩株菌株的平均生長速率達到1.139 cm/d和1.100 cm/d，菌落生長速率高于其他菌株（除HT001、HT002）；HT003、HT009兩株菌株平均生長速率分別為0.502 cm/d和0.415 cm/d，且菌落生長速率始終低于其他菌株。

表2 核桃分離霉菌菌落生長直徑Table 2 Growth diameter of mold colony isolated fromthin-skinned walnuts 單位：cm

2.4 薄皮核桃污染霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將薄皮核桃中所分離出的10株霉菌于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察。如圖1所示，HT001菌株于28℃恒溫培養(yǎng)至3 d后，菌落鋪滿整個培養(yǎng)基表面，正面呈現(xiàn)絮狀白色氣生菌絲，不規(guī)則，生長較快，后期菌絲著生黑色圓點孢子，背面呈乳白色。分生孢子為不規(guī)則卵圓形，孢子梗細(xì)長光滑，頂端聚集為球形孢子囊。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT001為根霉屬（Rhizopussp.）真菌。

圖1 菌株HT001孢子及菌落形態(tài)Fig.1 Spore and colony morphology of strain HT001

如圖2所示，HT002菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落鋪滿整個培養(yǎng)基表面，正面呈現(xiàn)白綠色菌絲，環(huán)狀分布，前期為白色，培養(yǎng)第4天時培養(yǎng)基中心轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色菌落，整體菌落加厚，背面呈現(xiàn)黃色。分生孢子為卵圓狀單個細(xì)胞，數(shù)量眾多，表面光滑緊密連接成團狀，并附著于細(xì)長的菌絲上。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT002為木霉屬（Trichodermasp.）真菌。

圖2 菌株HT002孢子及菌落形態(tài)Fig.2 Spore and colony morphology of strain HT002

如圖3所示，HT003菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑25 mm，散射狀溝紋，表面粗糙具有顆粒感，初期正面為白色、圓形，并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯钋嗌?，周邊為白色絨狀，背面淡黃色。著生在孢子梗上的分生孢子為不平整的圓球形的鏈狀排布，整體呈掃帚形態(tài)。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT003為青霉屬（Penicilliumsp.）真菌。

圖3 菌株HT003孢子及菌落形態(tài)Fig.3 Spore and colony morphology of strain HT003

如圖4所示，HT004菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑60 mm，正面呈現(xiàn)黑色絨狀菌絲，表面粗糙，產(chǎn)生較多的分生孢子，表面溝壑狀，周邊長有稀疏的不規(guī)則白色菌絲，背面呈乳白色。圓球形孢子，體積小，孢子梗壁光滑，頂囊產(chǎn)孢區(qū)表面有分生孢子著生并形成簇狀聚集。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT004為曲霉屬（Aspergillussp.）真菌。

圖4 菌株HT004孢子及菌落形態(tài)Fig.4 Spore and colony morphology of strain HT004

如圖5所示，HT005菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑57 mm，正面呈黃綠色絨狀菌絲，表面粗糙，散發(fā)狀溝紋，可見清晰的圈帶，中心菌落低凸起為黃色，顏色不斷加深，菌落外環(huán)為白色，后期轉(zhuǎn)變?yōu)椴菥G色，背面為黃色。分生孢子為不規(guī)則球狀，孢子通過表面頂囊小梗串生。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT005為曲霉屬（Aspergillussp.）真菌。

圖5 菌株HT005孢子及菌落形態(tài)Fig.5 Spore and colony morphology of strain HT005

如圖6所示，HT006菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑50 mm，正面呈白色絨毛狀，菌表近似紫紅色，中心菌落低凸起，背面呈黃褐色。分生孢子為卵圓形，較長，孢子量較多，菌絲有間隔，細(xì)長，分生孢子聚集在菌絲周圍。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT006為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）真菌。

圖6 菌株HT006孢子及菌落形態(tài)Fig.6 Spore and colony morphology of strain HT006

如圖7所示，HT007菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑51 mm，正面呈淺薄的白色氣生菌絲，表面平整，前期為粉紅色，轉(zhuǎn)為白色，中心菌落低凸起，背面黃色。分生孢子梗有分枝，生長緩慢，分布散落，多聚集叢生在小梗頂端。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT007為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）真菌。

圖7 菌株HT007孢子及菌落形態(tài)Fig.7 Spore and colony morphology of strain HT007

如圖8所示，HT008菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑49 mm。正面近似白色，中心菌落偏暗黃色，菌表平滑，無褶皺，反面為淡褐色。分生孢子為長橢圓形，叢生，菌絲光滑較細(xì)長，相互纏繞生長。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT008為春孔菌屬（Earliellasp.）真菌。

圖8 菌株HT008孢子及菌落形態(tài)Fig.8 Spore and colony morphology of strain HT008

如圖9所示，HT009菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑20 mm，正面呈淺青色，周邊白色環(huán)狀，表面不平整，褶皺嚴(yán)重，中心菌落高凸起，背面呈暗褐色。分生孢子近似圓形，表面不平整，菌絲偏平，分枝較多，孢子著生于表面。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT009為青霉屬（Penicilliumsp.）真菌。

圖9 菌株HT009孢子及菌落形態(tài)Fig.9 Sporeand colony morphology of strain HT009

如圖10所示，HT010菌株于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落直徑52 mm，正面暗黃色，較厚，菌落環(huán)狀分布，中心菌落低凹，深褐色，外環(huán)呈白色絨狀，背面呈紅棕色。分生孢子為長形，棍狀，鏈狀排列，并分布于菌絲中間，菌絲光滑，較細(xì)。依據(jù)菌落生長情況、分生孢子等形態(tài)特征，鑒定HT010為鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌。

圖10 菌株HT010孢子及菌落形態(tài)Fig.10 Spore and colony morphology of strain HT010

2.5 薄皮核桃污染霉菌的分子生物學(xué)鑒定

2.5.1 真菌基因組DNA提取

采用試劑盒法對分離真菌的基因組DNA進行提取，薄皮核桃污染霉菌的基因組DNA電泳圖如圖11所示，10株真菌的DNA片段長度符合基因組DNA長度大小，均在15 000 bp以上。

圖11 薄皮核桃真菌基因組DNA電泳圖Fig.11 Genomic DNA electrophoresismap of thin-skinned walnut fungus

2.5.2 真菌ITS序列分析

以ITS1和ITS4為引物，以分離污染霉菌的DNA為模板，進行PCR擴增，結(jié)果如圖12所示。從薄皮核桃污染霉菌中分離出的10株菌株得到相應(yīng)的DNA片段，大小在500～700 bp，產(chǎn)物條帶單一，濃度高，符合真菌ITS序列條帶。

圖12 薄皮核桃真菌ITS序列的PCR擴增電泳圖Fig.12 The ITSsequence and PCRamplification electrophoresis of thin-skinned walnut fungus

為進一步確定污染霉菌的種類，將得到的PCR產(chǎn)物進行序列測定，結(jié)果表明，菌株通過PCR擴增得到序列如下：菌株HT001～HT010分別為557、589、564、572、567、547、528、546、562、547 bp，與PCR擴增電泳圖條帶長度一致。測序后，運用MEGA 6.0軟件的N-J法進行數(shù)據(jù)分析，并構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖14 菌株HT002的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.14 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT002

圖16 菌株HT004的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.16 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT004

圖17 菌株HT005的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.17 ITSsequencephylogenetic treeof strain HT005

圖18 菌株HT006的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.18 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT006

圖19 菌株HT007的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.19 ITSsequence phylogenetic tree of strain HT007

圖20 菌株HT008的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.20 ITSsequencephylogenetic treeof strain HT008

圖21 菌株HT009的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.21 ITSsequencephylogenetic treeof strain HT009

圖22 菌株HT010的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.22 ITSsequence phylogenetic treeof strain HT010

根據(jù)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖13～22）可知，菌株HT001與MW757227.1Rhizopusoryzae遺傳距離最近，菌株HT002與MT341775.1Trichodermaatroviride遺傳距離最近，菌株HT003與MT582774.1Penicillium expansum遺傳距離最近，菌株HT004與MG228419.1Aspergillusniger遺傳距離最近，菌株HT005與MW092907.1Aspergillusflavus遺傳距離最近，菌株HT006與KX379161.1Fusariumsolani遺傳距離最近，菌株HT007與MT180471.1Fusariumverticillioides遺傳距離最近，菌株HT008與MF077240.1Earliella scabrosa遺傳距離最近，菌株HT009與MF077228.1Penicilliumdierckxii遺傳距離最近，菌株HT010與MK968042.1Alternariaalternata遺傳距離最近。

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和ITS結(jié)果進行分析，菌株HT001為米根霉（Rhizopusoryzae），菌株HT002為深綠木霉（Trichodermaatroviride），菌株HT003為擴展青霉（Penicilliumexpansum），菌株HT004為黑曲霉（Aspergillusniger），菌株HT005為黃曲霉（Aspergillus flavus），菌株HT006為腐皮鐮刀菌（Fusariumsolani），菌株HT007為擬輪枝鐮刀菌（Fusariumverticillioides），菌株HT008為紅貝俄氏孔菌（Earliellascabrosa），菌株HT009為歧皺青霉（Penicilliumdierckxii），菌株HT010為交鏈格孢菌（Alternariaalternata）。

3 討論與結(jié)論

本研究以新疆薄皮核桃為原料，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和ITS分子生物學(xué)鑒定，從試驗原料中共分離出10株污染真菌，所獲得的ITS序列均能從NCBI數(shù)據(jù)庫中找到同源性達到98%的對應(yīng)序列，再經(jīng)分析比對同源性較高的序列與已知序列的遺傳距離，從而明確該菌株的種屬。本文從薄皮核桃中共分離出10株真菌，結(jié)合霉菌菌落在培養(yǎng)基上生長直徑變化情況和接種核桃時霉菌的發(fā)生率研究發(fā)現(xiàn)：米根霉（Rhizopus oryzae）、深綠木霉（Trichodermaatroviride）、黑曲霉（Aspergillusniger）和黃曲霉（Aspergillusflavus）這4種菌株在適宜條件下生長速率高于其他菌株，是影響核桃品質(zhì)變化的優(yōu)勢霉菌；其他6種霉菌分別是擴展青霉（Penicilliumexpansum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、擬輪枝鐮刀菌（Fusariumverticillioides）、紅貝俄氏孔菌（Earliellascabrosa）、歧皺青霉（Penicillium dierckxii）、交鏈格孢菌（Alternariaalternata）。

國內(nèi)對核桃霉變病原菌的研究較少，李亞婷[24]對霉變鮮核桃仁的霉菌進行鑒定，得到優(yōu)勢霉菌為總狀毛霉、黑曲霉、黃曲霉和桔青霉。李勇鵬等[25]對云南鮮食核桃在低溫貯藏中腐爛病進行研究發(fā)現(xiàn)，擴展青霉是影響鮮食核桃品質(zhì)的主要病菌，擴展青霉會產(chǎn)生展青霉素，若食用含有展青霉素的食品會造成機體細(xì)胞衰老、畸形，腎臟損傷，甚至引發(fā)癌癥等[26]。耿陽陽等[27]將引起貴州紙皮核桃霉?fàn)€的病原菌鑒定為黑曲霉、黃曲霉、腐皮鐮刀菌和卷枝毛霉。黃凱等[28]通過形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果分析，得出影響鮮食核桃貯藏的病原菌主要為擴展青霉。綜上所述，影響不同地區(qū)核桃品質(zhì)變化的霉菌種類和數(shù)量有所不同，這與核桃在不同的生長、貯藏環(huán)境中接觸到不同種類病原菌有關(guān)。

核桃污染霉菌后所造成的發(fā)霉、腐敗變質(zhì)是由多種真菌協(xié)同污染的結(jié)果。污染霉菌來源有兩方面：一是由于脫皮加工過程中病菌的寄生，二是受貯藏條件的影響，環(huán)境濕度高更容易滋生霉菌。實際生產(chǎn)中應(yīng)對核桃的采摘、運輸、貯藏等方面進行嚴(yán)格把控，包括對核桃脫青皮等加工工序的改良，防止二次污染。