改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶及其對雞肉風味的影響

陳瑞琦，閆伊狄，代媛媛，孟 鑫

（錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121000）

近年來，風味酶已廣泛應用于乳制品、肉制品、葡萄酒和飲料中，如脂肪酶、木瓜蛋白酶等[1]。脂肪酶作為一種可以催化油脂等疏水性底物的水解、酯化、轉酯化、氨解等多種反應的重要風味酶，已應用于能源、醫(yī)藥、洗滌、食品等諸多領域。在肉品中應用脂肪酶可以有效改善肉的風味。宋詩清等[2]研究表明，經(jīng)過酶解和溫和加熱控制雞脂氧化后，雞肉風味突出，肉味醇厚持久，異味明顯減少。試驗前期研究從豬肉中提取的內源性脂肪酶，對雞肉、豬肉等肉品風味有明顯的改善作用[3]，并在釀酒酵母中表達了重組脂肪酶基因，發(fā)現(xiàn)重組豬肉脂肪酶對典型肉類及奶制品的風味的提高有一定的作用[4]。

然而，脂肪酶對環(huán)境敏感，易失活，成本高，催化效率低，嚴重限制了其在食品工業(yè)和其他領域的應用[5-6]。將酶固定在某些載體上制成固定化酶，再通過回收載體同步回收酶，能夠有效降低其生產成本，是目前脂肪酶連續(xù)工業(yè)化生產的有效方式[7-8]。傳統(tǒng)固定化技術多采用共價-交聯(lián)、吸附、包埋等方法，為了更好地滿足社會和生產需求，國內外學者已采用新型、綠色食品級材料生產固定化酶制劑。尹春華等[9]采用植物乳桿菌合成了納米氧化鋅粒子，并用于脂肪酶的固定化，發(fā)現(xiàn)固定化酶的pH和溫度的穩(wěn)定性得到顯著提高，具有良好的可重復使用性。Maryellen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，卵磷脂和MgCO3對聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球包裹碳酸酐酶活性有影響。2014年，鄧濤[11]首次提出以改性核桃殼作為載體固定化脂肪酶的制備方法，使脂肪酶的熱穩(wěn)定性得到較大的提高。王揮等[12]選用LX-1000HA樹脂為載體固定化單寧酶，提高了單寧酶的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。為了提高豬肉內源性脂肪酶的可重復使用性，本試驗以微球酶、改性核桃殼固定化脂肪酶和LX-1000HA樹脂固定化脂肪酶3種方法進行固定化，以期篩選出一種綠色脂肪酶固定化生產工藝。

隨著生活質量的不斷提高，人們不僅追求肉品的營養(yǎng)價值，而且對肉品的風味品質也有越來越高的要求[13-14]。雞肉因其高蛋白、低脂、低膽固醇的特點深受消費者青睞，是我國主要肉類品種之一[15-16]。因此，改善雞肉及其相關制品風味尤為重要。本試驗從3種方法中篩選出制備固定化脂肪酶的最佳工藝，并將其添加到雞肉中，采用電子鼻和頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（HS-SPME-GC-MS）檢測雞肉風味物質經(jīng)固定化豬肉內源性脂肪酶處理前后的變化，為肉品風味的研究奠定理論基礎，并為肉制品深加工提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

豬肉內源性脂肪酶（以下簡稱脂肪酶），上海弘順生物科技有限公司；生核桃殼，購買于錦州大潤發(fā)；LX-1000HA樹脂，西安藍曉生物科技有限公司；Span 20、礦物油、戊二醛、乙二胺、三丁精、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（KH-570）、聚乙二醇二縮水甘油醚，天津索羅門生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，市售品。

1.1.2 儀器與設備

RE-2000A馬弗爐，沈陽市長虹工業(yè)電器廠；PEN3電子鼻，德國AIRSENSE公司；頂空固相微萃取器（SPME）、75μm CAR/PDMSSPME萃取頭，德國達姆施塔特默克集團；GL570氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；S-3400型掃描電鏡，北京中科科儀股份有限公司；V-5000型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 微球酶的制備

制備50 mg/mL脂肪酶溶液并過濾，收集過濾后的脂肪酶溶液備用，取上述脂肪酶溶液2 mL作為水相。乳化前，在水相中加入500μL三丁精作為酶活性位點保護劑，三丁精的最終濃度為酶溶液的25%（體積分數(shù)），再加入500μL Span 20作為表面活性劑。之后，向混合物中添加50 mL礦物油，混合液在1 500 r/min條件下乳化1 min，乳化前在酶溶液中加入交聯(lián)劑戊二醛，戊二醛添加量為酶溶液的16.7%（體積分數(shù)），水相中加入300μL交聯(lián)劑（等體積乙二胺和戊二醛預混15 min后加入反應體系），乳化后靜置2 h。用離心法收集聚合后的微球酶[17]。為了純化微球酶樣品，此過程重復5次。

1.2.2 改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶

1.2.2.1 載體的制備

將核桃殼烘干、粉碎，取10 g核桃殼粉末，加50 mL磷酸溶液，在60℃水浴鍋中浸漬15 min，過濾將其送入馬弗爐，先在300℃下炭化90 min，再在600℃下活化90 min，活化結束后，用0.1%鹽酸清洗并用蒸餾水洗滌至中性，最后烘干，常溫保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.2.2 載體的表面氧化

取載體5 g，加入20%硝酸溶液50 mL，在80℃的水浴鍋中浸漬3 h。過濾后，加入離子水煮沸，過濾，然后干燥4次[18]。

1.2.2.3 載體的表面硅烷化

取1 g氧化后的載體于100 mL無水乙醇中超聲分散1 h后，加入一定量的0.01 mol/L鹽酸，調節(jié)pH值至4.0，再加入3%KH-570溶液，60℃水浴反應24 h，過濾，濾餅分別用無水乙醇和蒸餾水洗滌，除去未反應的KH-570，烘干[18]。

1.2.2.4 固定化酶的制備

取1.0 g改性的載體于三角瓶中，加入5 mL質量濃度為50 mg/mL的脂肪酶酶液，在搖床上振蕩一定時間使載體吸附固定脂肪酶。經(jīng)抽濾、去離子水洗滌、冷凍干燥，得到固定化脂肪酶[18]。

1.2.2.5 核桃殼載體傅里葉變換紅外吸收光譜儀（FT-IR）的測定

KBr壓片法制樣：將未改性核桃殼和改性核桃殼分別與一定量的KBr于研缽中充分研磨成均勻粉末，壓制成薄片。樣品進行全波段掃描（4 000～400 cm-1），掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1，每個樣品重復試驗3次。

1.2.2.6 電鏡的測定

分別取3 g未改性核桃殼和改性核桃殼為樣品，再分別取10 mL游離脂肪酶酶液和固定化的脂肪酶酶液經(jīng)冷凍干燥成粉末狀樣品。使用S-3400型掃描電鏡分析4種樣品的表面形態(tài)，工作電壓為3 kV，噴金后觀察其表面形態(tài)。

1.2.3 LX-1000HA樹脂固定化豬肉內源性脂肪酶

1.2.3.1 載體活化

濕載體LX-1000HA樹脂在30℃烘干備用，加入交聯(lián)劑聚乙二醇縮水甘油醚，在搖床中振蕩處理載體，除去殘留的交聯(lián)劑。

1.2.3.2 脂肪酶固定化

將脂肪酶酶液加入到活化后的載體中，搖床振蕩固定化，用緩沖液進行洗滌，抽濾，除去殘留酶液，測定酶活性[19]。

1.2.4 固定化脂肪酶活性測定

在相同條件下，即：酶濃度為50 mg/mL，緩沖液pH值為6.0，固定化時間為3 h，固定化溫度為35℃。用3種不同方法固定化脂肪酶，以游離脂肪酶為空白對照，比較不同方法固定的脂肪酶活性大小。

采用改進的銅皂法測定。在試管中加入2 mL橄欖油乳化液和2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.5），40℃水浴中加熱5 min后加入0.5 mL待測酶液，充分混勻后水浴振蕩15 min，然后立即加入1 mL 6 mol/L鹽酸溶液和6 mL 95%乙醇溶液，混合后加入3 mL異辛烷，并完全振蕩90 s。然后于60℃下靜置10 min，待冷卻后，取1 mL異辛烷上清液放入新的試管中，再加入4 mL異辛烷和1mL銅鹽顯色劑，混勻后靜置，取上清液，用紫外可見分光光度計于714 nm處測定其吸光度，根據(jù)標準曲線計算脂肪酶活力[20]。酶活力單位（U）定義為：在上述反應條件下1 min內轉化出1μmoL脂肪酸的酶量稱為1個脂肪酶活力單位。

1.2.5 風味檢測

1.2.5.1 原料肉的處理

在常溫pH 6.5的條件下，取10 mL蒸餾水和25 g雞肉樣品，二者充分混合浸泡30 min（樣品A）；分別取游離酶酶液和改性核桃殼固定化酶酶液10 mL，與25g雞肉樣品充分混合浸泡30min（樣品B和樣品C）。每組分別置于300 mL沸水中單獨煮制2 min，備用。

1.2.5.2 電子鼻檢測

將上述3組樣品分別取4 g，切碎放入燒杯中，迅速加蓋密封，20 min后進行測量。電子鼻信號的采集時間為60 s，清洗時間為120 s[21]。PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述見表1。

表1 PEN3型便攜式電子鼻傳感器的特點Table 1 Characteristics of PEN3 portable electronic nose sensor

1.2.5.3 GC-MS分析

固相微萃?。悍謩e取樣品A、B、C各4 g，切碎，煮熟后迅速放入20 mL頂空瓶中，快速加蓋進行GC-MS檢測，每組樣品做2次平行試驗。加入4 mL飽和氯化鈉溶液及磁轉子，用聚四氟乙烯隔墊密封，在磁攪拌器中45℃加熱10 min。用活化的萃取頭（270℃活化60 min）頂空吸附35 min后，然后將萃取頭插入進樣口解吸5 min。每個樣品重復試驗3次[22]。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；進樣口溫度為250℃，不分流模式進樣；載氣為He，流速1.0 mL/min；程序升溫，毛細管柱初溫40℃，保持3 min，然后以3℃/min升至100℃，再以5℃/min升至230℃，保持5 min。

質譜條件：色譜-質譜接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃；離子化方式：EI；電子能量70 eV；質量掃描范圍30～550（m/z）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有結果均為3次重復的平均值，使用Microsoft Office2013軟件繪制圖。采用電子鼻自帶的Alpha Soft軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 3種不同固定化方法處理后的豬肉內源性脂肪酶活力測定結果

采用3種不同的方法固定化豬肉內源性脂肪酶，結果如圖1所示。與其他兩種方法相比，改性核桃殼固定化的脂肪酶活最高，達169.8 U/g。

圖1 酶活力測定結果Fig.1 Determination resultsof enzyme activity

改性核桃殼法固定化脂肪酶是以核桃殼為原料，采用磷酸活化法將核桃殼制備成核桃殼活性炭?；钚蕴靠紫栋l(fā)達，且具有較好的機械強度，是一種非常適合制備固定化酶的載體；通過表面氧化和硅烷化對其進行改性處理后，使表面連接了疏水性有機官能團，將脂肪酶“蓋子”打開，并借助載體來固定化脂肪酶，以此降低游離脂肪酶的失活率，提高固定化酶活力[18]。此外，因核桃殼來源豐富，成本低廉，綠色安全，與微球酶法和LX-1000HA樹脂法相比，改性核桃殼法固定化脂肪酶更綠色、環(huán)保，適于食品加工生產。

2.2 FT-IR結果

圖2為載體改性前后的FT-IR譜，可以看出，核桃殼載體中含大量的親水基團，如羥基、羧基、環(huán)氧基和羰基。樣品在3 200～3 500 cm-1處的吸收峰是載體表面的羥基基團及其吸收的水分子中的羥基，1 600 cm-1附近處的吸收峰是芳基羧酸中羰基的伸縮振動吸收峰，1 100 cm-1對應于仲醇中O-H或醇、酚中C-O或C-O-C的振動。除此之外，相比未改性核桃殼載體，改性后核桃殼載體的吸收峰中有來自于KH-570中的甲基、亞甲基伸縮振動，這表明改性后的載體引入了KH-570基團。在3 500 cm-1處，改性載體的吸收峰比未改性載體弱，這可能是由于在還原和后處理過程中烷氧基進一步水解縮合形成更多的Si-O-Si鍵，包裹在了改性載體表面，表明改性后載體成功地將硅烷化試劑修飾到載體上。

圖2 FT-IR結果Fig.2 FT-IRresults

2.3 電鏡結果

由圖3可以看出，未改性核桃殼載體（圖3A）以及改性核桃殼載體（圖3B）的孔系均比較發(fā)達，表面可見許多大小不等的孔，但未改性核桃殼載體表面非常粗糙，在載體改性后其表面變得光滑，表明載體經(jīng)氧化及硅烷化后形態(tài)發(fā)生了改變。

觀察游離脂肪酶（圖3C）以及固定化的脂肪酶（圖3D）可以發(fā)現(xiàn)：游離脂肪酶以微小的球體形態(tài)存在，當游離的脂肪酶被改性核桃殼固定化后會吸附在核桃殼的孔隙上，達到固定化的作用。

圖3 SEM結果Fig.3 SEMresults

2.4 電子鼻檢測改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶對雞肉風味的影響

處理前的雞肉樣品、經(jīng)游離脂肪酶和改性核桃殼固定化脂肪酶處理后的雞肉樣品的傳感器響應變化曲線如圖4所示。3組樣品中，曲線變化趨勢整體相同，但相對電阻率（G/G0）大小發(fā)生了改變，表明經(jīng)固定化脂肪酶處理前后，雞肉中揮發(fā)性風味物質種類沒有改變，只是部分物質在含量上有不同程度變化，這與同類文獻結果相似[23-24]。其中，R7傳感器代表的含硫化合物和R9傳感器代表的芳香族類化合物有明顯變化，而這些化合物是影響肉品風味的主要物質。由此可知，經(jīng)改性核桃殼固定化處理后的脂肪酶和游離的豬肉內源性脂肪酶具有相同的催化作用，均能夠有效改善雞肉樣品的風味。

圖4 雞肉樣品處理前后傳感器響應變化曲線Fig.4 Response chang curveof sensor for chicken sample before and after treatment

通過多次預試驗得出電子鼻檢測在50 s之后開始趨于穩(wěn)定，為了確保數(shù)據(jù)的準確性和穩(wěn)定性，選取57～60 s作為特征值的提取時間點，并對數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA）。主成分分析是一種有效簡化數(shù)據(jù)的工具，主要是降低數(shù)據(jù)維數(shù)，簡化原始數(shù)據(jù)。處理前的雞肉樣品以及分別經(jīng)游離脂肪酶和改性核桃殼固定化脂肪酶處理后的雞肉樣品中的揮發(fā)性風味物質的電子鼻PCA分析結果見圖5。

圖5 雞肉樣品處理前后響應值PCA分析圖Fig.5 PCA analysisdiagramof response value for chicken samples before and after treatment

圖中的每個橢圓代表同批次雞肉風味的數(shù)據(jù)采集點，數(shù)據(jù)點越接近，樣品的重復性越高。主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的貢獻率分別為98.91%和1.06%，總貢獻率為99.97%，表明兩個主成分能夠反映原始數(shù)據(jù)的信息。在PCA圖中，3組樣品在橫坐標上的間距越大，說明其差異越大。主成分2的貢獻率較主成分1的貢獻率小，所以可以將其忽略。樣品的差異性主要表現(xiàn)在PC1上。PCA分析可以看出，不同處理對雞肉樣品中揮發(fā)性成分有明顯的影響，但利用PCA不能很好地區(qū)分3組雞肉樣品之間的揮發(fā)性成分[25-27]。為進一步明確3組樣品的雞肉揮發(fā)性物質增加的具體成分，采用GC-MS進行分析檢測。

2.5 GC-MS檢測改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶對雞肉風味的影響

由圖6可見，通過HS-SPME-GC-MS檢測3組樣品雞肉風味的差異，發(fā)現(xiàn)3組樣品共檢測出揮發(fā)性物質53種，主要包括醛類、烴類、芳香族類、酯類、醇類和含硫化合物等。從樣品A、B和C中各類揮發(fā)性物質成分總峰面積的變化能夠看出，GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)了脂肪酶固定化處理對肉品風味有明顯響應，與樣品A相比，樣品B和樣品C的揮發(fā)性化合物種類和含量均發(fā)生改變，且響應值各不相同，醛類、芳香族化合物和含硫化合物含量增加，有機酸類和烴類物質等含量降低。

2.5.1 醛類化合物

醛類化合物是重要的羰基化合物，來自于脂肪氧化，一般閾值較低，特別是C6～C10醛類化合物具有脂肪香味，是所有熟肉制品中最重要的揮發(fā)性風味物質。其中正己烷的閾值較低，具有青草香和葉香，是脂肪氧化的標志性產物，也是評價肉類和肉類產品氧化狀態(tài)和風味品質的可靠指標[28-29]。3組樣品共同檢測到的醛類有己醛、辛醛、對甲氧基苯甲醛、(E)-2-辛烯醛、苯甲醛、壬醛、苯乙醛。其中，相對質量分數(shù)最高的是對甲氧基苯甲醛，它又稱為茴香醛，有似茴芹和山楂的香氣；相對質量分數(shù)較高的飽和醛還有己醛、3-甲硫基丙醛、乙醛、壬醛、辛醛。由圖6可知，3組樣品中醛類化合物的相對含量分別為15.13%、40.2%和44.05%，表明固定化脂肪酶處理促進了雞肉樣品香氣的增加。

圖6 雞肉樣品處理前后揮發(fā)性成分相對含量的比較Fig.6 Comparison of relative contentsof volatile componentsin chicken samplesbefore and after treatment

2.5.2 芳香族類化合物

形成雜環(huán)化合物的重要中間體物質中有些來源于芳香族類化合物，這些芳香族類化合物能夠提高食品的整體風味。熟雞肉的主要香氣成分就是芳香化合物。3組樣品中均檢出甲苯、1,5-二甲基-4,8-二乙基雙環(huán)苯和2-乙酰氧基甲基-3-亞甲基聯(lián)苯3種芳香族類化合物。3組樣品中芳香族類化合物的相對含量分別為5.14%、21.3%和24.37%，該類化合物含量在固定化脂肪酶處理后的雞肉樣品中有所提高，對整個香氣增加有一定的貢獻。

2.5.3 醇類和酯類

脂肪酸降解及氧化分解脂肪所產生的物質是獲得醇類物質的主要途徑。醇類分為短鏈醇和長鏈醇，低閾值的醇類尤其是長鏈醇，如1-辛烯-3-醇，可以很大程度改變雞肉風味[30]。酯類化合物對風味也有影響，其中大部分具有蜂蜜香氣和水果香氣，可以改善肉品的風味。由圖6可知，3組樣品中醇類和酯類化合物的相對含量分別為18.64%、9.23%和8.02%。

2.5.4 酮類化合物

雞肉樣品中主要檢出的酮類化合物有丙酮、2,3-丁二酮等。酮類物質通常由多不飽和脂肪酸氧化、美拉德反應、氨基酸降解或微生物氧化所產生[31]。由圖6可知，3組樣品中酮類化合物的相對含量分別為23.56%、23.40%和26.24%，其中4-甲基-2-戊酮僅在樣品B和樣品C中檢出。

2.5.5 烯烴類

烯烴主要來自脂肪酸烷氧自由基的均裂，一般被認為對香氣無特殊貢獻，但有些可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體，有助于提高整體風味[32-33]。由圖6可知，3組樣品中烯烴類化合物的相對含量分別為38.53%、31.11%和27.65%，共同檢測出右旋萜二烯，它存在于檸檬、薄荷等多種精油中，具有令人愉快的檸檬香氣[34]。樣品中還檢測出了較多的烯烴和支鏈烷烴，其對整個香氣的和諧有一定的貢獻。

2.5.6 含硫化合物

含硫化合物的閾值低，主要來自氨基酸和還原糖之間的美拉德反應，氨基酸熱溶液的降解和硫氨素的降解，經(jīng)醇醛縮合、醛胺聚合生成，它多有硫磺香氣、洋蔥似的香氣，大部分有肉的香味。由圖6可見，樣品A、B、C中含硫化合物的相對含量分別16.34%、23.43%和25.28%，說明固定化脂肪酶處理對雞肉樣品風味的提升有重要作用。

3 結論

在同一條件下，以微球酶、改性核桃殼固定化脂肪酶和LX-1000HA樹脂固定化脂肪酶3種方法進行固定化，改性核桃殼固定化脂肪酶的活力最高，為169.8 U/mL。電子鼻檢測結果表明，經(jīng)改性核桃殼固定化脂肪酶處理后，雞肉中揮發(fā)性風味物質種類沒有改變，只是部分物質在含量上有不同程度變化。其中，R7傳感器代表的含硫化合物和R9傳感器代表的芳香族類化合物有明顯變化，由此可知，經(jīng)改性核桃殼固定化處理后的脂肪酶和游離脂肪酶具有相同的催化作用，均能夠有效改善雞肉樣品的風味。HS-SPME-GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)酶液處理的雞肉相比，經(jīng)核桃殼固定化脂肪酶處理后的雞肉樣品揮發(fā)性成分主要有醛類、烴類、芳香族類、含硫化合物、有機酸，以及醇和酯類等物質，其中，醛類、芳香族類和含硫化合物類物質相對含量有所提高，有機酸類和烴類物質含量降低。以上研究結果表明：采用改性核桃殼固定化豬肉內源性脂肪酶處理雞肉可以有效增加雞肉的香氣，提高肉品風味。研究為固定化脂肪酶在肉制品中的應用提供了一定的理論依據(jù)。