血清miR-146a、miR-638水平與非小細胞肺癌患者化療耐藥性的相關(guān)性

鄭晶冰

作為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的常用治療手段，化療可有效殺滅癌細胞，改善患者病情，延長生存時間。但部分NSCLC患者接受化療后會出現(xiàn)化療耐藥性，影響治療效果，甚至造成治療失敗，不利于預(yù)后[1]。因此，早期預(yù)測NSCLC化療患者是否發(fā)生耐藥對提高化療效果，改善患者預(yù)后具有重要意義。目前，臨床已有研究指出，微小核糖核酸(MicroRNA，miR)與多種癌癥疾病的化療耐藥性密切相關(guān)[2]。研究指出，miR可通過翻譯抑制或信使RNA降解，調(diào)節(jié)基因表達，其已成為NSCLC的診斷標志物之一[3]。作為miR中的常見類型，miR-146a可與原癌基因啟動子區(qū)相互結(jié)合，降低原癌基因表達，進而抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移[4]；miR-638已被研究證實具有類似抑癌基因的作用，增加肝細胞癌預(yù)后不良風險[5]。由上述miR-146a、miR-638在腫瘤疾病中的作用特點，推測血清miR-146a、miR-638水平可能與NSCLC患者化療耐藥性有關(guān)。既往研究多關(guān)注miR-146a、miR-638與腫瘤患者的預(yù)后、轉(zhuǎn)移及細胞遷移、侵襲方面[6]，而關(guān)于化療耐藥方面的研究較少。基于此，本研究將重點分析血清miR-146a、miR-638水平與NSCLC患者化療耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2019年1月至2020年2月接受化療且化療結(jié)束后產(chǎn)生耐藥性的62例NSCLC患者作為耐藥組，同期納入接受化療且化療結(jié)束后未產(chǎn)生耐藥性的62例NSCLC患者作為敏感組。納入標準：①符合NSCLC相關(guān)診斷標準[7]，且經(jīng)影像學、細胞學檢查確診；②預(yù)計生存時間>3個月；③惡性腫瘤國際臨床病理分期(tumor lymph node metastasis，TNM)[8]為ⅢB期；④全部患者均接受相同的同步放化療方案，且放化療周期一致；⑤患者病歷資料、影像學檢查結(jié)果等資料均完整。排除標準：①伴有其他胸廓內(nèi)腫瘤的患者；②既往接受手術(shù)治療的患者；③合并傳染性疾病的患者；④合并敗血癥的患者；⑤血小板<80×109/L的患者。2組一般資料比較(P>0.05)，具有可比性。見表1。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 全部患者均接受相同的同步放化療方案。化療采用EP方案：第1、8天，靜脈滴注順鉑50 mg/m2，正規(guī)水化、利尿；第1～5天，靜脈滴注依托泊苷50 mg/m2，1次/天。每4周重復，化療2個周期，同步接受三維適形放療，單次劑量46～50 Gy，每周進行5次，共進行10次。

1.2.2 化療耐藥性(膠滴腫瘤藥物檢測法)檢測方法 化療結(jié)束1 d時，患者接受纖維鏡活檢，取0.5～1 mm的新鮮腫瘤組織，使用組織消化酶進行消化，消化后使用篩網(wǎng)進行過濾，最后使用湖南邁克爾實驗儀器有限公司的KC-42B低速離心機進行離心處理，以3000 r/min的離心速度，共離心10 min，離心完畢后取下部分，并將其加入在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中，制備細胞混懸液。在冰浴環(huán)境下，制備細胞-膠原蛋白混合液，接種在24孔的細胞培養(yǎng)板。24 h后，加入血漿藥物濃度的順鉑，靜置24 h。實驗過程中涉及無藥物的空白組。結(jié)果判定標準[9]：采用含藥組的細胞數(shù)量/空白組數(shù)目的百分比評估藥物敏感性，若<50%則判定為化療敏感，≥50%則為化療耐藥，分別納入耐藥組和敏感組。

1.2.3 基線資料調(diào)查方法 自制基線資料調(diào)查問卷，記錄患者一般情況，包括：①年齡；②腫瘤直徑；③病理類型；④飲酒史：飲酒時間>5年，每次攝入酒精量>10 g；⑤吸煙史：連續(xù)或累計吸煙6個月或以上；⑥病程。

1.2.4 實驗室指標檢測方法 (1)血清糖類抗原(carbohydrate antigen，CA)125、CA199：采集患者化療前1 d的清晨空腹靜脈血5 ml，以8000 r/min的離心速度共離心6 min，離心完畢后取上清液待檢。使用上海酶聯(lián)生物的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定血清CA125、CA199水平。(2)血清miR-146a、miR-638：采集患者化療前1 d的清晨空腹靜脈血3 ml，使用長沙英泰儀器有限公司的TD4A型低速醫(yī)用離心機進行離心處理，以3000 r/min的離心速度，共離心10 min，離心完畢后取上清液待檢。以總RNA 5 μl為模板，使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成互補脫氧核糖核酸(Complementary DNA，cDNA)。總反應(yīng)體系為15 μl，反應(yīng)條件如下：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。miR-146a的正向引物序列為：5'-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3'，反向引物序列為：5'-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3'。內(nèi)參基因U6上游序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游序列為：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。miR-638的正向引物序列為：5'-TTGGCCTACCTATAACT-GG-3，反向引物序列為：S'-CTGTAATATGCGGTAAGTCTd。以cRNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。擴增條件：95 ℃10 min，95 ℃ 45 s，58 ℃ 20 s，40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，U6正向引物序列為：5'-ATTG-GAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列為：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，計算miR-146a 的相對定量表達水平(ΔCt=CtmiR-146a-CtU6)及miR-638 的相對定量表達水平(ΔCt=CtmiR-638-CtU6)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 2組患者基線資料、實驗室指標對比

耐藥組血清miR-638 mRNA相對表達量水平低于敏感組，miR-146a mRNA相對表達量高于敏感組，差異統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組間其他資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者基線資料、實驗室指標對比

2.2 NSCLC患者化療耐藥性與血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量的相關(guān)性分析

經(jīng)Kendall's tau-b相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，NSCLC化療耐藥性與血清miR-638 mRNA相對表達量水平呈負相關(guān)(γ=-0.707，P<0.001)，與血清miR-146a mRNA相對表達量水平呈正相關(guān)(γ=0.687，P<0.001)。

2.3 血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量預(yù)測NSCLC患者化療耐藥性風險的效能分析

將化療前血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量水平作為檢驗變量，NSCLC患者化療耐藥性情況作為狀態(tài)變量(1=耐藥，0=敏感)，繪制ROC曲線(見圖1)，結(jié)果顯示，血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量單獨及聯(lián)合預(yù)測NSCLC患者化療耐藥風險的AUC均>0.70，預(yù)測價值較理想，且以化療前血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量cut-off值取2.845、1.875時，聯(lián)合預(yù)測的價值最好。見表2。

圖1 血清miR-146a、miR-638 mRNA相對表達量預(yù)測NSCLC患者化療耐藥性風險的ROC曲線圖

表2 血清miR-146a、miR-638 mRNA相對表達量預(yù)測NSCLC患者化療耐藥性風險的效能

3 討論

化療已被證實是癌癥的常用治療方法，但部分患者對化療藥物存在不同程度的耐藥，當患者出現(xiàn)化療耐藥時，不僅會影響化療效果，還會增加病情惡化風險，不利于預(yù)后[10]。因此，為降低NSCLC患者的化療耐藥性，需早期預(yù)測患者化療耐藥性發(fā)生風險，并給出針對性建議。

研究表明，細胞凋亡與化療耐藥性密切相關(guān)，凋亡因子的異常表達可降低化療藥物對腫瘤細胞的促凋亡作用，增加耐藥性風險[11-12]。miRNA可調(diào)節(jié)notch、mTOR信號轉(zhuǎn)導通路等多條腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導通路，研究表明，miRNA與腫瘤細胞凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]。作為miRNA類型中的一種，miR-146a可與靶基因巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)結(jié)合后抑制靶基因MIF表達，而MIF的編碼蛋白主要由T淋巴細胞分泌，能夠抑制腫瘤細胞中的巨噬細胞發(fā)揮招募、遷徙等功能，從而抑制巨噬細胞功能，促進腫瘤發(fā)展。此外，研究表明，miR-146a可影響c-Jun氨基末端激酶基因表達，從而參與調(diào)控NSCLC腫瘤細胞的增殖與凋亡[14]。miR-638也是miRNA中的一種，已被研究證實在多種惡性腫瘤中的表達下調(diào)，表明miR-638在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能具有負向調(diào)控的作用。研究表明，miR-638與順鉑誘導的細胞凋亡存在密切關(guān)聯(lián)[15]。因此，結(jié)合上述，推測血清miR-146a、miR-638可能與NSCLC化療耐藥性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，耐藥組血清miR-638 mRNA相對表達低于敏感組，miR-146a mRNA相對表達高于敏感組，且經(jīng)雙變量Kendall直線相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，NSCLC化療耐藥性與血清miR-638 mRNA相對表達量呈負相關(guān)，與血清miR-146a mRNA相對表達量呈正相關(guān)。表明血清miR-638 mRNA相對表達量、miR-146a mRNA相對表達量與非小細胞肺癌患者化療耐藥性具有相關(guān)性。分析其可能的原因為：原癌基因(C myc oncogene，c-Myc)與細胞增殖、抑制凋亡等過程有關(guān)，當c-Myc缺失、突變時導致腫瘤細胞凋亡異常，繼而降低化療藥物誘導細胞凋亡的能力，增加化療耐藥性[16]。miR-146a可通過降低核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(nuclear factor Kappa Beta，NF-κB)的表達，促使c-Myc的蛋白表達下降，促使化療藥物誘導細胞凋亡過程發(fā)生異常，導致化療耐藥情況發(fā)生[17]。作為一種癌基因，B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)與細胞凋亡抑制有關(guān)，研究表明，Bal-2表達產(chǎn)物可阻斷或阻礙化療藥物誘導細胞凋亡進程，促使腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受[18]。研究指出，miR-638表達上調(diào)，可抑制癌基因bcl-2的表達，促進細胞凋亡，降低細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[19]。最后本研究對血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量預(yù)測患者化療耐藥風險繪制了ROC曲線，結(jié)果顯示，血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638mRNA相對表達單獨及聯(lián)合預(yù)測NSCLC患者化療耐藥風險的AUC均>0.70，預(yù)測價值較理想，且以聯(lián)合預(yù)測的價值最好。上述結(jié)果均證實，NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量不僅是患者發(fā)生化療耐藥性的風險因子，且可作為評估患者發(fā)生化療耐藥性的關(guān)鍵標志物。上述結(jié)果也表明，臨床早期監(jiān)測NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量，可在積極治療原發(fā)病的同時實施合理干預(yù)，如提高患者免疫功能，中西醫(yī)結(jié)合治療等，可能對降低化療耐藥性發(fā)生風險、提高化療效果有積極意義。雖本研究得到了血清miR-146a mRNA相對表達量、miR-638 mRNA相對表達量與NSCLC患者化療耐藥有關(guān)，但該結(jié)果可能會受研究設(shè)置條件、樣本量小等因素影響而導致結(jié)果出現(xiàn)偏倚，未來還需進一步開展研究、探索。

綜上所述，NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA、miR-638 mRNA相對表達量與化療耐藥有關(guān)，臨床可考慮通過檢測NSCLC患者化療前血清miR-146a mRNA、miR-638 mRNA相對表達量，分析患者化療耐藥風險，以盡早予以合理干預(yù)。