• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    適用魚油加工的Patatin酯酶固定化及其特性研究

    2022-04-22 02:10:26涂蘭蘭許璟珅陳潤莎吳金鴻李向紅
    南方水產(chǎn)科學(xué) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:磁珠酯酶游離

    涂蘭蘭,許璟珅,陳潤莎,吳金鴻,李向紅,張 勇

    1. 上海交通大學(xué)a. 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,b. 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200241

    2. 長沙理工大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,湖南 長沙 410114

    脂肪酶 (Lipase, EC 3.1.1.3) 作為一種絲氨酸水解酶,其可作用于長鏈甘油三酯的水解過程中,最后得到產(chǎn)物脂肪酸和甘油[1]。脂肪酶可以參與甘油酯類化合物的合成和水解反應(yīng),還能催化酯合成反應(yīng),包括酯化、酯交換、醇解和酸解[2]。脂肪酶在水產(chǎn)中應(yīng)用廣泛,既可以添加到飼料中提高飼料利用率、魚的生長性能和腸道免疫力[3],還可以添加到魚糜中,增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度,改善魚糜凝膠特性[4]。此外,還有研究者利用脂肪酶的催化特性,對魚油進(jìn)行水解處理,在最佳工藝條件下,魚油中EPA由3.0%提高至9.0%,DHA由4.3%提高至16.5%[5]。

    1980年,Racusen和Foote[6]利用陰離子交換層析和親和層析技術(shù)首次分離純化得到Patatin酯酶。Patatin是一種脂肪酶,酶解活性好[7],具有良好的乳化性[8]、起泡性[9]和凝膠性[10]。目前,關(guān)于Patatin酯酶已經(jīng)開展了其替代動物蛋白作為葡萄酒澄清劑[11]、作為添加劑制作干酪[12]和蛋白酶水解試驗[13]等研究,但關(guān)于其脂肪水解應(yīng)用研究還未深入。本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Patatin可以水解魚油從而達(dá)到富集多不飽和脂肪酸的目的,在Patatin最佳反應(yīng)條件下,魚油中的不飽和脂肪酸含量可以達(dá)到97.72%,其中EPA含量比原魚油多了4.20%,由此可見Patatin在魚油等水產(chǎn)脂質(zhì)的制備及加工方面具有潛在應(yīng)用價值。

    游離的Patatin酯酶穩(wěn)定性差,且在工業(yè)生產(chǎn)中也很難被重復(fù)利用。酶的固定化技術(shù)可以改善以上缺點(diǎn)。脂肪酶的固定方法包括吸附法[14]、包埋法[15]、共價結(jié)合法[16]等。納米載體具有無毒無污染、比表面積大等優(yōu)勢,本實(shí)驗研究了納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合的最優(yōu)條件和固定化酶的酶解特性,以期為開發(fā)高穩(wěn)定性Patatin酯酶及其工業(yè)化應(yīng)用推廣提供新的技術(shù)思路和理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗材料

    馬鈴薯全粉:冷凍干燥制備,原料品種為克新1號;Q-Sepharose fast,美國GE Healthcare 公司;對硝基苯乙酸酯,美國Sigma公司;PB緩沖液 (0.2 mol·L-1, pH 7.2~7.4),上海少辛生物科技有限公司;鹽酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;ConA,阿拉丁 (上海) 有限公司;BSA,阿拉丁 (上海) 有限公司;NHS固體,上海少辛生物科技有限公司;EDC固體,上海少辛生物科技有限公司;MES,上海少辛生物科技有限公司;磁珠 (SR600-20210114-1),上海邁景生物科技有限公司。

    1.2 Patatin酯酶溶液的制備

    根據(jù)吳喬羽等[17]實(shí)驗方法以馬鈴薯全粉為原料,利用酸沉淀法提取得到粗蛋白質(zhì)液,再根據(jù)孫瑩等[18]實(shí)驗方法做適當(dāng)改進(jìn)后,用Q-Sepharose Fast Flow (2.6 cm×20 cm) 柱子洗脫粗蛋白液,獲得Patatin酯酶溶液。

    1.3 磁珠與ConA的偶聯(lián)及偶聯(lián)ConA磁珠上清的BCA實(shí)驗

    1.3.1 磁珠與 ConA 的偶聯(lián)

    取5 mg (200 μL) 磁珠分別置于4個離心管中,其中1組為對照管,另外3組為實(shí)驗管。移液器吸取 MEST 溶液 (50 mmol·L-1, pH 6.0) 500 μL置于每管,洗滌3次,每30 s換1次MEST溶液。之后使用移液器吸取500 μL配制好的NHS溶液(50 mg·mL-1) 置于每管中,然后吸取 500 μL 配置好的EDC溶液 (50 mg·mL-1) 置于每管中,混勻后放在旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)15 min?;罨Y(jié)束后利用磁力架吸附磁珠,移液槍吸取上清液,加入500 μL MEST溶液洗滌,重復(fù)3次。向?qū)φ展芗尤? 000 μL MEST溶液,實(shí)驗管加1 000 μL配置好的不同濃度梯度的ConA溶液,置于37 ℃恒溫箱中的旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)2 h后,保留上清,做BCA蛋白質(zhì)定量測試,磁珠加入1 000 μL封閉液洗滌,重復(fù)3次,再加1 000 μL的封閉液,在4 ℃冰箱旋轉(zhuǎn)混合儀上轉(zhuǎn)動12~15 h。將封閉過夜的磁珠實(shí)驗管放入磁分離架中,吸取上清液,然后取1 000 μL保存液,洗滌3次,加入500 μL保存液待用 (4 ℃冰箱) 。

    1.3.2 偶聯(lián) ConA 磁珠上清的 BCA 實(shí)驗

    將1.3.1中的上清液用BCA法定量測定蛋白質(zhì)濃度。取稀釋至濃度為0、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mg·mL-1BSA 溶液待用,配置 0.7 mg·mL-1ConA待用。實(shí)驗共用1個標(biāo)準(zhǔn)曲線及ConA實(shí)驗結(jié)果。取酶標(biāo)板,先在每孔中加入標(biāo)準(zhǔn)液或樣品20 μL,每組做3個平行。吸取200 μL顯色液加入每孔中。全部加完后置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min。取出后置于酶標(biāo)儀上于波長為562 nm條件下測定蛋白濃度及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4 Patatin酯?;饷腹潭ɑ瘲l件優(yōu)化

    1.4.1 Patatin 酯酶活性的測定方法

    參照Racusen和Foote[6]的方法,稍作修改。稱取63 mg對硝基苯乙酸 (PNP-acetate),溶解于10 mL乙醇中,4 ℃保存?zhèn)溆?。測定時,取1 mL對硝基苯乙酸的乙醇溶液加入9 mL去離子水定容至10 mL。取純化的目的蛋白質(zhì)Patatin溶液,若溶液有渾濁,則在3 000 r·min-1條件下離心5 min,取上清液作為實(shí)驗用蛋白質(zhì)液。反應(yīng)體系見表1。

    表1 Patatin酯酶活性測定反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for patatin lipase activity

    水浴保溫20 min后,加入600 μL無水乙醇終止反應(yīng),待冷卻至室溫后用酶標(biāo)儀在波長430 nm下測定吸光值。每組實(shí)驗平行重復(fù)3次,A430nm每分鐘變化0.01定義為1個酶活力單位,按照以下公式來計算酶的比活:

    式中:U表示酶比活力 [U·(min·g)-1];ΔA表示反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化值;W表示樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量 (g);T表示反應(yīng)總時間 (min)。

    1.4.2 Patatin 酯酶固定化條件的優(yōu)化

    由于在固定化過程中,酶的活力會受到固定化材料、時間、溫度等外部條件的影響。其他固定化條件相同,探究固定化材料 (聚丙烯酸PAA、琥珀酸SA、聚苯乙烯PS)、固定化時間 (20、30、40、50、60 min)、固定化溫度 (20、25、30、35、40、45 ℃) 以及載體量 (1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg) 對固定化Patatin酯酶活力的影響。

    1.4.3 Box-Benhnken 響應(yīng)面實(shí)驗優(yōu)化 Patatin 酯酶固定化條件

    采用Box-Benhnken響應(yīng)面分析法,以Patatin酯酶比酶活力為響應(yīng)值,以固定化時間 (A)、固定化溫度 (B)、磁珠添加量 (C) 為自變量,設(shè)計三因素三水平共17個試驗點(diǎn)來優(yōu)化Patatin酯酶的固定化條件,其中選取5個試驗點(diǎn)作為中心點(diǎn)用于估計試驗誤差,其余12個試驗點(diǎn)均為析因點(diǎn)。響應(yīng)面試驗因素和水平見表2。

    表2 固定條件Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 2 Box-Benhnken response surface factors and levels of immobilization conditions

    1.5 Patatin酯酶固定化納米磁珠特性分析

    采用原子力顯微鏡觀察與測定Patatin酯酶固定化前后的表面特征與ζ-電勢。

    1.6 固定化Patatin酯酶最佳酶解條件測定

    其他酶解條件相同,探究pH (4、5、6、7、8、9、10、11)和溫度 (20、25、30、35、40、45、50、55 ℃) 對固定化Patatin酯酶的影響,根據(jù)所測酶活力繪制固定化相對酶活力。

    1.7 固定化Patatin酯酶穩(wěn)定性及重復(fù)利用率測定

    1.7.1 固定化前后 Patatin 酯酶耐熱性測定

    保持其他處理條件相同,分別將固定化酶和游離酶放置在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中1 h。處理1 h后將固定化酶和游離酶取出,測定酶活力。根據(jù)酶活力繪制固定化酶和游離酶相對酶活力曲線,比較兩者對熱的耐受性。

    1.7.2 固定化前后 Patatin 酯酶 pH 耐受性測定

    保持其他處理條件相同,分別將固定化酶和游離酶放置在pH為4、5、6、7、8、9、10、11的環(huán)境中1 h。處理1 h后將固定化酶和游離酶取出,測定酶活力。根據(jù)酶活力繪制固定化酶和游離酶相對酶活力曲線,比較兩者pH耐受性。

    1.7.3 固定化 Patatin 酯酶重復(fù)利用率測定

    稱取制備好的固定化酶,在40 ℃、pH 7條件下連續(xù)反應(yīng)5次,以第一次反應(yīng)的酶活力為100%,探究該固定化酶的重復(fù)利用率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

    收集洗脫液,進(jìn)行電泳分析 (圖1)。在相對分子量為43 kD左右的位置有1條主要的蛋白質(zhì)條帶,與文獻(xiàn)[17]中所得到的Patatin酯酶分子量基本一致。說明用Q-Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱分離并用緩沖液Ⅱ洗脫下來的組分中含有目的蛋白質(zhì)。

    圖1 親和色譜分離組分SDS-PAGE分析結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE of fractiones separated by affinity chromatography

    2.2 磁珠與ConA的偶聯(lián)及其吸附率測定

    根據(jù)1.3的方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.672 22x+0.140 16,R2=0.994 2,表明該模型可以解釋響應(yīng)值總變異的99.42%。

    圖2 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of protein concentration determined by BCA method

    納米磁珠ConA吸附量及其吸附率3個批次測定結(jié)果見表3,實(shí)驗結(jié)果顯示,每毫克磁珠平均吸附33.77 μg ConA,平均吸附率為24.50%。

    表3 磁珠與ConA的偶聯(lián)實(shí)驗結(jié)果Table 3 Results of coupling experiment between magnetic beads and ConA

    2.3 Patatin酯酶固定化條件優(yōu)化

    2.3.1 Patatin 酯酶最適固定化材料

    PAA、SA、PS 3種材料中,PAA效果最好,SA效果最差 (圖3)。PAA有一定的親水性,同時又具有多孔的結(jié)構(gòu),能夠增加載酶量的同時保證酶的高活性[20]。

    圖3 固定化材料對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 3 Effect of immobilized materials on immobilized patatin lipase

    2.3.2 Patatin 最適固定化時間

    隨著固定化時間的增加,固定化效果呈現(xiàn)增加的趨勢 (P<0.05,圖4) ,說明固定化Patatin酯酶量增加,當(dāng)時間超過50 min以后,隨著時間的增加,磁珠固定化效果下降,因此最佳固定化時間為50 min。時間超過50 min后磁珠固定化效果下降,可能是因為固定化溫度較高,固定化時間過長導(dǎo)致Patatin酯酶活性下降[21]。

    圖4 固定化時間對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 4 Effect of immobilized time on immobilized patatin lipase

    2.3.3 Patatin 最適固定化溫度

    溫度介于20~25 ℃,納米磁珠固定化效果隨溫度升高而逐漸上升 (P<0.05) ,并且在25 ℃時固定化效果達(dá)到最大 (圖5)。溫度超過25 ℃以后,納米磁珠固定化效果隨溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05) 。納米磁珠固定化效果率隨溫度升高而達(dá)到最大值時的溫度被稱為最適固定化溫度,在本研究中最適固定化溫度為25 ℃。固定化溫度過低會導(dǎo)致磁珠固定化Patatin酯酶質(zhì)量較低,但是固定化溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而降低納米磁珠固定化效果。Patatin酯酶本質(zhì)是一類具有催化作用的活性蛋白質(zhì),溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而部分或全部失去其水解活性[22]。

    圖5 固定化溫度對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 5 Effect of immobilized temperature on immobilized patatin lipase

    2.3.4 Patatin 最適磁珠添加量

    磁珠添加量介于1.0~3.0 mg·mL-1,固定化效果隨磁珠添加量升高而逐漸上升(P<0.05) ,并且在3.0 mg·mL-1時固定化效果達(dá)到最大(圖6)。磁珠添加量超過3.0 mg·mL-1以后,固定化效果隨磁珠添加量的升高呈現(xiàn)下降趨勢 (P<0.05) 。固定化效果隨磁珠添加量升高而達(dá)到最大值時的添加量被稱為最佳磁珠添加量[23],在本研究中最佳磁珠添加量為3.0 mg·mL-1。磁珠添加量過低會導(dǎo)致磁珠固定化Patatin質(zhì)量較低,但是磁珠添加量過高會導(dǎo)致磁珠相對表面積增大,從而降低納米磁珠固定化效果。

    圖6 磁珠添加量對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 6 Effect of magnetic bead addition on immobilized patatin lipase

    2.3.5 Patatin 最適固定化條件 Box-Benhnken 響應(yīng)面實(shí)驗

    Box-Benhnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

    表4 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Benhnken response surface design and experimental results

    利用Design-Expert對數(shù)據(jù)進(jìn)行計算分析,得到固定化時間 (A)、固定化溫度 (B)、磁珠添加量(C) 3個因素的二次多項回歸模型 (變量為歸一化后的值) 為:

    酶比活力=3.174 5-0.327 9A+0.052 6B+0.003 06C-0.006 2AB+0.003 0AC-0.009 0BC- 0.583 9A2-0.427 1B2-0.692 5C2

    回歸模型的顯著性結(jié)果見表5,模型決定系數(shù)R2=0.995 1,說明該模型可以解釋響應(yīng)值總變異的99.51%,該回歸模型顯著 (P<0.000 1),失擬項不顯著 (P=0.200 2>0.05),說明該模型可以用來擬合各自變量 (固定化時間A、固定化溫度B、磁珠添加量C) 和因變量 (響應(yīng)值) 之間的關(guān)系,并且可以用該模型對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析,可以利用該模型對酶解實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測,確定Patatin酯酶最佳固定化條件。由回歸模型表達(dá)式可知,該模型最高次項為二次,不需要引入更高次數(shù)的項。

    表5 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗回歸模型方差分析表Table 5 Analysis of variance (ANOVA) and results of Box-Benhnken response surface

    基于回歸模型建立響應(yīng)面分析曲線見圖7。由曲面圖中的曲面形狀和等高線分布情況可以看出,取得極值時的酶解反應(yīng)條件出現(xiàn)在所選取的實(shí)驗因素的范圍之內(nèi)。對回歸模型函數(shù)求偏導(dǎo),得到極值點(diǎn)A=-0.3、B=0.1、C=0.0,將極值點(diǎn)換算成試驗條件并選擇整數(shù)值作為實(shí)際操作條件,即為固定化時間47 min,固定化溫度25 ℃,磁珠添加量為3 mg·mL-1。此條件下測得的酶比活力為3.223×104U·g-1。對求解所得的最佳酶解反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗驗證,經(jīng)3次平行重復(fù)實(shí)驗測得Patatin酶比活力為3.149×104U·g-1,相對誤差為2.31%。實(shí)驗結(jié)果說明回歸模型有較好的擬合性,證明了回歸模型的可行性較高。

    圖7 各因素交互作用對Patatin酯酶固定化效果的響應(yīng)曲面Fig. 7 Effects of various factors and their interactions on immobilized patatin lipase

    2.4 Patatin酯酶固定化納米磁珠特性分析

    2.4.1 固定化納米磁珠表面特征分析

    Patatin酯酶固定化納米磁珠從表面上可以明顯看出其顆粒狀且顆粒大小及分布較為均勻,而與Patatin酯酶結(jié)合后顆粒狀消失并且形成較大且大小不均勻的塊狀物,可能是因為納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合,蛋白固定化覆蓋在磁珠表面形成較大顆粒,不易聚合 (圖8-a、8-b)。

    圖8 Patatin酯酶固定化前 (a, b) 與固定化后 (c, d) 表面特征Fig. 8 Surface characteristics of magnetic beads before (a, b) and after (c, d) patatin lipase immobilization

    2.4.2 固定化納米磁珠 ζ-電勢分析

    Patatin酯酶在固定化前后ζ-電勢見表6,可以看出納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合之后,ζ-電勢絕對值降低,說明結(jié)合后顆粒直徑增大,分子間靜電斥力減少,顆粒間穩(wěn)定性降低。

    表6 磁珠固定Patatin酯酶前后ζ-電勢Table 6 ζ- potential of patatin lipase before and after magnetic beads immobilization

    2.5 固定化Patatin酯酶最佳酶解條件

    2.5.1 固定化 Patatin 酯酶最佳酶解 pH

    在不同的pH條件下,固定化Patatin酯酶的酶解活性呈現(xiàn)出一定的差異,其酶解活性隨pH先增大后降低,pH<7時,固定化Patatin酯酶的酶解活性隨著pH的增加而顯著上升 (P<0.05),當(dāng)pH=7時,酶解活性達(dá)到最大值,pH>7以后,酶解活性隨pH的增大而顯著下降 (P<0.05,圖9)。固定化Patatin酯酶的最適pH與游離的Patatin酯酶相同,說明Patatin酯酶與納米磁珠載體結(jié)合后的構(gòu)象變化并沒有顯著影響到Patatin酯酶對于氫離子 (H+) 的敏感度。

    圖9 pH對固定化Patatin酯酶酶解活性的影響Fig. 9 Effect of pH on enzymatic hydrolysis activity of immobilized patatin lipase

    2.5.2 固定化 Patatin 酯酶最佳酶解溫度

    溫度介于20~40 ℃,Patatin酯酶的酶解活性隨溫度的升高而逐漸上升 (P<0.05),并且在40 ℃時固定化效果達(dá)到最大 (圖10)。溫度超過40 ℃以后,納米磁珠固定化效果隨溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢 (P<0.05)。固定化Patatin酯酶最適酶解溫度為40 ℃。Patatin酯酶本質(zhì)是一類具有催化作用的活性蛋白質(zhì),溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而部分或全部失去其水解活性。相較于游離的Patatin酯酶,固定化Patatin酯酶的最適溫度略微升高,可能是因為Patatin酯酶和納米磁珠結(jié)合后熱穩(wěn)定性提高而導(dǎo)致的。

    圖10 溫度對固定化Patatin酯酶酶解活性的影響Fig. 10 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis activity of immobilized patatin lipase

    2.6 固定化Patatin酯酶耐性及回收率

    2.6.1 固定化前后 Patatin 酯酶耐熱性

    隨著處理溫度的升高,固定化Patatin酯酶和游離Patatin酯酶的活性降低 (圖11)。當(dāng)溫度超過30 ℃時,隨著溫度的升高,游離Patatin酯酶的相對活性大大降低,而固定化Patatin酯酶的相對活性則緩慢降低。這可能是由于固定化Patatin酯酶與游離Patatin酯酶相比,限制了酶的構(gòu)象變化,穩(wěn)定了固定化酶的相對酶活性,降低了酶的失活程度,提高了固定化Patatin酯酶的耐高溫性。

    圖11 溫度對固定化前后Patatin酯酶穩(wěn)定性的影響Fig. 11 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis activity before and after patatin lipase immobilization

    類比半抑制濃度 (Inhibitory concentration 50,IC50),本文定義半抑制條件 (Inhibitory condition 50, IC50)。對固定化前后Patatin酯酶溫度耐受性結(jié)果利用SPSS進(jìn)行線性回歸分析 (表7)。游離Patatin酯酶的IC50為18.87 ℃,固定化Patatin酯酶的IC50為42.01 ℃。固定化后溫度耐受性提高了123%左右。

    表7 固定化前后Patatin酯酶溫度耐受性的回歸分析Table 7 Regression analysis of temperature tolerance before and after patatin lipase immobilization

    2.6.2 固定化前后 Patatin 酯酶 pH 耐受性

    固定化Patatin酯酶對pH的抗性并不高 (圖12)。只有在pH介于5~9,固定化Patatin酯酶保持稍微較高的酶相對活性。當(dāng)pH值為5和9時,酶的相對活性分別為52.56%和46.85%。

    圖12 pH對固定化前后Patatin酯酶穩(wěn)定性的影響Fig. 12 Effect of pH on enzymatic hydrolysis activity before and after patatin lipase immobilization

    對固定化前后Patatin酯酶pH耐受性結(jié)果利用SPSS進(jìn)行多項式回歸分析,結(jié)果見表8。游離Patatin酯酶的IC50為2.815,固定化Patatin酯酶的IC50為1.915。固定化后Patatin酯酶的pH耐受性提高了47%左右。

    表8 固定化前后Patatin酯酶pH耐受性的回歸分析Table 8 Regression analysis pH tolerance before and after patatin lipase immobilization

    2.6.3 固定化 Patatin 酯酶操作重復(fù)利用率

    固定化Patatin酯酶的重復(fù)利用率見圖13。固定化Patatin酯酶連續(xù)反應(yīng)5次后仍有56.60%的酶活力,相較于游離Patatin酯酶只能進(jìn)行1次操作,固定化Patatin酯酶的重復(fù)利用率顯著提高。

    圖13 固定化Patatin酯酶重復(fù)利用率Fig. 13 Reuse ratio of immobilized patatin lipase

    3 結(jié)論

    本文經(jīng)篩選確定了使用PAA-Fe3O4進(jìn)行Patatin酯酶固定化,其最優(yōu)固定化條件為固定化時間47 min,固定化溫度25 ℃,磁珠添加量為3 mg·mL-1。固定化Patatin酯酶在40.0 ℃、pH 7時水解底物活性最高。從結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合后,Patatin酯酶覆蓋在顆粒表面,顆粒直徑變大,顆粒穩(wěn)定性降低,有聚集顆粒形成。固定化Patatin酯酶的耐熱性相比于游離Patatin酯酶提高了123%左右,pH耐受性提高了47%左右,連續(xù)反應(yīng)5次后仍保留56.60%酶活力,說明納米磁珠固定化后提高了Patatin酯酶的酶催化特性,研究為Patatin在水產(chǎn)品尤其是魚油等脂類物質(zhì)中的加工應(yīng)用提供了有價值的參考。

    猜你喜歡
    磁珠酯酶游離
    地黃梓醇和乙酰膽堿酯酶作用的分子動力學(xué)模擬
    莫須有、蜿蜒、夜游離
    磁珠固定化凝血酶的制備及其在槐米中活性化合物篩選中的應(yīng)用
    蜈蚣草化學(xué)成分及抑制乙酰膽堿酯酶生物活性研究
    新的藥根堿三唑的合成與抗菌以及乙酰膽酯酶抑制活性評價
    超薄游離股前外側(cè)皮瓣修復(fù)足背軟組織缺損
    應(yīng)用磁珠法檢測并提取尿液游離甲基化DNA
    游離血紅蛋白室內(nèi)質(zhì)控物的制備及應(yīng)用
    游離于翻譯的精確與模糊之間——兼評第八屆CASIO杯翻譯競賽獲獎譯文
    二咖啡酰奎寧酸與人血漿阿司匹林酯酶的分子對接
    中成藥(2014年9期)2014-02-28 22:28:55
    我要看黄色一级片免费的| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| av电影中文网址| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 69精品国产乱码久久久| 边亲边吃奶的免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 一本一本综合久久| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日日啪夜夜爽| 久久99热这里只频精品6学生| 最新中文字幕久久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 大陆偷拍与自拍| 黄片播放在线免费| 久久人妻熟女aⅴ| 熟女av电影| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美bdsm另类| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 18禁观看日本| 日本黄色片子视频| 国产av国产精品国产| 久久久欧美国产精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黄片播放在线免费| tube8黄色片| 老司机亚洲免费影院| 久久久久久久精品精品| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲经典国产精华液单| 久久久欧美国产精品| 妹子高潮喷水视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 大香蕉久久网| 夜夜爽夜夜爽视频| 妹子高潮喷水视频| 婷婷色综合www| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 欧美bdsm另类| 美女大奶头黄色视频| 伦精品一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 亚洲av不卡在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲av国产av综合av卡| 色94色欧美一区二区| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲无线观看免费| 中国美白少妇内射xxxbb| 伦精品一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| a 毛片基地| 大香蕉97超碰在线| 国产亚洲精品久久久com| 水蜜桃什么品种好| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲成人手机| 在线观看三级黄色| 亚洲av日韩在线播放| 熟女av电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 精品人妻在线不人妻| 免费观看性生交大片5| 各种免费的搞黄视频| 国产男人的电影天堂91| 人成视频在线观看免费观看| 久久99一区二区三区| 91久久精品电影网| 亚洲精品一二三| 亚洲欧美色中文字幕在线| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久久国产精品人妻一区二区| 午夜福利视频精品| 久久午夜福利片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品亚洲成国产av| 丝袜在线中文字幕| 久久久久久久国产电影| 国产成人免费无遮挡视频| 多毛熟女@视频| 亚州av有码| 国产一区二区在线观看av| 观看av在线不卡| 大香蕉久久成人网| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线观看一区二区三区激情| 97在线人人人人妻| 欧美成人精品欧美一级黄| 人妻人人澡人人爽人人| 色视频在线一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 黄色视频在线播放观看不卡| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品少妇久久久久久888优播| 男女边吃奶边做爰视频| 七月丁香在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 久久99精品国语久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| h视频一区二区三区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日本爱情动作片www.在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 91精品三级在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 色视频在线一区二区三区| 一二三四中文在线观看免费高清| 一级毛片电影观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久久久久久久久大奶| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 丝袜脚勾引网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人影院久久| 大码成人一级视频| 国产av码专区亚洲av| 十八禁网站网址无遮挡| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品人妻久久久久久| 国产探花极品一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品.久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲成色77777| 精品酒店卫生间| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品一国产av| 久久久久久伊人网av| 亚洲国产欧美在线一区| 日本欧美视频一区| 国产深夜福利视频在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲内射少妇av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 婷婷色综合大香蕉| 欧美bdsm另类| 久久久久久伊人网av| 亚洲国产欧美在线一区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲国产精品一区三区| 久久ye,这里只有精品| 日韩大片免费观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品久久久久久电影网| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲av.av天堂| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久精品久久久久真实原创| 日韩制服骚丝袜av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av福利一区| 夫妻午夜视频| av一本久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 大陆偷拍与自拍| .国产精品久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲性久久影院| 我的老师免费观看完整版| 国产 一区精品| 人人妻人人澡人人看| av.在线天堂| 伊人亚洲综合成人网| 91aial.com中文字幕在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 一本色道久久久久久精品综合| 国产成人freesex在线| 国产精品人妻久久久久久| 两个人免费观看高清视频| 大香蕉久久网| freevideosex欧美| 欧美bdsm另类| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 熟女av电影| 岛国毛片在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 十分钟在线观看高清视频www| 日本vs欧美在线观看视频| 久久久亚洲精品成人影院| 一区二区av电影网| 日韩制服骚丝袜av| 一级片'在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 97在线人人人人妻| 人人澡人人妻人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 一区二区三区四区激情视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| a 毛片基地| 999精品在线视频| 丁香六月天网| 91精品一卡2卡3卡4卡| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久人妻熟女aⅴ| 少妇高潮的动态图| videosex国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 蜜臀久久99精品久久宅男| 一区二区av电影网| 夫妻午夜视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久午夜福利片| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久精品区二区三区| 日日啪夜夜爽| 免费看不卡的av| 色94色欧美一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久99蜜桃精品久久| 七月丁香在线播放| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜激情福利司机影院| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久精品国产亚洲网站| 午夜影院在线不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 中文字幕免费在线视频6| 青青草视频在线视频观看| 欧美bdsm另类| 精品久久国产蜜桃| av国产精品久久久久影院| 国产高清国产精品国产三级| 久久97久久精品| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲五月色婷婷综合| av线在线观看网站| 老女人水多毛片| 久久婷婷青草| av.在线天堂| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 制服诱惑二区| 国产一区二区三区av在线| 亚洲怡红院男人天堂| 精品少妇内射三级| 99热这里只有是精品在线观看| 精品久久久噜噜| 免费看不卡的av| 国产精品.久久久| 在线看a的网站| 亚洲国产欧美在线一区| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久久久久久久丰满| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产69精品久久久久777片| 久久精品国产亚洲网站| 另类精品久久| 欧美人与善性xxx| 午夜日本视频在线| 91久久精品国产一区二区三区| 中国国产av一级| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一区二区三区乱码不卡18| 99热6这里只有精品| 亚洲精品一区蜜桃| a级片在线免费高清观看视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产一区亚洲一区在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 婷婷色av中文字幕| 日韩成人伦理影院| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 最近2019中文字幕mv第一页| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99re6热这里在线精品视频| 日本与韩国留学比较| 国产高清国产精品国产三级| 日韩亚洲欧美综合| 天天影视国产精品| www.av在线官网国产| 成人亚洲欧美一区二区av| 中文天堂在线官网| www.色视频.com| 中国国产av一级| 韩国av在线不卡| 欧美一级a爱片免费观看看| 波野结衣二区三区在线| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 高清av免费在线| 插阴视频在线观看视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线播放无遮挡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 大片电影免费在线观看免费| av不卡在线播放| 丝袜在线中文字幕| 精品一区二区三卡| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 少妇丰满av| 亚洲精品日韩av片在线观看| 多毛熟女@视频| 老司机亚洲免费影院| 欧美成人精品欧美一级黄| 91精品一卡2卡3卡4卡| 母亲3免费完整高清在线观看 | 美女主播在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| a 毛片基地| 欧美一级a爱片免费观看看| 人体艺术视频欧美日本| 视频区图区小说| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 麻豆乱淫一区二区| 精品一品国产午夜福利视频| 制服丝袜香蕉在线| 十分钟在线观看高清视频www| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 91精品国产九色| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品视频女| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 高清欧美精品videossex| 精品亚洲成国产av| 少妇高潮的动态图| 中文欧美无线码| 嫩草影院入口| 国产淫语在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产成人av激情在线播放 | 久久精品久久久久久久性| 在线精品无人区一区二区三| 国产 一区精品| 国模一区二区三区四区视频| 成人综合一区亚洲| 久久99精品国语久久久| 日韩强制内射视频| 在现免费观看毛片| 一级爰片在线观看| 国产欧美亚洲国产| 最新的欧美精品一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美三级亚洲精品| 一级a做视频免费观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 一边亲一边摸免费视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 麻豆成人av视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 精品一区在线观看国产| 午夜激情福利司机影院| av有码第一页| 少妇人妻 视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品亚洲成国产av| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 在线 av 中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 三级国产精品欧美在线观看| 免费av中文字幕在线| 99热6这里只有精品| 少妇高潮的动态图| 少妇人妻久久综合中文| 美女cb高潮喷水在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产高清有码在线观看视频| 午夜影院在线不卡| 欧美三级亚洲精品| 丰满乱子伦码专区| 久久99热6这里只有精品| 久久久久国产网址| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品日本国产第一区| 国产又色又爽无遮挡免| 日本色播在线视频| 能在线免费看毛片的网站| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日韩强制内射视频| 欧美 日韩 精品 国产| 女性生殖器流出的白浆| 只有这里有精品99| av卡一久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 男女边摸边吃奶| 观看美女的网站| 亚洲图色成人| 制服丝袜香蕉在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品久久久久久精品古装| 成人免费观看视频高清| 成人国语在线视频| 精品人妻熟女av久视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品偷伦视频观看了| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩av不卡免费在线播放| 日本av手机在线免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久亚洲精品成人影院| 一区二区三区四区激情视频| 成人综合一区亚洲| 五月伊人婷婷丁香| 午夜激情av网站| 丝袜脚勾引网站| 秋霞伦理黄片| 少妇被粗大猛烈的视频| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲国产日韩一区二区| 精品久久国产蜜桃| 久久久久久久久久久丰满| 在线观看免费日韩欧美大片 | 久久久精品免费免费高清| 少妇丰满av| 亚洲国产色片| 国产精品.久久久| 国产高清国产精品国产三级| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 成人综合一区亚洲| 亚洲精品亚洲一区二区| 99九九线精品视频在线观看视频| 99re6热这里在线精品视频| 两个人的视频大全免费| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美一级a爱片免费观看看| av福利片在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美国产精品一级二级三级| 十八禁高潮呻吟视频| 久久99精品国语久久久| 午夜91福利影院| 国产成人一区二区在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲成人一二三区av| 交换朋友夫妻互换小说| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 中国美白少妇内射xxxbb| 99热网站在线观看| 三级国产精品片| 高清午夜精品一区二区三区| 免费大片18禁| 精品久久久噜噜| av福利片在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| av有码第一页| 91久久精品国产一区二区三区| 高清在线视频一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最近手机中文字幕大全| 99re6热这里在线精品视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲av二区三区四区| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲不卡免费看| 视频在线观看一区二区三区| av国产久精品久网站免费入址| 国产不卡av网站在线观看| 精品久久久久久电影网| 少妇熟女欧美另类| 亚洲成人av在线免费| 日本av手机在线免费观看| 久久婷婷青草| 一本色道久久久久久精品综合| 高清毛片免费看| 91aial.com中文字幕在线观看| 午夜激情av网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产综合精华液| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产男女超爽视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 高清av免费在线| 丝袜喷水一区| 精品久久久久久电影网| 久热久热在线精品观看| av.在线天堂| 成人无遮挡网站| 看免费成人av毛片| 免费大片18禁| 日韩在线高清观看一区二区三区| 高清av免费在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日本色播在线视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产免费一级a男人的天堂| 美女内射精品一级片tv| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美精品国产亚洲| 精品人妻一区二区三区麻豆| 视频区图区小说| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 各种免费的搞黄视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 男人操女人黄网站| 久久99热6这里只有精品| 日韩人妻高清精品专区| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲人成77777在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美激情国产日韩精品一区| 制服人妻中文乱码| 成人综合一区亚洲| av又黄又爽大尺度在线免费看| 午夜影院在线不卡| 一级片'在线观看视频| 久久久精品免费免费高清| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 国产精品女同一区二区软件| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 伦理电影免费视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av.av天堂| 久久精品国产a三级三级三级| 久久精品国产自在天天线| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美日韩视频精品一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av欧美aⅴ国产| 水蜜桃什么品种好| 久久免费观看电影| 久久精品夜色国产| 这个男人来自地球电影免费观看 | 午夜激情av网站| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 全区人妻精品视频| av不卡在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 全区人妻精品视频| 大片免费播放器 马上看| 国产免费现黄频在线看| 男女边吃奶边做爰视频| 久久狼人影院| 夫妻午夜视频| 午夜视频国产福利| 国产视频首页在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级a做视频免费观看| 久久久精品免费免费高清| 国国产精品蜜臀av免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美另类一区| 日韩成人伦理影院| 久久久久久久精品精品| 久久鲁丝午夜福利片| 日本av手机在线免费观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 18禁在线播放成人免费| 色5月婷婷丁香| 亚洲情色 制服丝袜| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品99久久久久久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品一区二区在线不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 国产亚洲最大av| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| a级片在线免费高清观看视频| 欧美性感艳星| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久青草综合色| 国产精品.久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲综合精品二区|