沈曉莉, 莊雪明, 錢夢(mèng)書, 馬偉雄, 陳月陽(yáng), 陸超明, 方旭濤, 王詩(shī)波
(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院, 1.急診科, 2.胸外科, 江蘇 無(wú)錫, 214000)
急性肺損傷(ALI)是由各種直接或間接因素導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,進(jìn)而造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,最終導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全的疾病[1-3]。臨床上,ALI好發(fā)于膿毒癥、外傷、肺炎等多種疾病中,其中急性全身炎癥反應(yīng)的肺部特點(diǎn)是肺部浸潤(rùn)、低氧血癥、肺泡或血管屏障功能障礙。ALI導(dǎo)致的肺水腫可對(duì)患者及其家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)[4-5]。因此,深入探討ALI的潛在分子機(jī)制并改進(jìn)目前的治療方法是十分必要的。
微小RNA(miRNA)含有17~22個(gè)核苷酸,是在真核生物中表達(dá)的一種非編碼RNA, 通過(guò)與互補(bǔ)靶位點(diǎn)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的mRNA表達(dá)[6-8]。目前miRNA與多種疾病、細(xì)胞通路和功能有關(guān),涉及分化、增殖和存活等機(jī)制。研究[9-10]顯示循環(huán)miR-182-5p對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型的調(diào)節(jié)至關(guān)重要, miR-182-5p能夠促進(jìn)VSMC分化并抑制其細(xì)胞活力,并且與原發(fā)性高血壓的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。研究[11]顯示敲除miR-182-5p能夠上調(diào)緊密連接蛋白(TJP)的基因表達(dá),并保護(hù)血腦屏障完整性免受甲基苯丙胺濫用導(dǎo)致的損傷。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,而miR-182-5p在ALI中的功能仍然未知。本研究探討ALI中miR-182-5p的表達(dá)水平及其對(duì)肺纖維化和促炎細(xì)胞因子水平的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
本研究選擇6~8周的50只成年雄性C57BL/6小鼠,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[許可證: SCXK(滬)2017-0006; 質(zhì)量合格證號(hào): 60304257], 在控制溫度和濕度的無(wú)特定病原體條件下飼養(yǎng)。向小鼠氣管內(nèi)滴注1 mg/kg 脂多糖(LPS)[采用磷酸鹽緩沖液(PBS)配置,劑量100 mg/mL]以誘導(dǎo)ALI并生成ALI模型,分別在LPS處理后0、6、12、24、48 h向小鼠腹腔注射100 mL的0.4%戊巴比妥鈉; 開胸,結(jié)扎小鼠左主支氣管,取左肺。頸部分離氣管進(jìn)行插管后,采用PBS灌洗右肺3次, 1 mL/次,回收率>80%。將回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心后獲得上清。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及處置流程均通過(guò)本院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。
RAW264.7細(xì)胞和HK-293T 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海典藏細(xì)胞庫(kù),其中HK-293T細(xì)胞在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco, 美國(guó))中培養(yǎng),并添加10%胎牛血清(HyClone, 美國(guó))和1%青霉素/鏈霉素。RAW264.7細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng),所有細(xì)胞均放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
RAW264.7細(xì)胞共分為6組,分別為對(duì)照組(Control),LPS組, LPS+Ad-GFP+Ad-NC組, LPS+Ad-GFP+Ad-miR-182-5p組, LPS+Ad-MAPK1+Ad-NC組和LPS+Ad-MAPK1+Ad-miR-182-5p組。
肺組織在4%體積比(v/v)的多聚甲醛中固定并包埋在石蠟中,以4 μm厚度切片并用蘇木精-伊紅(HE)溶液(索萊寶,中國(guó))染色以評(píng)估病理特征。光學(xué)顯微鏡(Nikon Optiphot, 日本)下采用 Masson染色評(píng)估肺纖維化的組織學(xué)特征,并采用Nikon Digital DS-5 M相機(jī)拍照。
采用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA, 在逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Takara, 中國(guó)大連)上對(duì)分離的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,引物序列見表1。qRT-PCR采用SYBR Green MasterMix(Vazyme Biotech, 中國(guó)南京)和SYBR Green PCR試劑盒(Takara)。以U6和GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行分析。
表1 各基因引物序列情況
將蛋白提取物通過(guò)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(Bio-Rad,美國(guó))分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore, 美國(guó))。每個(gè)膜與兔單克隆抗MAPK1抗體(ab183208, Abcam, 美國(guó))、兔多克隆抗核因子κB(NF-κB)、p65抗體(ab16502, Abcam)、兔多克隆抗 IKBα抗體(ab7217, Abcam)或兔單克隆抗GAPDH(ab181602, Abcam)在4 ℃孵育過(guò)夜,隨后與二抗在室溫下孵育2 h。最后采用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ThermoFisher Scientific, 美國(guó))進(jìn)行顯色。采用Biospectrum-510成像系統(tǒng)(UVP, 美國(guó))進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。
MAPK13′-UTR熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體是通過(guò)將MAPK1mRNA 3′-UTR克隆到熒光素酶報(bào)告基因載體(Promega,美國(guó))。miR-182-5p靶位點(diǎn)突變MAPK13′-UTR 熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體是通過(guò)使用直接位點(diǎn)誘變產(chǎn)生的。進(jìn)一步將HK-293T 細(xì)胞以3×104個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板中,并靜置過(guò)夜。第2天,采用野生型或突變型報(bào)告質(zhì)粒和miR-182-5p模擬物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染后24 h, 使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Promega, 美國(guó))測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性。通過(guò)將螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性相除來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。
使用云克隆ELISA試劑盒測(cè)量BALF中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和髓過(guò)氧化物酶(MPO)的濃度。所有操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
本研究通過(guò)qRT-PCR分析各處理組肺組織中miR-182-5p和MAPK1的表達(dá),結(jié)果顯示miR-182-5p的表達(dá)量在LPS處理6 h后迅速增加,并在12 h達(dá)到峰值,此后miR-182-5p水平下降,并在24 h達(dá)到最低值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。本研究還評(píng)估了LPS給藥后0、6、12、18、24 h肺組織中MAPK1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示MAPK1的表達(dá)水平與miR-182-5p的趨勢(shì)相反,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。
A: miR-182-5p在肺組織中的表達(dá)情況; B: MAPK1在肺組織中的表達(dá)情況。與0 h比較, *P<0.05, **P<0.01。
本研究發(fā)現(xiàn)MAPK1的表達(dá)與miR-182-5p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示,MAPK1是miR-182-5p的潛在靶基因(圖2A)。采用含有野生型MAPK13′-UTR或突變體的報(bào)告基因進(jìn)行了雙熒光素酶測(cè)定,發(fā)現(xiàn)miR-182-5p的過(guò)表達(dá)抑制了野生型,但不抑制突變型熒光素酶報(bào)告基因活性,表明miR-182-5p通過(guò)直接結(jié)合MAPK13′-UTR特異性靶向MAPK1(圖2B)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Ad-miR-182-5p后, miR-182-5p水平上調(diào)(圖2C),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)染Ad-miR-182-5p后,MAPK1mRNA和MAPK1蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)(圖2D、E、F),差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。
A: miR-182-5p與MAPK1的潛在結(jié)合位點(diǎn); B: 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miR-182-5p與MAPK1的靶向關(guān)系;C: 驗(yàn)證各處理組miR-182-5p的表達(dá); D: 驗(yàn)證各處理組MAPK1的表達(dá)情況;E、F: 驗(yàn)證各處理組MAPK1蛋白表達(dá)水平。與相應(yīng)對(duì)照比較, *P<0.05, **P<0.01。
進(jìn)一步行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)兩者的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證,HE染色表明對(duì)照組的肺部形態(tài)特征未發(fā)生明顯改變。與對(duì)照相比,將Ad-GFP+Ad-NC組與LPS+NC組一起作用于肺部會(huì)導(dǎo)致肺部結(jié)構(gòu)破壞和炎癥反應(yīng)(圖3A)。HE染色結(jié)果顯示,與LPS+NC組相比,過(guò)表達(dá)miR-182-5p能夠減輕LPS對(duì)肺組織的損傷,而Ad-MAPK1+Ad-NC與LPS共同給藥增加了肺損傷指數(shù)。與Ad-MAPK1+Ad-NC組相比, Ad-miR-182-5p顯著抑制了Ad-MAPK1+Ad-miR-182-5p組的肺損傷(圖3B)。同樣的, Masson染色也證實(shí)了這部分結(jié)果(圖3C、D)。ELISA檢測(cè)促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-182-5p能抑制炎癥,而過(guò)表達(dá)MAPK1逆轉(zhuǎn)這種抑制作用(圖3E、F)。在反映中性粒細(xì)胞活性的MPO中同樣證實(shí)了這一結(jié)果(圖3G)。上述結(jié)果證實(shí)Ad-miR-182-5p通過(guò)靶向MAPK1產(chǎn)生治療ALI的作用。
A: 各處理組肺組織HE染色結(jié)果(放大倍數(shù)200倍); B: 各處理組肺損傷指數(shù); C: 各處理組肺纖維化評(píng)分情況;D: 各處理組肺組織Masson染色結(jié)果(放大倍數(shù)200倍); E、F、G: 驗(yàn)證各處理組炎癥因子表達(dá)情況。
本研究采用WB法檢測(cè)NF-κB和NF-κB 抑制蛋白α(IκBα)的表達(dá)來(lái)分析NF-κB通路的活性,結(jié)果顯示,LPS處理后能夠顯著增加NF-κB的蛋白質(zhì)表達(dá)并抑制IκBα的表達(dá)。然而,LPS誘導(dǎo)的NF-κB和IκBα蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)被miR-182-5p的過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。與Ad-MAPK1+Ad-miR-182-5p組相比, miR-182-5p能夠通過(guò)調(diào)控MAPK/NF-κB通路減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷。見圖4。
A: 各處理組的NF-κB、IκBα蛋白質(zhì)印跡表達(dá); B: 各處理組的蛋白相對(duì)表達(dá)量(與相應(yīng)對(duì)照組比較, *P<0.05, **P<0.01)。
本研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p的表達(dá)在ALI后0~6 h顯著升高,而在12 h后下調(diào),MAPK1的表達(dá)水平呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。此外,miR-182-5p通過(guò)靶向MAPK1表達(dá)抑制LPS對(duì)肺損傷指數(shù)、肺纖維化及促炎細(xì)胞因子水平的作用,這種作用是通過(guò)MAPK/NF-κB通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
目前研究[12]發(fā)現(xiàn)miRNA可以與3' UTR(非翻譯區(qū))的mRNA結(jié)合,通過(guò)與mRNA中部分互補(bǔ)的靶位點(diǎn)相互作用,在轉(zhuǎn)錄后抑制其表達(dá)。miRNA在大量疾病中扮演著重要角色,本研究發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了miR-182-5p對(duì)肺損傷的治療作用,這一發(fā)現(xiàn)與目前的一些研究[13-15]相似。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種治療作用可能是通過(guò)抑制MAPK1的表達(dá)產(chǎn)生的。盡管有研究[16-18]報(bào)告了MAPK1對(duì)心臟損傷的治療作用,但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAPK1加速了ALI的進(jìn)程,這一現(xiàn)象同樣得到了其他研究數(shù)據(jù)的證實(shí)。研究[19-20]顯示, PD98059作為選擇性MAPK3/MAPK1抑制劑,能夠有效減輕小鼠的ALI。在其他損傷研究領(lǐng)域中同樣發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷模型中抑制MAPK3/MAPK1可降低創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度和細(xì)胞凋亡[21]。上述結(jié)果能夠?yàn)楸狙芯康闹委熜Ч峁┖侠淼慕忉尅?/p>
最后,本研究發(fā)現(xiàn)LPS處理后各組促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和MPO的表達(dá)顯著上調(diào),而過(guò)表達(dá)miR-182-5p能夠有效抑制這種由LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng); 進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這種抑制作用被MAPK1過(guò)表達(dá)所逆轉(zhuǎn),這些結(jié)果證明miR-182-5p通過(guò)靶向調(diào)控MAPK1發(fā)揮治療作用。此外,本研究采用WB法檢測(cè)NF-κB和IκBα的表達(dá)來(lái)分析NF-κB通路的活性,發(fā)現(xiàn)miR-182-5p能夠通過(guò)調(diào)控MAPK/NF-κB通路減輕LPS所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及肺損傷。
綜上所述, miR-182-5p通過(guò)抑制MAPK/NF-κB 信號(hào)通路在ALI中發(fā)揮治療作用,本研究數(shù)據(jù)或可有助于深入了解ALI的潛在分子機(jī)制和治療新方法的開發(fā)。