葡萄灰霉病生防芽胞桿菌的篩選與防效評價

付莉媛，蔡瑞杰，馮志敏，宋新娜,，朱英波，史鳳玉,3，劉建斌

（1. 河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，昌黎 066004；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，北京 100097；3. 河北科技師范學(xué)院河北省作物逆境生物學(xué)重點實驗室（籌），秦皇島 066000）

葡萄是世界上廣泛種植的水果之一，由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的灰霉病是葡萄主要病害，嚴(yán)重影響葡萄果實的品質(zhì)和產(chǎn)量[1,2]?；移咸焰咴谧匀粭l件下即可侵染葡萄植株，造成灰霉病的大量發(fā)生，一般造成的經(jīng)濟(jì)損失在5%～20%，嚴(yán)重時可達(dá)80%以上，甚至毀棚，給種植戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。

目前，我國對葡萄灰霉病的控制多以化學(xué)藥劑防治為主，常用的化學(xué)藥劑主要有丙烷脒、多菌靈、噻菌靈和腐霉利等，均有較好的抑制效果[4]。然而，化學(xué)藥劑不當(dāng)使用不僅會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，同時也會增加病原菌的抗藥性，導(dǎo)致防治效果降低[5,6]。生物防治具有安全性高、無污染，不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，是目前最有應(yīng)用前景的防治方法。多年來，關(guān)于利用生防菌控制灰霉病的研究已有較多報道，如Eald等[7]、童蘊慧等[8]發(fā)現(xiàn)哈茨木霉、綠色木霉具有防治葡萄灰霉病的效果[9]。荊卓瓊[10]、葉濤等[11]發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌對番茄灰霉病有很好的抑制作用。

但以葡萄灰霉病為靶標(biāo)的生防芽胞桿菌的篩選與研究相對較少，本研究以灰葡萄孢菌為靶標(biāo)病原菌，從健康葡萄根際土壤進(jìn)行分離、篩選生防菌，通過對峙法篩選出對灰葡萄孢菌有抑制作用的生防芽胞桿菌，并制成生物菌肥，通過田間試驗評價其對葡萄灰霉病的防治效果，以期為葡萄灰霉病的生物防治提供理論依據(jù)和應(yīng)用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

土壤樣品采集自我國新疆、山東以及河北等葡萄主產(chǎn)區(qū)的葡萄根際土壤（0～20 cm）及健康新鮮的葡萄葉片備用。

供試牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（用于芽胞桿菌分離和培養(yǎng)）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1000 mL。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，去離子水定容至1000 mL。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（用于葡萄灰霉病原菌培養(yǎng)）：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1000 mL。

供試灰葡萄孢菌Botrytis cinerea由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所微生物科學(xué)實驗室分離保存。

對照藥劑腐霉利購自四川潤爾科技有限公司，用于葡萄灰霉病發(fā)病期的防治。

1.2 拮抗菌株分離與培養(yǎng)

稱取供試土樣5 g，加入裝有45 mL無菌水的100 mL三角瓶中，置于搖床上振蕩30 min（200 r/min，28 ℃）充分混勻后80 ℃水浴15 min，無菌條件下吸取1 mL接入裝有9 mL無菌水的試管中，依次梯度稀釋至10-8，分別吸取10-6、10-7和10-8的懸浮液100 μL在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中涂布，并置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

將新培養(yǎng)的平板單菌落分別接種到裝有50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h即得待測菌液。

1.3 拮抗菌株篩選

平板對峙法：將直徑為1.5 cm灰葡萄孢菌的菌餅，接至PDA培養(yǎng)基平板中心，在距菌餅2.5 cm處的左右兩邊各放置1個無菌牛津杯，分別向其中加入100 μL待測菌液，對照組加等量無菌菌液，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，每個處理3個重復(fù)。待對照菌落長滿平板時，測量抑菌帶寬度及病原菌菌落直徑。抑制率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.4 生物菌肥的制備

分別挑取培養(yǎng)24 h的目標(biāo)生防芽胞桿菌菌株（BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1）接種至無菌的50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)好的發(fā)酵液加入12 g輕質(zhì)碳酸鈣攪拌均勻，置于干燥箱中37 ℃烘干至含水量為20%左右即得芽胞桿菌菌粉，將菌粉與有機(jī)水溶肥（微基生物技術(shù)（深圳）有限公司提供）按質(zhì)量比為 100:0.3的比例混合制得生物菌肥（BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1生物菌肥的微生物數(shù)量分別為3.5.0×1010、3.0×1010、6.5×1010和7.0×1010CFU/mL）。

1.5 拮抗菌株在離體葉片及果實上的抑制作用

將采摘的新鮮葡萄葉片或葡萄果實用無菌水沖洗，常溫?zé)o菌條件下風(fēng)干，隨機(jī)分組，每組10片或10顆。用無菌手術(shù)刀在葉片主脈或葡萄果實兩側(cè)切出兩個長2 cm的傷口，然后將各組葉片或葡萄果實浸入灰葡萄孢菌菌懸液（106CFU/mL）中5 s后取出，自然晾干，再將葡萄葉片或葡萄果實分別浸于生物菌肥600倍稀釋液中15 s后取出晾干，以浸泡無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和無菌水作為對照組。將不同處理的葉片或果實在室溫條件（25 ℃）下置于培養(yǎng)皿（d=9 mm）的濾紙上，并滴加2 mL已滅菌的去離子水，7～15 d后觀察結(jié)果。葡萄灰霉病分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，全葉或者果無病；1級，25%以下葉或者果腐爛；2級，25～50%葉或者果腐爛；3級，50～75%葉或者果腐爛；4級，75%以上葉或者果腐爛，按照公式計算病情指數(shù)和生防效果。病情指數(shù)＝[Σ（各級病葉或者果數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值）/（調(diào)查葉或者果數(shù)×4）]×100，生防效果（%）＝[（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100。

1.6 生物菌肥對葡萄灰霉病田間防治效果

田間試驗在河北省衡水市饒陽縣屯里鄉(xiāng)屯里村、五公鎮(zhèn)許張保村和北廣村的葡萄塑料大棚（長1.5 m，寬11.5 m）進(jìn)行，葡萄種植株距為1.2 m，行距為2.5 m，葡萄樹為成齡期第2年。試驗共設(shè)7個處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)1壟（每壟10株葡萄樹）。將1.4方法制備的生物菌肥BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1分別各稀釋600倍、對照藥劑腐霉利（山東裕豐源農(nóng)業(yè)科技有限公司）稀釋600倍、空白對照（CK）及有機(jī)水溶肥對照。所有處理進(jìn)行2次藥劑噴施，噴施時間選擇在上午9：00—11：00，7 d后相同方法進(jìn)行第2次噴施，藥劑施用量均按照每棵葡萄2.5 g藥劑的用量進(jìn)行（2.5 g/棵）。試驗前調(diào)查每行葉片總數(shù)，第二次施藥后分別于7、15 d調(diào)查葉片發(fā)病情況，病情指數(shù)和防治效果同上。

1.7 葡萄灰霉病拮抗菌株的鑒定

1.7.1 拮抗菌培養(yǎng)性狀觀察 將生防效果較好的4株菌株用劃線法分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)12 h后觀察菌落顏色及形態(tài)；經(jīng)革蘭氏染色后，在高倍顯微鏡（德國徠卡，DM2500）下觀察菌落形態(tài)，并拍照記錄。

1.7.2 拮抗菌的分子鑒定 將待鑒定菌株分別進(jìn)行DNA的提取，選取適合的引物27F（5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 25 μL：TaqMIX 12.5 μL，引物 27F和 1492R各 0.5 μL，DNA 1 μL，去離子水補足至 20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min；93 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸90 s。將PCR產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志技術(shù)有限公司所進(jìn)行測序，待得到測序序列后，在NCBI進(jìn)行BLAST比對，獲得同源序列，然后確定菌株分類地位[12]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

統(tǒng)計分析采用SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 24，USA），進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理；系統(tǒng)發(fā)育樹采用MEGA7（Mega Limited，Auckland，New Zealand）。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)拮抗菌篩選

從不同地區(qū)土樣中分離獲得29株細(xì)菌菌株，通過平板對峙試驗篩選獲得14株具有拮抗性能，其中病原生長半徑小于1.50 cm以下（對照病原半徑4.23 cm）且抑制率大于60%的菌劑共用有7株，分別為BF 2-4、BF3-1、BF4-1、BF3-7、BF2-1、BF3-2及BF3-4（表1）。

表1 芽胞桿菌在平板上對灰葡萄孢抑制率Table 1 The inhibitory rate ofBacillusspp. againstB. cinereaon the plate

2.2 拮抗菌在離體葉片上的抑制作用

從圖1和表2可知，在14株供試拮抗菌株中，有7株具有明顯葉面防治效果。其中BF1-1、BF3-1、BF3-2、BF4-1、BF2-1對灰葡萄孢的抑制作用較好，抑制率可達(dá)50%以上。

圖1 拮抗菌株對灰葡萄孢菌離體葉片的抑菌活性Fig. 1 Aantagonistic effect of biocontrol strains againstB. cinereaon leaves

2.3 拮抗菌在離體果實上的抑制作用

從圖2和表3中可知，有7株菌具有明顯的病害防治效果，其中BF3-1、BF4-1、BF2-1和BF1-1可有效降低葡萄灰霉病的發(fā)生，抑制率達(dá)70%以上。

圖2 拮抗菌株對灰葡萄孢菌離體果實的抑菌活性Fig. 2 Antagonistic effect of biocontrol strains againstB. cinereaon fruit

表3 不同菌株對灰葡萄孢果實抑菌率Table 3 Bacterial inhibition rate of different strains on fruit ofB. cinerea

2.4 生物菌肥對葡萄灰霉病防治效果

由表4可知，BF3-1和BF4-1菌肥處理對葡萄灰霉病的田間防治效果分別達(dá)85.68%和82.07%，顯著高于水溶肥（54.35%）和腐霉利（67.30%）處理。

表4 不同處理對葡萄灰霉病的防治效果Table 4 Biocontrol effects of different treatments onB. cinerea

2.5 拮抗菌株的鑒定

2.5.1 形態(tài)學(xué)觀察 菌株BF1-1菌落呈白色，表面粗糙皺褶、邊緣不規(guī)則、直徑約為3 mm，產(chǎn)芽胞，芽胞排列呈桿狀、兩端呈圓形、單生，革蘭氏陽性，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株BF2-1菌落呈淡黃色，表面粗糙不透明、邊緣不規(guī)則，產(chǎn)芽胞，芽胞兩端鈍圓、長短不一，革蘭氏陽性，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株BF3-1菌落呈白色，表面粗糙不透明，常形成褶皺，伴有多處隆起。單個細(xì)胞（0.7～0.8）μm×（2～3）μm，著色均勻，鞭毛周生，能運動，無隔膜，革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽胞，芽胞（0.6～0.9）μm×（1.0～1.5）μm位于菌體中央或稍偏，芽胞形成后菌體不膨大，初步確定為芽胞桿菌屬。菌株BF4-1菌落似蠟燭樣顏色、近似圓形、質(zhì)地軟、無色素，菌落直徑5～7 mm，產(chǎn)芽胞，芽胞呈桿狀，芽胞中生或近中生，孢囊無明顯膨大，革蘭氏陽性，無莢膜，初步確定為芽胞桿菌屬。

2.5.2 分子鑒定 系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1分別與地衣芽胞桿菌Bacillus lincheniformis（MF871790.1）、解淀粉芽胞桿Bacillus amyloliquefaciens（MW433641.1）、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis（MW751907.1）和蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus（KC814716.1）處于同一分支，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，菌株BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1分別鑒定為地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿、枯草芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌（圖3）。

圖3 生防菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig. 3 Phylogenetic dendrogram of the biocontrol strains

3 討論

本試驗從不同地區(qū)土樣中獲得29株細(xì)菌菌株，分離、培養(yǎng)并通過平板對峙試驗篩選獲得14株具有拮抗性能的菌株。將具有拮抗性能的細(xì)菌菌株進(jìn)行離體葉片和離體果實抑制活性測定后發(fā)現(xiàn)，抑制率均在50%以上的拮抗菌有4株分別是BF1-1、BF2-1、BF3-1和BF4-1，經(jīng)菌株形態(tài)學(xué)特征以及分子生物學(xué)鑒定為地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌及蠟樣芽胞桿菌。此外，枯草芽胞桿菌BF3-1、蠟樣芽胞桿菌BF4-1在對峙培養(yǎng)試驗中均顯現(xiàn)出較強的抑制力。

有研究指出蠟樣芽胞桿菌生長繁殖能力強、分布范圍廣，可適應(yīng)較高溫度，烹飪時間短溫度不夠時不能將其完全殺死，可能會引起食物中毒等危害[13-15]，應(yīng)用安全性有待于進(jìn)一步評估。此外，解淀粉芽胞桿菌BF2-1和地衣芽胞桿菌BF1-1雖不及枯草芽胞桿菌BF3-1和蠟樣芽胞桿菌BF4-1的抑制能力強，但仍表現(xiàn)出一定的拮抗效果。荊卓瓊[10]及陳哲等[16]、柴慶凱等[17]、黃靜等[18]、羅琳等[19]利用解淀粉芽胞桿菌分別防治番茄、黃瓜、草莓及葡萄等灰霉病，并取得較好的防治效果。也有研究表明地衣芽胞桿菌的菌劑可抑制黃瓜土傳病害的發(fā)生[20-22]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，單憑拮抗菌株是無法滿足生產(chǎn)過程中的綜合需求[23,24]，故本試驗嘗試將拮抗菌株與含有微量元素的有機(jī)水溶肥配合使用，發(fā)現(xiàn)無機(jī)營養(yǎng)元素成分的添加對于拮抗菌株的生防效果無明顯的抑制作用，表明拮抗菌株與其他成分配合使用是可行的，不僅能防治植物病害的發(fā)生，還可以葉面補充植物所需的營養(yǎng)，從而減少化肥使用，改善作物的品質(zhì)，增加作物的產(chǎn)量。但本試驗中僅采用了拮抗菌株菌粉和含有微量元素的有機(jī)水溶肥復(fù)合的一種比例，而產(chǎn)生防治效果不同可能與菌粉與水溶肥比例，以及水溶肥組成成分有關(guān)，因此相關(guān)工作還需進(jìn)一步研究探討。