枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的研制

郭莊園，楊成德，金夢軍，崔凌霄，蔡鋒鋒，敖 遠(yuǎn)，魏立娟

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis是生防細(xì)菌中最重要的一種[1]，也是植物體內(nèi)常見的內(nèi)生細(xì)菌，其在提高作物抗逆性、促進(jìn)作物生長、改良作物品質(zhì)及治理農(nóng)業(yè)耕地污染等方面的應(yīng)用越來越廣泛[2,3]，對水稻[3]、小麥[4]、玉米[5]、番茄[6]、棉花[7]和蘋果[8]等植物上多種病害具有良好的防治效果。由于枯草芽胞桿菌具有生長快、營養(yǎng)需求簡單以及產(chǎn)生耐熱、抗逆芽胞等突出特征[9]，使其生產(chǎn)工藝簡單，成本較低，施用方便，儲(chǔ)存期長。因此，枯草芽胞桿菌現(xiàn)已成為一種理想的生防細(xì)菌。可濕性粉劑具有生產(chǎn)成本低，有效成分含量高，應(yīng)用范圍廣，對植物和環(huán)境安全，易儲(chǔ)運(yùn)等特點(diǎn)[10]，在已登記微生物殺菌劑劑型中占最大比例[11]，是我國微生物農(nóng)藥的主要?jiǎng)┬?，普遍?yīng)用于植物病害防治。

本試驗(yàn)中枯草芽胞桿菌 262XY2＇是從高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到的，對番茄葉斑病菌Pseudomonassyringapv.tomato、馬鈴薯枯萎病菌Fusarium avenaceum、馬鈴薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes和馬鈴薯壞疽病菌Phoma foveata等具有良好拮抗作用，且同時(shí)具有固氮、溶磷和分泌IAA的功能；發(fā)酵液在盆栽試驗(yàn)中對番茄葉斑病防治效果在60%以上[12]；固體發(fā)酵菌劑顯著增加馬鈴薯株高、根長和體內(nèi)PAL活性且對馬鈴薯炭疽病具有良好的預(yù)防和治療效果[13]，應(yīng)用潛力大[14]?；谖覈镛r(nóng)藥市場占有率不足10%的發(fā)展現(xiàn)狀[15]，因此，本試驗(yàn)以枯草芽胞桿菌262XY2＇為研究對象，通過對載體、分散劑、穩(wěn)定劑和保護(hù)劑等的篩選，并依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行了質(zhì)量檢測，為研制以枯草芽胞桿菌262XY2＇為有效成分的可濕性粉劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 枯草芽胞桿菌262XY2′是分離自東祁連山高寒草地線葉嵩草Kobresia capillifolia葉部的內(nèi)生細(xì)菌，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病原細(xì)菌及細(xì)菌多樣性實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基[16]。

1.1.3 供試試劑 載體：碳酸鈣、高嶺土、滑石粉、膨潤土、硅藻土、白炭黑、凹凸棒土、蛭石粉和海泡石粉。助劑：十二烷基苯磺酸鈉（DBS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚乙二醇（PEG8000）、木質(zhì)素磺酸鈣和羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）。穩(wěn)定劑：磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸鈣（CaCO3）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、高嶺土和甲基纖維素。紫外保護(hù)劑：糊精、抗壞血酸和黃原膠。以上試劑均為市購。

1.2 發(fā)酵液制備

1.2.1 菌種活化 將4 ℃保存的262XY2′菌種轉(zhuǎn)接到NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 種子液制備 將培養(yǎng)好的262XY2′接種到三角瓶中，裝液量50 mL/250 mL，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制得種子液備用。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將種子液以14%的接種量接入262XY2′的發(fā)酵培養(yǎng)基（3 g牛肉膏、30 g玉米淀粉、2 g CaC12、6 g酵母膏、1000 mL蒸餾水），pH 8.0，裝液量為20 mL/150 mL，32 ℃、210 r/min振蕩培養(yǎng)180 h，芽胞率達(dá)到80%以上，發(fā)酵液芽胞含量為1.55×1011cfu/mL。

1.3 載體及助劑篩選

1.3.1 載體篩選 載體吸附能力的測定：分別將5 g供試載體置于三角瓶，將發(fā)酵液緩慢加入三角瓶中，同時(shí)用玻璃棒攪拌直至載體呈液體流動(dòng)狀（不凝結(jié)成塊，放置不會(huì)析出液體），記錄添加發(fā)酵液用量 v。并計(jì)算最大吸附量H，即H= v/0.1（kg/L）。將發(fā)酵液分別與9種供試無菌載體按照7:3的比例混合均勻，鼓風(fēng)干燥箱50 ℃烘干，研磨成粉末測定其懸浮率和潤濕時(shí)間，綜合考慮懸浮率、潤濕時(shí)間、吸附容量、松散性和載體成本，選擇最優(yōu)載體。

1.3.2 母粉制備 將枯草芽胞桿菌262XY2′發(fā)酵液分別加入到無菌載體白炭黑中，每100 g載體加入483 mL發(fā)酵液，混合均勻即為母液，置于鼓風(fēng)干燥箱50 ℃干燥10～12 h，研磨制成母粉，測定其芽胞含量為6.05×1011CFU/g。

1.3.3 助劑種類及用量篩選 載體篩選基礎(chǔ)上，向母粉中分別添加10%助劑后粉碎加工成制劑，測定制劑的懸浮率和潤濕時(shí)間；根據(jù)測定結(jié)果篩選出最優(yōu)助劑。將最優(yōu)助劑用量按2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%和18%添加量與母粉混合均勻，綜合考慮懸浮率、潤濕時(shí)間及成本，篩選出復(fù)配助劑的最優(yōu)用量。

1.3.4 穩(wěn)定劑篩選 在載體、助劑篩選的基礎(chǔ)上，向母粉中分別添加 2%的穩(wěn)定劑混合制成制劑，分別熱貯（54 ℃±2 ℃）14 d后測定其芽胞含量的變化，計(jì)算芽胞存活率，以不添加穩(wěn)定劑為對照，3 次重復(fù)。

1.3.5 UV保護(hù)劑篩選 向母粉中分別添加紫外保護(hù)劑 （1%）并制成可濕性粉劑，以不添加保護(hù)劑紫外處理和不添加保護(hù)劑、紫外不處理為對照，4次重復(fù)，將其分別稀釋后涂布在平板上，在距離紫外燈（254 nm，20 W）40 cm處照射30 min后，培養(yǎng)24 h分別測定芽胞存活率。通過比較UV照射前后芽胞含量篩選UV保護(hù)劑。

1.4 制劑加工工藝

將枯草芽胞桿菌262XY2′發(fā)酵液按載體與助劑優(yōu)化后的配比同時(shí)混合、攪拌，后在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中持續(xù)烘干10～12 h，經(jīng)粉碎機(jī)進(jìn)行超微粉碎，制成可濕性粉劑。

1.5 枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑質(zhì)量檢測

按照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》對枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑進(jìn)行測定。

（1）芽胞含量：參考國家標(biāo)準(zhǔn)NY /T 2293. 1-2012。

（2）懸浮率：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB /T 14825-2006農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率的測定方法。

（3）潤濕時(shí)間：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5451-2001標(biāo)準(zhǔn)測定。

（4）細(xì)度：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB /T 16150-1995農(nóng)藥可濕性粉劑細(xì)度測定。

（5）熱貯穩(wěn)定性：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19136-2003測定。

（6）芽胞存活率：將樣品于85 ℃水浴鍋中水浴10 min，冷卻至室溫，取0.1 mL涂布平板計(jì)算芽胞數(shù)，重復(fù)3次，采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定處理前后制劑中的芽胞含量；芽胞存活率（%）=（處理后芽胞含量/處理前芽胞含量）×100，計(jì)算平均芽胞存活率。

（7）pH測定：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB /T1601-93 農(nóng)藥pH的測定方法。

（8）制劑貯藏穩(wěn)定性測定：取100 g芽胞桿菌可濕性粉劑置于室溫（25 ℃）條件下貯藏，每30 d測定芽胞含量1次，重復(fù)3次，測定時(shí)長180 d，確定制劑貯藏180 d期間芽胞含量變化。

（9）貨架期測定：將可濕性粉劑分裝在自封袋中，于4 ℃條件下存放6個(gè)月，每個(gè)月取樣1次，3次重復(fù)，采用平板涂布法測定菌劑中的活菌數(shù)。

1.6 室內(nèi)盆栽防效測定

先將262XY2′枯草芽胞桿菌可濕性粉劑，有效成分為母粉87%（每100 g白炭黑加入48.3 mL的發(fā)酵液）、十二烷基硫酸鈉10%、磷酸二氫鉀2%和抗壞血酸1%，稀釋1000倍（活菌數(shù)為2.19×107cfu/g）均勻噴施于番茄葉面至全部潤濕（每株需50 mL），待葉面藥液自然風(fēng)干24 h后，將經(jīng)LB搖瓶液體培養(yǎng)24 h后的番茄丁香假單胞葉斑病菌（病原菌）菌懸液稀釋10倍使其活菌數(shù)達(dá)到1.0×108cfu/mL，通過致傷接種法接種于健康的番茄植株葉片上，每處理3次重復(fù)，以清水處理為空白對照，保濕一周后觀察發(fā)病情況，每盆選取15片葉進(jìn)行調(diào)查，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)及262XY2′枯草芽胞桿菌可濕性粉劑對番茄細(xì)菌性葉斑病的防治效果，病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。番茄細(xì)菌性葉斑病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)參照馮中紅[12]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體篩選

白炭黑的吸附容量最大，為4.83 L/kg，其次為蛭石粉，為3.63 L/kg，白炭黑的懸浮率達(dá)91.48%，達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（≥70%）（表1）。因此，選擇白炭黑作為262XY2′可濕性粉劑的載體。

表1 載體的篩選Table 1 Screening of carriers

2.2 助劑篩選

結(jié)果表明，十二烷基硫酸鈉的懸浮率最高，為94.07%，其次是羧甲基纖維素鈉，為93.70%；拉開粉的潤濕時(shí)間最短為27.40 s，其次是十二烷基硫酸鈉，為34.40 s，但拉開粉的懸浮率較低，為82.96%；活菌數(shù)除了十二烷基苯磺酸鈉和三聚磷酸鈉外，均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，并且活菌數(shù)最高的為木質(zhì)素磺酸鈉，達(dá)6.70×1010cfu/g，其次為十二烷基硫酸鈉，達(dá)2.68×1010cfu/g，結(jié)合懸浮性和潤濕性，選擇十二烷基硫酸鈉為助劑（表2）。

表2 助劑的篩選Table 2 Screening of additives

2.3 助劑用量優(yōu)化

助劑用量為12%時(shí)，懸浮率最高，達(dá)94.81%；其次助劑用量為8%和10%的懸浮率均為94.07%，但助劑用量為10%時(shí)，潤濕時(shí)間最短，為37.80 s，根據(jù)制劑成本和質(zhì)量確定助劑用量為10%（表3）。

表3 助劑用量的篩選Table 3 Screening of auxiliary dosage

2.4 穩(wěn)定劑篩選

如表4所示，磷酸二氫鉀熱儲(chǔ)后的芽胞含量最高，并且其熱儲(chǔ)分解率最低為39.56%，而未加保護(hù)劑的對照熱儲(chǔ)分解率高達(dá)78.08%，說明磷酸二氫鉀為枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的最優(yōu)穩(wěn)定劑。

表4 穩(wěn)定劑的篩選Table 4 Screening of stabilizers

2.5 紫外保護(hù)劑篩選

如表5所示，以抗壞血酸為紫外保護(hù)劑時(shí)，經(jīng)紫外處理后的芽胞存活率達(dá)72.08%，均高于黃原膠38.89%和糊精40.60%，故確定抗壞血酸為枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑最優(yōu)保護(hù)劑。

表5 紫外保護(hù)劑的篩選Table 5 Screening of ultraviolet protectants

2.6 質(zhì)量檢測

如表6所示，通過對枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的細(xì)度、潤濕時(shí)間、懸浮率、干燥減量、pH值、芽胞含量及雜菌率等主要性能指標(biāo)的檢測，可知各項(xiàng)指標(biāo)均符合農(nóng)藥可濕性粉劑的國家標(biāo)準(zhǔn)，說明該菌劑合格，可以用于病害的防治。

表6 枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑質(zhì)量檢測Table 6 Quality inspection ofB.subtilis262XY2' wettable powder formulation

2.7 室內(nèi)盆栽防效測定

如表7所示，枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑稀釋1000倍（2.19×107cfu/g）的室內(nèi)盆栽防治效果達(dá)到64%，可用于番茄細(xì)菌性葉斑病的防治。

表7 枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑對番茄細(xì)菌性葉斑病的盆栽防效結(jié)果Table 7 Control effect ofB.subtilis262XY2' wettable powder formulation on tomato bacterial leaf spot in pot trial

3 討論

可濕性粉劑是我國微生物制劑的主要?jiǎng)┬蚚17,18]，因其具有生產(chǎn)成本低，有效成分含量高，易于貯運(yùn)等特點(diǎn)，在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用?？蓾裥苑蹌┲休d體所占比例最大，對可濕性粉劑的性能影響也最大，所以最佳載體的篩選是可濕性粉劑研制過程中最為關(guān)鍵的一步。由于原藥為液態(tài)的發(fā)酵液，需要選擇吸附容量高的載體，白炭黑質(zhì)地疏松，因其吸附容量和懸浮率高，同時(shí)研究結(jié)果顯示白炭黑較其他載體性能好，因此選擇白炭黑為制劑載體，與丁宇倩等[19]的結(jié)果一致。

懸浮率和潤濕時(shí)間是評價(jià)農(nóng)藥可濕性粉劑質(zhì)量的重要指標(biāo)[20]，直接影響菌劑混合操作的便利性和混合后的均一穩(wěn)定性。潤濕劑可以減小可濕性粉劑的表面張力從而增加其潤濕性，分散劑能夠以低成本的方式增加其懸浮性[21]。本試驗(yàn)中可濕性粉劑芽胞含量為2.19×1010cfu/g，懸浮率為83.7%，潤濕時(shí)間為23.8 s，以上3項(xiàng)主要指標(biāo)均優(yōu)于文獻(xiàn)[22]報(bào)道的枯草芽胞桿菌B1514可濕性粉劑的芽胞含量為1.70×109cfu/g、懸浮率為72%和潤濕時(shí)間為135 s。

為了保證制劑在較長時(shí)間內(nèi)芽胞含量的穩(wěn)定[23]以及降低實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中紫外線對芽胞產(chǎn)生的影響[24]。李舒雯等[23]報(bào)道羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí), 熱貯后芽胞存活率高達(dá)54%。本試驗(yàn)中，羧甲基纖維素鈉作為穩(wěn)定劑時(shí)，其芽胞存活率僅為27.29%，而磷酸二氫鉀作為保護(hù)劑時(shí)，芽胞存活率高達(dá)60.44%，即選擇磷酸二氫鉀為 262XY2′的穩(wěn)定劑，這與李磊等[25]的研究結(jié)果一致。張正一等[26]報(bào)道抗壞血酸用于菌劑的紫外保護(hù)劑時(shí)能夠有效降低紫外線對哈茨木霉菌的影響，本研究也取得相似的研究結(jié)果。

本研究通過對載體、助劑、穩(wěn)定劑和紫外保護(hù)劑的篩選，確定了枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑的最佳配方：母粉87%（每100 g白炭黑加入48.3 mL的發(fā)酵液），十二烷基硫酸鈉10%、磷酸二氫鉀2%和抗壞血酸1%。在此條件下制得的枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑懸浮率為83.7%，潤濕時(shí)間為23.8 s，活菌數(shù)為219億cfu/g，且在細(xì)度、潤濕時(shí)間、懸浮率、干燥減量、pH值、芽胞含量及雜菌率等指標(biāo)均符合可濕性粉劑及微生物制劑的國家標(biāo)準(zhǔn)，盆栽防治效果達(dá)到64%，可用于番茄細(xì)菌性葉斑病的防治。該研究結(jié)果為枯草芽胞桿菌262XY2′可濕性粉劑研制提供了技術(shù)支撐，也為其他微生物菌劑的研制提供了參考。