小菜蛾Btk抗性品系對四種Bt殺蟲晶體蛋白抗性發(fā)展的研究

符 偉，唐 濤，王 培，王 勇，尹 麗，馬明勇，張政兵*

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，長沙 410125；2. 湖南省植保植檢站，長沙 410005）

小菜蛾P(guān)lutella xylostella(L.)是十字花科作物上一種世界性重要害蟲[1]，全世界每年用于防治小菜蛾的費用高達40～50億美元[2,3]。目前，我國對小菜蛾的控制策略仍以化學(xué)防治為主。然而，化學(xué)農(nóng)藥的大量連續(xù)使用，導(dǎo)致其對化學(xué)藥劑的抗性水平上升，而與之相應(yīng)的是田間防治效果逐漸下降[4]。因此，用以蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為代表的生物農(nóng)藥防治小菜蛾近年來日益受到關(guān)注和應(yīng)用。

蘇云金芽胞桿菌是一種從土壤或死亡昆蟲體內(nèi)分離出來的革蘭氏陽性細菌。它在芽胞形成時期產(chǎn)生一種或多種殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），可對鱗翅目等多種昆蟲產(chǎn)生毒殺活性[5]。在Bt制劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物的應(yīng)用與推廣之初，不僅對田間害蟲的有效控制成績斐然；同時有利于提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，且減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用頻次與使用量，從而對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護發(fā)揮了積極的作用[6]。然而，隨著時間的推移及廣泛應(yīng)用，部分害蟲已對Bt產(chǎn)生了一定程度的抗藥性。Tabashnik等[7]在長期使用Bt制劑的美國夏威夷田間首次發(fā)現(xiàn)小菜蛾對Bt 制劑產(chǎn)生抗藥性。戴承鏞等[8]首次報道了我國部分地區(qū)小菜蛾對Bt制劑的抗藥性問題，其中華南地區(qū)（廣州及深圳一帶）對Bt制劑的抗性比揚州地區(qū)高10～25倍，而泰國曼谷地區(qū)的抗性又比華南地區(qū)高40%左右。Pardo-Lopez等[9]總結(jié)了Bt Cry毒素在鱗翅目昆蟲中產(chǎn)生抗藥性的多種機理，特別值得注意的是一種昆蟲可能形成一套抗性機制對同種或是不同種Cry毒素都產(chǎn)生抗性。

蘇云金芽胞桿菌的不同殺蟲晶體蛋白由不同種類的Cry基因控制，而不同種類的Cry殺蟲晶體蛋白對小菜蛾的殺蟲活性不一致，而且在 Bt殺蟲晶體蛋白的選擇壓力下，其抗性發(fā)展亦有所差別。王崇利等[10]報道廣東惠州小菜蛾田間種群對Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的抗藥性達到高抗水平，但對Cry1Aa 和Cry2Aa仍然保持較高的敏感性。目前，用于防治小菜蛾的Bt菌株主要為庫斯塔克亞種（Bt var.kurstaki，Btk），大多數(shù)含有對鱗翅目害蟲有特異殺蟲活性的Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac，其中Cry1Ac是殺蟲毒力最高的基因[11]。已有研究表明，基因疊加策略可為害蟲 Bt抗性治理策略提供新途徑，即利用無交互抗性的殺蟲晶體蛋白組合來拓寬與增強轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲譜，從而使得靶標害蟲極難對轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性[12]。

小菜蛾田間種群對 Bt制劑及不同殺蟲晶體蛋白抗性水平屢有報道，但田間害蟲產(chǎn)生抗性影響因素較為復(fù)雜。為此，本研究中使用Btk制劑汰選獲得小菜蛾抗性品系（F80代和F100代），采用葉片浸漬法測定了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca殺蟲晶體蛋白對小菜蛾抗性品系的室內(nèi)毒力，旨在明確主效基因為Cry1Ac的Btk制劑選擇壓力下小菜蛾對Cry1Ac的抗性發(fā)展趨勢，以及與其他Cry1類殺蟲晶體是否存在交互抗性，從而為Bt多價殺蟲晶體蛋白的應(yīng)用與小菜蛾的抗性治理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

小菜蛾相對敏感品系（SS）：將2003年采自廣州的田間品系于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)用無蟲甘藍苗繼代飼養(yǎng)，期間未接觸任何殺蟲劑。小菜蛾Btk抗性品系：該種群由2005年采自上海市郊的甘藍種植田間的小菜蛾蛹和幼蟲建立的，隨后采用Btk可濕性粉劑浸漬甘藍苗葉片后喂食小菜蛾，連續(xù)汰選80代和100代后，分別獲得F80代和F100代供試試蟲，二者對Btk的抗性倍數(shù)分別大約為1800倍和1900倍。

1.2 供試藥劑

蘇云金芽胞桿菌庫斯塔克亞種可濕性粉劑由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院Bt研究開發(fā)中心提供，效價為16000 IU/mg，屬Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki。Cry1Ac原毒素從Bt標準菌株HD-1中提取獲得，消化后的Cry1Ab、Cry1Ah及Cry1Ca原毒素由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，用牛清蛋白BSA結(jié)合SDS-PAGE進行Bradford定量，存儲于-80 ℃待用[13]。

1.3 室內(nèi)毒力測定

參照Tabashnik和Cushing[14]的葉片浸漬飼喂法。先進行預(yù)備試驗，然后根據(jù)預(yù)備試驗的結(jié)果，以校正死亡率在10%～90%的濃度范圍作為正式試驗的濃度范圍。先用0.1% TritonX-100水溶液稀釋藥劑，按等比級數(shù)稀釋法，順次配制成5～7個系列濃度，以0.1% TritonX-100水溶液作為對照。將直徑為5 cm的新鮮甘藍苗嫩葉蝶在系列濃度的藥液中浸10 s，自然晾干后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿（底部鋪一層浸過適量蒸餾水的濾紙片用于保濕）中。每皿接入10頭3齡初期幼蟲，每處理4次重復(fù)。然后，將其置于培養(yǎng)箱中，溫度（25±1）℃，光周期16L∶8D，相對濕度70%，72 h后檢查幼蟲死亡數(shù)。最后，用Abbott公式計算各處理的校正死亡率，并運用DPS軟件計算供試藥劑的LC50值、95%置信限、毒力回歸方程（y＝a＋bx）相關(guān)系數(shù)及卡方值。抗性倍數(shù)（resistance ratio，RR）＝抗性品系的LC50/相對敏感品系的LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小菜蛾相對敏感品系的室內(nèi)毒力

Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ca對小菜蛾相對敏感品系有較好的殺蟲活性，其中以Cry1Ac最好，LC50為0.71 mg/L；Cry1Ah的活性較差，LC50高達40.03 mg/L（表1）。

表1 四種Bt殺蟲晶體蛋白對小菜蛾敏感品系的室內(nèi)毒力Table 1 Toxictiy of four Bt-insecticidal crystal proteins against Bt-susceptible strain ofP. xylostella

2.2 對小菜蛾Btk抗性品系的室內(nèi)毒力

不同Bt殺蟲晶體蛋白對Btk抗性種群毒力有較大的差異。Cry1Ca對F80代及F100代抗性品系的活性均最高，LC50約12.07～21.37 mg/L。Cry1Ac對F80代的活性中等（LC50為47.75 mg/L），而對F100代的活性較低（LC50為75.72 mg/L）。Cry1Ab對F80代的活性最低（LC50為65.43 mg/L）而對F100代的活性較低（LC50為72.18 mg/L）。Cry1Ah對F80代及F100代的活性均低，LC50約65.21～100.18 mg/L（表2）。

表2 四種Bt殺蟲晶體蛋白對小菜蛾Btk抗性品系的室內(nèi)毒力Table 2 Toxicity of four Bt-insecticidal crystal proteins against Bt-resistant strain ofP. xylostella

2.3 小菜蛾Btk抗性品系對四種殺蟲晶體蛋白的抗性發(fā)展規(guī)律

經(jīng)Btk制劑汰選80至100代后，小菜蛾Btk抗性品系對Cry1Ac的抗性發(fā)展較快，其抗性倍數(shù)高達67.3～106.8倍；對Cry1Ab的抗性發(fā)展速度次之，其抗性倍數(shù)達60.0～66.1倍；對Cry1Ca和Cry1Ah的抗性發(fā)展緩慢，其抗性倍數(shù)分別為3.3～6.0倍和1.6～2.5倍（圖1）。

圖1 小菜蛾Btk抗性品系對四種Bt殺蟲晶體蛋白的抗性演變Fig. 1 The resistance development of four insecticidal crystal proteins in the Bt-resistant strain ofP. xylostella

3 討論

1986年，Halpin[15]首次發(fā)現(xiàn)美國夏威夷長期使用Bt制劑的田間小菜蛾已對Bt制劑產(chǎn)生了抗藥性。迄今為止，全世界已有美國、巴西、中國、馬來西亞、菲律賓及日本等地相繼報道小菜蛾對Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2B、Cry1Ca和 Cry1Da等Bt殺蟲晶體蛋白存在不同程度的抗藥性[16]。研究表明，小菜蛾不僅在田間表現(xiàn)出對Bt殺蟲晶體蛋白的抗藥性，而且在室內(nèi)可通過藥劑篩選表現(xiàn)出較高的抗性水平。Guo等[17]在室內(nèi)分別用Cry1Ac殺蟲晶體蛋白和Btk制劑繼代汰選獲得SZ-R及SH-R品系小菜蛾，其抗性倍數(shù)依次高達450倍和1900倍。本研究結(jié)果表明，在主效基因為Cry1Ac的Btk制劑的連續(xù)汰選壓力下，小菜蛾對Cry1Ac的抗性上升速度最快，并且對Cry1Ab產(chǎn)生較高的交互抗性，對Cry1Ah和Cry1Ca的抗性發(fā)展較慢。因此，為延緩小菜蛾對Bt抗性的產(chǎn)生與發(fā)展，應(yīng)設(shè)法減小選擇壓力，以保護小菜蛾對Bt的敏感性。

不同Bt殺蟲晶體蛋白的組合混用亦是抗性治理的重要策略之一[18]。該策略既可應(yīng)用于傳統(tǒng)的Bt制劑加工及后期的施用，又可用于轉(zhuǎn)基因植物的選育與應(yīng)用。如Cao等[19]將Cry1Ac和Cry1C同時導(dǎo)入青花菜中，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)雙價基因的青花菜比轉(zhuǎn)單價的青花菜具有更好的殺蟲效果，且前者對抗Cry1Ac和Cry1C殺蟲晶體蛋白的小菜蛾均有毒殺作用。然而，小菜蛾對不同的Bt殺蟲晶體蛋白可能存在交互抗性。為此，僅僅簡單地將不同Bt殺蟲晶體蛋白混用，則難以達到抗性治理的最佳效果，而是在混用前必須針對Bt殺蟲晶體蛋白的交互抗性進行充分研究。