鉤狀木霉菌的生物學(xué)特性及對腐皮鐮刀菌的抑菌機(jī)理研究

胡 嫻，陳宸彤，謝楊鋆，何 珊，史紅安，張志林，白翠華*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510630；2.湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，孝感 432000）

木霉菌Trichodermaspp.，世界性分布的真菌，主要分布于土壤、腐爛木材和根圍中[1,2]，具有適應(yīng)強(qiáng)、代謝物質(zhì)多樣、寄主廣泛等特點(diǎn)[3]，對植物病原真菌拮抗性強(qiáng)，以及較高的促進(jìn)植物生長和防御等作用，在土壤修復(fù)、病害防治、促進(jìn)植物生長等方面得到廣泛應(yīng)用[4-7]。由于化學(xué)農(nóng)藥在植物病害防治中的過度使用，引發(fā)人畜中毒、高殘留、環(huán)境污染等問題，而木霉菌具有來源廣泛、無污染等特點(diǎn)[8]，已成為植物病害防治中最具開發(fā)潛力的防治方法之一。

自Weindling[9]發(fā)現(xiàn)木霉菌寄生于病原微生物后，研究發(fā)現(xiàn)木霉菌能通過營養(yǎng)和空間的競爭、重寄生和代謝過程中產(chǎn)生化學(xué)物質(zhì)抑制病原菌的生長，在植物病害防治方面越來越被重視[10]。木霉菌對病原菌的拮抗作用易受光照、溫度、pH值、微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)等因子的影響[11-13]。鉤狀木霉菌Trichodermahamatum被廣泛應(yīng)用于植物病害的防治中，其代謝產(chǎn)物對多種植物病害具有良好的防治效果[14]，而目前對鉤狀木霉菌的生物學(xué)特性、發(fā)酵液活性成分的提取和抑菌機(jī)理研究較少。本研究從蘭花根部分離出的一株木霉菌，對腐皮鐮刀菌具有良好的拮抗作用，并進(jìn)一步研究了該菌株發(fā)酵液不同有機(jī)溶劑提取物對腐皮鐮刀菌抑菌效果和作用機(jī)理，同時(shí)還系統(tǒng)地探討了生長因子對該木霉菌菌落生長的影響，以期為其在生產(chǎn)上更好應(yīng)用于腐皮鐮刀菌引起的土傳病害防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病原菌：腐皮鐮刀菌Fusariumsolani為湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、查氏培養(yǎng)基（Gzapek）、玉米粉培養(yǎng)基（MSA）、胡蘿卜蔗糖培養(yǎng)基（CSA）和PDA+維生素B (VB)培養(yǎng)基。

供試藥品：引物和PCR擴(kuò)增試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司，升汞、半乳糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇、淀粉、幾丁質(zhì)、甘氨酸、賴氨酸、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、乙醚、乙酸丁酯、乙二酸二乙醚和維生素B (VB)等均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

供試儀器：SPX-25085H-II生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；PowerPac Basic電泳儀(上海珂淮儀器有限公司)；ND2000C微量蛋白質(zhì)核酸分光光度計(jì)（Thermo，美國）；Gray-96G PCR儀（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；Sigma3K15高速冷凍臺式離心機(jī)（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；THZ-82B氣浴恒溫振蕩器（常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠）；Ti-S倒置熒光顯微鏡（Nikon，日本）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木霉菌的采集、分離與純化 木霉菌株樣品采自湖北大悟蘭花植株樣品，取新鮮的蘭花根部，用無菌水沖洗干凈后，依據(jù)溫晨陽等[15]內(nèi)生菌分離方法略做修改，在PDA培養(yǎng)基平板上對蘭花根部組織進(jìn)行分離獲得菌種，待菌長出后，取邊緣少許菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，重復(fù)3次后，將獲得的菌株命名為LAN2B-1。

1.2.2 菌株LAN2B-1的鑒定 挑少許純化后的菌絲接種于均勻涂布PDA培養(yǎng)基的載玻片上，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲和孢子形態(tài)，并結(jié)合培養(yǎng)性狀及其相關(guān)真菌分類資料進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

將分離純化菌株LAN2B-1菌絲收集研磨后，采用SDS法[16]提取DNA，利用ITS4和ITS5進(jìn)行PCR擴(kuò)增菌株ITS序列，真菌通用引物序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAA-3′，反應(yīng)液引物ITS4和ITS5各0.5 μL、2×PCR master 25 μL（PCR擴(kuò)增體系），供試菌株的DNA模板1 μL，ddH2O 23 μL，反應(yīng)總體系為50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；52 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min，共設(shè)30個(gè)循環(huán)；后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中已知序列比對，確定分離菌株分類地位，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

1.2.3 菌株LAN2B-1生物學(xué)特性 將直徑為6 mm的新鮮菌餅分別接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、查氏培養(yǎng)基（Gzapek）、玉米粉培養(yǎng)基（MSA）、胡蘿卜蔗糖培養(yǎng)基（CSA）和PDA+VB培養(yǎng)基中，置25 ℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

將等量的甘氨酸、賴氨酸、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏加入培養(yǎng)基中配成不同氮源的 PDA培養(yǎng)基，以PDA培養(yǎng)基為對照，將直徑為6 mm的新鮮菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置25 ℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

將等量半乳糖、蔗糖、乳糖、肌醇、甘露醇、淀粉、幾丁質(zhì)替換 PDA培養(yǎng)基中葡萄糖，配成不同碳源的PDA培養(yǎng)基，以無糖做對照，將直徑為6 mm的新鮮菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置25 ℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同溫度試驗(yàn) 將直徑為6 mm的新鮮菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板上，分別置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8、9、10、11后，將直徑為6 mm的新鮮菌餅分別接種于不同pH值的PDA培養(yǎng)基平板上，置25 ℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

將直徑為6 mm的新鮮菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板上，分別在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、光照黑暗交替（12D:12L）的3種光照條件下25 ℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 菌株LAN2B-1代謝產(chǎn)物對腐皮鐮刀菌的抑制作用 采用玻璃紙法，將滅菌的玻璃紙平鋪于PDA培養(yǎng)基上后，將直徑為6 mm的新鮮菌株LAN2B-1菌餅接種于玻璃紙上，待菌株LAN2B-1菌絲長滿平板前，揭去玻璃紙，接種直徑為6 mm腐皮鐮刀菌新鮮菌塊，以未接菌株LAN2B-1菌餅的PDA培養(yǎng)基為空白對照，3次重復(fù)，25 ℃條件下培養(yǎng)7 d后測菌落直徑，計(jì)算抑制率，抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.6 菌株LAN2B-1發(fā)酵液提取物對腐皮鐮刀菌的抑菌作用 在300 mL PDA液體培養(yǎng)基中加入6個(gè)菌株LAN2B-1菌餅（直徑為6 mm）后，于25 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，過濾后得到發(fā)酵液，以正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、乙醚、乙酸丁酯、乙二酸二乙醚為萃取劑，按發(fā)酵液:萃取劑（V/V）=1:3常溫下萃取，靜至24 h后分液去除無機(jī)相，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)相[15]，重復(fù)3～4次后，合并萃取后的有機(jī)相減壓濃縮，200 mL發(fā)酵液提取物加入10 mL甲醇溶解，取5 mL甲醇溶解液加入100 mL PDA液體培養(yǎng)基中搖勻，制成平板，接種直徑為6 mm腐皮鐮刀菌新鮮菌塊，以每100 mL PDA液體培養(yǎng)基中加入5 mL甲醇做空白對照，計(jì)算抑菌率。

1.2.7 菌株LAN2B-1發(fā)酵液對腐皮鐮刀菌菌絲可溶性蛋白、還原糖含量的影響 分別采用考馬斯亮藍(lán)法[17]測定菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量和DNS法[17]測定菌絲體內(nèi)還原糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

文中數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件中單因素方差分析，差異顯著性分析采用Duncan’s法，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LAN2B-1的形態(tài)觀察

木霉菌株LAN2B-1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后菌落呈白色絨狀，48 h后菌落開始形成綠色分生孢子，產(chǎn)孢區(qū)平展，呈同心輪紋狀排列，產(chǎn)孢簇表面為顆粒狀或粉狀，菌株具有微弱土腥味，產(chǎn)孢簇初為水綠色，后轉(zhuǎn)為黑綠色，無色素分泌（圖1A，B）。菌絲呈白色透明狀，木霉瓶梗短、基部細(xì)長、中間膨大，頂部變細(xì)，常 2～5個(gè)輪生；孢子梗叢束稀疏，環(huán)狀排列，主分枝呈樹狀分枝，主軸直，偶有彎曲，次級分枝較多，常2～3個(gè)一組，成直角伸出；分生孢子呈球形，倒卵形或短橢圓形，大小為（2.1～3.2）μm×（2.3～4.0）μm（圖1C）。依據(jù)木霉菌菌株LAN2B-1的形態(tài)特征和培養(yǎng)特性，初步推斷其為鉤狀木霉菌。

圖1 菌株LAN2B-1的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphology of LAN2B-1

2.2 菌株LAN2B-1分子生物學(xué)鑒定

利用真菌ITS4/ITS5對菌株LAN2B-1 16S rDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到600 bp的片段，將其與已在NCBI上登記的19種木霉菌的ITS序列進(jìn)行比對（圖2），發(fā)現(xiàn)LAN2B-1菌株與鉤狀木霉菌的相似性為99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)菌株LAN2B-1與鉤狀木霉菌位Z48816.1位于系統(tǒng)發(fā)育樹同一支，聚為一類，結(jié)合菌落形態(tài)特征以及分子生物學(xué)鑒定該菌株為鉤狀木霉菌。

圖2 菌株LAN2B-1 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of strain 16S rDNA of LAN2B-1

2.3 鉤狀木霉菌LAN2B-1生物學(xué)特性

不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響：在 PDA、查氏培養(yǎng)基（Gzapek）、玉米粉培養(yǎng)基（MSA）、胡蘿卜蔗糖培養(yǎng)基（CSA）和 PDA+VB培養(yǎng)基上菌落均能正常生長。在 PDA培養(yǎng)基上菌落生長最快，其次為PDA+VB，生長48 h后顯著高于其他三種培養(yǎng)基（圖3A）。

不同氮源對菌落生長的影響：以甘氨酸作為氮源的 PDA培養(yǎng)基上菌落生長優(yōu)于對照，但不存在顯著差異，其次為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作為氮源的PDA培養(yǎng)基（圖3B）。

不同碳源對菌落生長的影響：菌落在以甘露醇和肌醇作為碳源的 PDA培養(yǎng)基上生長最快，菌落在以蔗糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖作為碳源的 PDA培養(yǎng)基上生長速度與對照培養(yǎng)無顯著差異，而菌落在以幾丁質(zhì)和淀粉作為碳源的PDA培養(yǎng)基明上的菌落直徑顯著低于對照（圖3C）。

不同pH值對菌落生長的影響：在pH為3～11之間菌落均能正常生長，最適生長pH為4～5，隨著pH值的增大，菌落直徑呈下降趨勢（圖3D）。

不同溫度對菌落生長的影響：25 ℃～30 ℃為菌落最佳生長溫度，菌落生長速率最快，15 ℃條件下菌落生長較為緩慢，35 ℃條件下菌落不能正常生長（圖3E）。

不同光照處理對菌落生長的影響：在連續(xù)暗條件下菌落生長速度最快，達(dá)到61.06%，顯著高于全光照和光照黑暗交替條件下菌落生長速度（圖3F）。

圖3 鉤狀木霉菌菌株LAN2B-1的生物學(xué)特性Fig.3 Biological characteristics of T.hamatum LAN2B-1

2.4 鉤狀木霉菌LAN2B-1代謝產(chǎn)物對腐皮鐮刀菌抑制作用

利用玻璃紙法檢測了鉤狀木霉菌 LAN2B-1代謝產(chǎn)物對腐皮鐮刀菌的抑制作用結(jié)果表明，鉤狀木霉菌LAN2B-1代謝產(chǎn)物對腐皮鐮刀菌的抑制率為45.59%（圖4）。

圖4 鉤狀木霉菌菌株LAN2B-1對腐皮鐮刀菌的拮抗作用Fig.4 Antagonistic effect of T.hamatum LAN2B-1 against F.solani

2.5 鉤狀木霉菌LAN2B-1發(fā)酵液對腐皮鐮刀菌抑菌活性

比較了7種鉤狀木霉菌LAN2B-1發(fā)酵液有機(jī)溶劑提取物對腐皮鐮刀菌的抑菌效果，其中氯仿發(fā)酵液提取物抑菌率最高，為59.38%，其次分別為乙二酸二乙醚、乙醚和乙酸丁酯發(fā)酵液提取物，抑菌率分別為52.68%、49.26%和42.52%，而正己烷、正丁醇和乙酸乙酯發(fā)酵液提取物對腐皮鐮刀菌均無抑菌活性（表1）。

表1 鉤狀木霉菌菌株LAN2B-1發(fā)酵液不同萃取劑提取物對腐皮鐮刀菌的抑制作用Table 1 The inhibitory rate of active substance from fermentation broth of T.hamatum LAN2B-1 by different extractants on F.solani

2.6 腐皮鐮刀菌菌絲可溶性蛋白、還原糖含量測定

經(jīng)鉤狀木霉菌發(fā)酵液處理后，腐皮鐮刀菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量均顯著降低，且含量隨木霉菌發(fā)酵液濃度的升高而下降，鐮刀菌菌絲體內(nèi)還原糖含量隨木霉菌發(fā)酵液濃度的升高而下降；當(dāng)鉤狀木霉菌發(fā)酵液濃度為400 μg/mL時(shí)，可溶性蛋白含量最低為0.0215 mg/g，還原糖含量最低為0.1605 mg/g，均顯著低于對照處理（表2）。

表2 鉤狀木霉菌菌株LAN2B-1發(fā)酵液對腐皮鐮刀菌菌絲可溶性蛋白、還原糖含量的影響Table 2 Effect of fermentation broth of T.hamatum LAN2B-1 on soluble protein and reducing sugar content of F.solani

3 討論

木霉菌為應(yīng)用廣泛的生防菌之一，具有土壤修復(fù)[6]、解磷[18,19]、促進(jìn)植物生長[20]和防治植物病害[21]等作用，可作為高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的原材料和富有成果的資源應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[22,23]。本研究確定菌株LAN2B-1為鉤狀木霉菌，在pH值為4～5、溫度25 ℃～30 ℃時(shí)菌落生長最佳，這與王暉等[24]報(bào)道鉤狀木霉菌Th12最適發(fā)酵條件為25 ℃、起始pH值6的結(jié)論基本相似。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)鉤狀木霉菌具有較強(qiáng)的酸堿和氮源適應(yīng)性的特點(diǎn)，表明該菌株具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，能用于較多逆境條件下腐皮鐮刀菌引起的土傳病害的防治。

目前，木霉菌已廣泛應(yīng)用于鐮刀菌的防治中，如張麗榮等[25]分離得到22株木霉，其中6株木霉菌對西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.niveum抑菌率均大于76.92%。本研究發(fā)現(xiàn)鉤狀木霉菌代謝產(chǎn)物對腐皮鐮刀菌具有一定的抑制作用，抑菌率為45.59%，發(fā)酵液氯仿提取物對腐皮鐮刀菌的抑菌率為59.38%。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌代謝產(chǎn)物抑菌活性成分主要為酸類和酮類[26]；魏琳等[27]采用系統(tǒng)溶劑法對哈茨木霉TrichodermaharzianumTUV-13分生孢子發(fā)酵液提取時(shí)，發(fā)現(xiàn)氯仿是木霉菌水稻體外模擬培養(yǎng)物有效物質(zhì)提取的最適溶劑，其提取物主要包含烷烴、有機(jī)酸類、酯類、酮類、類固醇類等有機(jī)化合物。因此，推測氯仿提取物中可能含有大量酸類和酮類可增加其抑菌活性，但有機(jī)物對鉤狀木霉菌發(fā)酵液活性成分提取的影響有待于進(jìn)一步的研究。

蛋白質(zhì)是菌絲細(xì)胞維持正常生命活動所需的基本物質(zhì)，而還原糖是菌絲細(xì)胞正常生理代謝所需的能量來源和物質(zhì)基礎(chǔ)[28,29]，菌絲體蛋白質(zhì)和還原糖含量的減少，會使菌絲生長受到影響[17]。鉤狀木霉菌株發(fā)酵液處理后的腐皮鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和還原糖的含量均隨鉤狀木霉發(fā)酵液含量的增加而降低，表明鉤狀木霉菌發(fā)酵液能促進(jìn)鐮刀菌菌體細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白流失和還原糖的分解，擾亂菌體的生理代謝，從而導(dǎo)致菌體死亡。

不同的環(huán)境因子對木霉菌抑菌效果影響較大，因此在生產(chǎn)上利用木霉菌防治土傳病害時(shí)，需要對微生物生長環(huán)境進(jìn)行評估，以便選擇適當(dāng)?shù)木N，確保在病害防治過程中取得更好的防治效果。本研究探索了鉤狀木霉菌生物學(xué)特性和對腐皮鐮刀菌的抑菌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)鉤狀木霉菌具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，且對腐皮鐮刀菌引起土傳病害具有良好的防效，為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展及優(yōu)良微生物菌株資源利用提供了參考價(jià)值。