意大利蝗越冬卵抗寒物質(zhì)分析

宋 余，黃偉偉，趙 娜，蔣思涵，扈鴻霞，丁國嬋，季 榮*，葉小芳*

（1.中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心/新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室/新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830054；2.新疆瑪納斯縣蝗蟲鼠害預(yù)測預(yù)報防治站，瑪納斯 832200）

耐寒性是指昆蟲在低溫條件下的生存能力，對昆蟲的分布和生存具有重要意義[1]。昆蟲生活史中不同時期的耐寒性不同，一般來說，越冬期耐寒性最強(qiáng)，滯育期次之，發(fā)育期耐寒性最弱[2]。滯育期間或低溫脅迫的昆蟲可通過積累小分子抗寒物質(zhì)，如糖、甘油、脂肪、多元醇和氨基酸等以降低冰點(diǎn)和增加細(xì)胞外液的滲透壓來保護(hù)細(xì)胞[3,4]。研究表明，越冬昆蟲體內(nèi)的多種小分子抗寒物質(zhì)通過形成抗寒系統(tǒng)來抵御外界不良環(huán)境，不同昆蟲在滯育期的抗寒系統(tǒng)組分及含量也不相同。如中華蜜蜂Apisceranacerana體內(nèi)的抗寒物質(zhì)系統(tǒng)為“葡萄糖-甘油-氨基酸”[5]，棉鈴蟲Anoplophoraglabripennis的抗寒物質(zhì)系統(tǒng)為甘油-葡萄糖-甘露醇-氨基酸（絲氨酸、谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸、丙氨酸和脯氨酸）[6]。處于寒冷滯育期的亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus卵的脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甘油、海藻糖、肌醇和山梨醇含量顯著增加；寬翅曲背蝗Pararcypteramicropateramerideonalis卵在低溫條件下的甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、甘油、海藻糖、肌醇和山梨醇含量增加[7]。此外，不同地理種群的飛蝗受低溫脅迫后其主要合成的抗寒物質(zhì)種類不同：和碩種群的蝗卵主要合成海藻糖，哈密種群蝗卵主要合成甘油、山梨醇和海藻糖等，而北大港種群主要合成甘油和山梨醇[8]，說明地理位置也可影響同種昆蟲的耐寒物質(zhì)組成。滯育期的西伯利亞蝗Gomphocerus sibiricus卵則以甘油、果糖、山梨醇和氨基酸為抗寒物質(zhì)系統(tǒng)以抵御新疆嚴(yán)寒[9]。

在新疆分布的所有蝗蟲中，意大利蝗Calliptamusitalicus是主要優(yōu)勢害蟲，由于其分布范圍廣和繁殖力極強(qiáng)，嚴(yán)重為害當(dāng)?shù)夭輬黾稗r(nóng)作物生長。意大利蝗以卵滯育越冬，卵期是其抵御低溫不利條件的重要發(fā)育階段。新疆冬季較為寒冷且持續(xù)時間較長，蝗卵能否安全度過嚴(yán)寒冬季對其個體發(fā)育及為害程度至關(guān)重要。為能確保順利越冬，意大利蝗除了采取適時滯育的對策外[10-12]，越冬期間蝗卵的過冷卻點(diǎn)極低[13]，推測蝗卵在越冬發(fā)育過程中具有較強(qiáng)的抗寒性，但蝗卵是否通過積累小分子抗寒物質(zhì)來提高抗寒性還不得而知。鑒于抗寒物質(zhì)在昆蟲抵御低溫不良環(huán)境中的重要性，本研究通過對意大利蝗卵野外越冬發(fā)育過程的小分子碳水化合物、脂肪和游離氨基酸含量進(jìn)行測定，明確蝗卵越冬過程的抗寒物質(zhì)組成及含量變化，探討意大利蝗越冬卵的耐寒能力，為揭示意大利蝗的抗寒適應(yīng)機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蝗卵采集及樣品準(zhǔn)備

2017年7月至8月于新疆維吾爾自治區(qū)瑪納斯縣大陽山（43°55′ N，86°91′ E；海拔1292 m）采集雌、雄意大利蝗成蟲，并用其喜食植物（冷蒿Artemisiafrigida、紫花苜蓿Medicagosativa）進(jìn)行就地籠罩飼養(yǎng)，待其交配產(chǎn)卵后，每天定時篩土收集蝗卵，埋于野外土壤中。定期解剖蝗卵，并于體式顯微鏡（SMZ 745T，日本尼康）下觀察蝗卵發(fā)育情況。根據(jù)王香香等[12]的劃分標(biāo)準(zhǔn)，確定蝗卵發(fā)育階段，并將各階段（Ⅰ～Ⅹ階段）蝗卵于液氮中保存?zhèn)溆谩２捎秒娮訙囟扔涗浧鳎═P-2200，北京安伏）測定室外蝗卵越冬過程5 cm的土層地溫，待蝗卵孵化出土后讀取溫度數(shù)據(jù)，實(shí)時跟蹤調(diào)查蝗卵發(fā)育過程的環(huán)境溫度變化情況。

1.2 試驗(yàn)方法

取不同發(fā)育階段的蝗卵及1齡蝗蝻于烘箱（DHG9070A，上海齊欣）中烘干至恒重，并研磨成粉，以備后續(xù)抗寒物質(zhì)含量測定。

1.2.1 糖類物質(zhì)含量測定 葡萄糖和果糖含量分別采用葡萄糖檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）和果糖檢測試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測定。糖原和海藻糖含量參照張徐等[14]的方法進(jìn)行測定。

1.2.2 多元醇含量測定 甘油含量參照張徐等[14]的方法進(jìn)行測定。山梨醇含量的測定參照王洪亮[15]的方法進(jìn)行。肌醇含量采用昆蟲肌醇ELISA檢測試劑盒（上海加科生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測定。

1.2.3 脂肪含量測定 參照張徐等[14]的方法進(jìn)行。

1.2.4 氨基酸含量測定 分別取不同發(fā)育階段蝗卵各30粒，每個階段重復(fù)3次，送至新疆畜牧科學(xué)院采用氨基酸自動分析儀（S-433D，德國Sykam）測定蝗卵的氨基酸含量，具體檢測和分析方法參見國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2003。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同階段蝗卵的抗寒物質(zhì)含量其差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 意大利蝗卵發(fā)育與環(huán)境溫度的關(guān)系

意大利蝗卵的發(fā)育過程分為10個階段，具體劃分標(biāo)準(zhǔn)參考王香香等[12]的報道。早期發(fā)育階段（Ⅰ～Ⅲ）：蝗卵發(fā)育較快，原頭分化出觸角，復(fù)眼基本形成，且胸部、腹部分節(jié)明顯。此時外界環(huán)境溫度較高，其中第Ⅰ階段的平均溫度最高為（26.80±2.73）℃。滯育階段（Ⅳ～Ⅵ）：隨著外界溫度降至零下，蝗卵發(fā)育基本停滯，復(fù)眼邊緣出現(xiàn)色素，胚胎形態(tài)無顯著變化，在深度滯育的第Ⅴ階段，環(huán)境溫度最低，為（-7.96±0.12）℃。滯育后發(fā)育階段（Ⅶ～Ⅸ）：當(dāng)環(huán)境溫度逐漸升高，發(fā)生胚轉(zhuǎn)，胚轉(zhuǎn)完成后，原頭由原來的卵孔方向轉(zhuǎn)為卵前端指向。第Ⅹ階段：當(dāng)平均溫度升至（15.14±0.27）℃時，蝗卵剛孵化出殼為1齡蝗蝻（Ⅹ）（圖1）。

圖1 意大利蝗卵發(fā)育過程的野外環(huán)境溫度變化（2017.8―2018.5）Fig.1 Temperature changes in the surrounding environment during egg development in C.italicus (2017.8―2018.5)

2.2 意大利蝗越冬卵不同發(fā)育時期的小分子糖類物質(zhì)含量變化

通過對意大利蝗越冬卵發(fā)育過程的海藻糖、葡萄糖、果糖和糖原進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：在越冬卵的發(fā)育過程中，海藻糖含量的變化趨勢呈“W”型（圖 2A）。早期發(fā)育階段，蝗卵海藻糖含量先減后增，其中，第Ⅱ階段顯著低于Ⅰ和Ⅴ階段（P＜0.05）；滯育階段，蝗卵海藻糖含量先增后減，其中第Ⅴ階段含量顯著高于其他所有階段（P＜0.05），為（22.92±0.62）μg/mg；滯育后發(fā)育階段，第Ⅷ階段海藻糖含量最低，顯著低于其他所有階段（P＜0.05），為（10.36±0.29）μg/mg。

意大利蝗越冬卵發(fā)育過程葡萄糖含量呈積累-消耗的變化趨勢（圖 2B）。早期發(fā)育階段，葡萄糖含量不斷積累，其中第Ⅲ階段含量顯著高于除Ⅶ、Ⅸ階段外的其他所有階段（P＜0.05）。當(dāng)蝗卵進(jìn)入滯育，葡萄糖含量持續(xù)下降；在滯育剛解除后的第Ⅶ階段的葡萄糖含量急劇上升，隨著發(fā)育推進(jìn)，含量急劇下降至最低（Ⅷ），為（0.90±0.15）μg/mg，發(fā)育至第Ⅸ階段，葡萄糖含量升至最高，為（3.97±0.19）μg/mg，顯著高于其他所有階段（P＜0.05）。1齡蝗蝻（Ⅹ）的葡萄糖含量較低，顯著低于第Ⅲ、Ⅶ和Ⅸ階段（P＜0.05）。

果糖含量隨著越冬卵的發(fā)育逐漸上升（圖 2C）。早期發(fā)育階段果糖含量不斷積累，其中，第Ⅲ階段顯著高于第Ⅰ、Ⅱ階段（P＜0.05）；滯育階段的果糖含量無顯著變化（P＞0.05）；滯育解除后，果糖含量持續(xù)升高，第Ⅸ階段含量顯著高于之前所有階段（P＜0.05），且1齡蝗蝻（Ⅹ）的果糖含量最高，為（5.78±0.39）μg/mg，顯著高于其他所有階段（P＜0.05）。

越冬卵的糖原含量呈不斷積累-消耗的趨勢（圖2D）。在早期發(fā)育階段，第Ⅰ階段的糖原含量最低，為（1.93±0.07）μg/mg，顯著低于除第Ⅶ階段外的其他所有階段（P＜0.05），隨后，糖原含量逐漸升高，第Ⅲ階段顯著高于Ⅰ、Ⅱ階段；隨著蝗卵進(jìn)入滯育，滯育早期（Ⅳ）的糖原含量顯著低于第Ⅲ階段（P＜0.05），第Ⅴ階段蝗卵糖原含量較高，顯著高于除Ⅷ階段外的其他階段（P＜0.05），隨后逐漸下降；滯育后發(fā)育階段蝗卵的糖原含量先增后減，在胚轉(zhuǎn)時（Ⅷ）升至最高，為（11.77±0.31）μg/mg，顯著高于除滯育中期以外的其他階段（P＜0.05），隨后逐漸下降。

圖2 意大利蝗越冬卵發(fā)育過程的糖類物質(zhì)含量變化Fig.2 Changes of sugar content during the development process of overwintering eggs in C.italicus

2.3 意大利蝗越冬卵不同發(fā)育時期的多元醇含量變化

通過對意大利蝗越冬卵發(fā)育過程中的山梨醇、肌醇和甘油含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：在整個發(fā)育過程中，山梨醇含量的變化趨勢為：1齡蝗蝻＞滯育階段＞滯育后發(fā)育階段＞早期發(fā)育階段（圖3A）。其中，第Ⅰ階段的山梨醇含量最低，為（9.97±0.40）μg/mg；隨著發(fā)育推進(jìn)，山梨醇含量逐漸增加。當(dāng)蝗卵進(jìn)入滯育，山梨醇含量較早期發(fā)育階段的第Ⅰ、Ⅱ階段顯著上升（P＜0.05）。隨著滯育解除，山梨醇含量逐漸下降，當(dāng)蝗卵孵化為蝗蝻時，山梨醇含量急劇升高至最大，為（35.34±0.54）μg/mg，顯著高于其他所有階段（P＜0.05）。

在蝗卵早期發(fā)育中，肌醇含量逐漸增加，第Ⅲ階段顯著高于第Ⅰ階段（P＜0.05）。當(dāng)蝗卵進(jìn)入滯育時，肌醇含量顯著升高（P＜0.05），隨后逐漸下降，第Ⅳ階段的肌醇含量顯著高于Ⅴ、Ⅵ階段（P＜0.05）。滯育解除后，肌醇含量先增后減，其中第Ⅸ階段的肌醇含量（5.38±1.00）μg/mg顯著低于其他所有階段（P＜0.05），1齡蝗蝻的肌醇含量較孵化前高（P＜0.05）（圖3B）。

蝗卵的甘油含量隨發(fā)育進(jìn)程總體呈升高趨勢（圖 3C），其中，第Ⅰ階段的甘油含量最低，為（13.25±1.89）μg/mg，顯著低于其他所有發(fā)育階段（P＜0.05）；滯育階段，甘油逐漸累積，顯著高于早期發(fā)育階段（P＜0.05）；1齡蝗蝻的甘油含量最高（142.60±3.38）μg/mg，顯著高于其他所有階段（P＜0.05）。

圖3 意大利蝗越冬卵發(fā)育過程的多元醇含量變化Fig.3 Changes of polyols content during the development process of overwintering eggs in C.italicus

2.4 意大利蝗越冬卵不同發(fā)育時期的脂肪含量變化

通過對意大利蝗越冬卵發(fā)育過程的脂肪含量進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：整個卵期的脂肪含量無顯著變化（P＞0.05），當(dāng)蝗卵孵化成1齡蝗蝻時，脂肪含量升至最高，占干重的42.87%，顯著高于其他所有發(fā)育階段（P＜0.05）（圖4）。

圖4 意大利蝗越冬卵胚胎發(fā)育脂肪含量變化Fig.4 Changes of fat contents during the development process of overwintering eggs in C.italicus

2.5 意大利蝗越冬卵不同發(fā)育時期的游離氨基酸含量變化

意大利蝗卵發(fā)育過程的氨基酸總量在早期發(fā)育階段較穩(wěn)定，但無顯著變化（P＞0.05）。處于深度滯育（Ⅴ）的蝗卵氨基酸總量（45.03±0.33）mg/100 mg顯著高于其他所有階段（P＜0.05），且除胱氨酸 Cys的其他所有氨基酸含量均顯著升高。滯育后發(fā)育階段，蝗卵的氨基酸總量較早期發(fā)育階段和滯育階段顯著降低（P＜0.05）?；嚷颜麄€發(fā)育過程中，谷氨酸Glu含量顯著高于其他氨基酸（P＜0.05），占總氨基酸的13.75%；胱氨酸Cys含量最低，僅占總氨基酸的1.22%；天冬氨酸Asp、亮氨酸Leu、酪氨酸Tyr、精氨酸Arg、脯氨酸Pro的百分含量占比也較高；蛋氨酸Met、甘氨酸Gly以及苯丙氨酸Phe的百分含量占比較低（表1）。

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3 討論

昆蟲的生長發(fā)育與生態(tài)因子尤其是溫度密切相關(guān)[16]，抵御外界不利條件是寒冷地區(qū)昆蟲能夠順利完成生活史的條件之一[17]。昆蟲在面對低溫等不良環(huán)境時，為了確保發(fā)育正常，在長期進(jìn)化中形成了一系列適應(yīng)對策[18]。耐寒性強(qiáng)弱和是否滯育是影響多數(shù)昆蟲順利越冬的兩個重要因素[19]。研究表明，大多數(shù)昆蟲可通過改變體內(nèi)抗寒物質(zhì)種類或含量來抵御寒冷。如在滯育期間，昆蟲體內(nèi)的糖類[20]、脂肪、多元醇等[21,22]抗寒物質(zhì)可隨滯育進(jìn)程發(fā)生改變，因此，抗寒物質(zhì)可作為判定昆蟲是否滯育與滯育解除的重要指標(biāo)之一[23]。

作為新疆主要的優(yōu)勢害蟲，意大利蝗以卵滯育越冬至孵化整個過程長達(dá)約9個月，而卵期較蟲體脆弱，不能通過遷飛等行為躲避不利環(huán)境。新疆冬季寒冷且漫長，面臨這樣的低溫不利環(huán)境，意大利蝗依然保持較大的種群數(shù)量和較為嚴(yán)重的發(fā)生程度，推測其可能原因是蝗卵具有較強(qiáng)的抗寒性。為弄清意大利蝗卵越冬期間的抗寒機(jī)制，在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本研究通過檢測意大利蝗卵發(fā)育及滯育期間的抗寒物質(zhì)種類及含量，探究其抗寒物質(zhì)系統(tǒng)，為深入研究其發(fā)生機(jī)制及有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

研究表明，糖類物質(zhì)是昆蟲體內(nèi)的主要抗寒物質(zhì)。其中，糖原除了作為昆蟲的主要能源物質(zhì)外[24]，還可作為碳水化合物的底物轉(zhuǎn)化為其他小分子糖和多元醇[19]，作為小分子抗凍劑以抵御低溫脅迫。果糖和葡萄糖則作為細(xì)胞的重要代謝中間產(chǎn)物，可通過糖酵解等途徑轉(zhuǎn)化為能量或合成其他抗凍保護(hù)劑以供細(xì)胞所需能量和抵御寒冷。

本研究中，蝗卵剛產(chǎn)下不久，其海藻糖含量較高。在早期發(fā)育階段，蝗卵發(fā)育較快，海藻糖含量隨著蝗卵發(fā)育逐漸降低，此時海藻糖作為能源物質(zhì)以供蝗卵發(fā)育所需或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。隨著溫度降低至零下，蝗卵進(jìn)入深度滯育（Ⅴ），海藻糖含量顯著高于其他所有階段，說明在深度滯育前，蝗卵海藻糖的積累大于消耗。低溫條件下，一些昆蟲體內(nèi)出現(xiàn)海藻糖含量升高現(xiàn)象。如東亞飛蝗Locustamigratoria卵在不同冷卻速率下其海藻糖、肌醇和甘油含量增加有助于抵抗低溫脅迫[25]。輪紋異痂蝗Bryodemellatuberculatum dilutum可通過提高海藻糖含量來抵御寒冷[7]，這與本研究結(jié)果一致。當(dāng)蝗卵即將解除滯育時，海藻糖含量顯著降低，說明隨著滯育的持續(xù)，蝗卵在滯育末期消耗了較多前期積累的海藻糖，但其含量仍高于其他 3種糖類的含量，滯育期海藻糖含量的積累可能與平衡蝗卵的滲透壓和穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)來抵御外界低溫有關(guān)[26]。當(dāng)蝗卵滯育解除，恢復(fù)發(fā)育，海藻糖含量顯著降低，尤其在第Ⅷ階段急劇下降，此時蝗卵消耗大量海藻糖使其順利完成胚轉(zhuǎn)，胚轉(zhuǎn)完成后海藻糖含量再次積累，可為蝗卵的后期發(fā)育儲備能量。海藻糖作為昆蟲血糖，其含量在體內(nèi)不隨環(huán)境溫度而變化，但作為抗寒物質(zhì)會隨著環(huán)境發(fā)生變化[4]。意大利蝗卵的海藻糖含量在最低溫的深度滯育時積累至最大，越冬前和越冬后的非滯育卵含量顯著低于滯育卵。結(jié)果表明，海藻糖不僅是意大利蝗卵發(fā)育過程的主要能源物質(zhì)，也是越冬期間的主要抗寒物質(zhì)，保護(hù)蝗卵免受低溫?fù)p傷。

意大利蝗越冬卵發(fā)育階段的各種糖類物質(zhì)含量具有顯著變化，其中，葡萄糖和糖原含量的變化幅度較大。葡萄糖含量在蝗卵整個發(fā)育階段出現(xiàn)3次大量積累（滯育前、滯育剛解除和臨近孵化）以及2次快速下降（滯育末期和發(fā)生胚轉(zhuǎn)時）。蝗卵在早期發(fā)育階段（Ⅲ）和滯育剛解除（Ⅶ）的葡萄糖大量積累可為蝗卵完成滯育及胚轉(zhuǎn)儲存能量，由于蝗卵孵化為1齡蝗蝻需突破卵殼的束縛而消耗大量的能量，因此在第Ⅸ階段的葡萄糖含量大量積累。葡萄糖含量在滯育期一直下降，說明蝗卵主要消耗葡萄糖含量以維持蝗卵滯育或通過能量代謝途徑轉(zhuǎn)化為其他小分子物質(zhì)；當(dāng)蝗卵發(fā)生胚轉(zhuǎn)時（Ⅷ）葡萄糖作為直接能源物質(zhì)為其供能。以上階段都為蝗卵發(fā)育的重要時期，這表明葡萄糖的合成和消耗與蝗卵發(fā)育進(jìn)度有關(guān)，主要為蝗卵發(fā)育提供能量。糖原含量在深度滯育（Ⅴ）和胚轉(zhuǎn)時（Ⅷ）顯著高于其他階段，說明蝗卵在滯育期間積累大量糖原，從而為滯育解除以及后期發(fā)育儲備能量?；嚷寻l(fā)生胚轉(zhuǎn)時的糖原含量與葡萄糖和海藻糖變化趨勢相反，此時糖原大量積累，推測三者之間存在相互轉(zhuǎn)換的關(guān)系。隨著蝗卵繼續(xù)發(fā)育和孵化，糖原含量逐漸下降，可能與蝗卵后期發(fā)育需要消耗大量能源物質(zhì)有關(guān)。大量研究表明，葡萄糖和糖原可作為能源物質(zhì)在體內(nèi)儲存、消耗或轉(zhuǎn)化為其他小分子物質(zhì)，也可作為低溫保護(hù)劑在體內(nèi)積累以滿足機(jī)體各種需求[4,27-28]。本研究中，葡萄糖和糖原均為意大利蝗卵發(fā)育的主要能源物質(zhì)，糖原含量在滯育期雖顯著上升，但遠(yuǎn)低于海藻糖，因此推測糖原不是蝗卵的主要抗寒物質(zhì)。而果糖含量在整個蝗卵發(fā)育過程呈持續(xù)上升趨勢，但低溫滯育期間的果糖含量與早期發(fā)育階段差異不顯著，且平均含量遠(yuǎn)低于海藻糖。抗寒物質(zhì)通常在初秋開始積累，越冬期維持較高水平或積累至最大，春季開始降解[19]，說明果糖不是蝗卵抵御低溫的主要抗寒物質(zhì)，其作用還有待進(jìn)一步研究。

多元醇在水溶液中極易溶解，即使在高濃度下對酶或代謝過程也無影響，可調(diào)節(jié)由脫水引起的細(xì)胞滲透壓變化，并維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，從而保護(hù)細(xì)胞免受低溫造成的損傷[19,29]，同時也是判斷昆蟲耐寒性的重要指標(biāo)之一[4]。作為主要抗寒物質(zhì)之一的甘油是目前研究最多的抗凍保護(hù)劑，可與山梨醇等協(xié)同保護(hù)組織安全越冬[29,30]。西藏飛蝗Locustamigratoriatibetensis在經(jīng)過低溫馴化后，體內(nèi)大量積累甘油[31]；輪紋異痂蝗卵在滯育期中甘油含量逐漸升高[7]；經(jīng)低溫誘導(dǎo)的椰心葉甲蟲Brontispalongissima其甘油含量升高[14]；甘油在華山松大小蠹Dendroctonusarmandi幼蟲越冬期積累[32]；滯育期間東亞小花蝽Oriussauteri耐寒能力的增加與甘油含量增加有關(guān)[33]；甘油也是大多數(shù)越冬鱗翅目幼蟲的主要防凍保護(hù)劑[34,35]。在意大利蝗卵的整個發(fā)育期間，甘油含量總體呈上升趨勢，尤其是低溫滯育階段的甘油含量顯著高于早期發(fā)育階段。甘油的合成伴隨能量消耗，可在有氧代謝條件下促進(jìn)甘油合成[36]。本研究中，甘油含量在早期發(fā)育階段積累最快，這可能與早期發(fā)育階段蝗卵呼吸代謝率最快有關(guān)，課題組前期對意大利蝗卵的呼吸代謝測定結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)[11]，同時1齡蝗蝻的呼吸代謝較卵期更快，因此1齡蝗蝻甘油含量最高。綜上所述，甘油的積累有助于蝗卵抵御外界低溫和安全越冬。這與麗草蛉滯育預(yù)蛹Chrysopaformosa的研究結(jié)果一致[37]，本研究也證實(shí)了“甘油是昆蟲體內(nèi)的一種重要抗凍保護(hù)物質(zhì)”這一觀點(diǎn)。

山梨醇可作為昆蟲抗寒物質(zhì)在體內(nèi)積累，也是判斷舞毒蛾Lymantriadispa卵滯育深度的指標(biāo)[38,39]。本研究中，早期發(fā)育階段和滯育階段蝗卵的山梨醇含量呈持續(xù)升高趨勢，說明山梨醇是意大利蝗卵越冬期間的抗寒保護(hù)物質(zhì)。滯育解除后山梨醇含量下降，但不顯著，表明山梨醇可為蝗卵滯育解除后的快速發(fā)育提供少量能量，但不是主要能源物質(zhì)。而肌醇在蝗卵的滯育初期（Ⅳ）和胚轉(zhuǎn)時（Ⅷ）積累最大，滯育期和即將孵化的第Ⅸ階段含量下降。說明滯育初期肌醇含量的積累可為蝗卵滯育的維持儲備能量，當(dāng)蝗卵發(fā)生胚轉(zhuǎn)時主要消耗糖類物質(zhì)以完成胚轉(zhuǎn)，而肌醇在體內(nèi)大量積累可為胚胎發(fā)育儲能。當(dāng)蝗卵發(fā)育至即將孵化時（Ⅸ階段），肌醇含量反而降到最低，這可能是由于蝗卵在后期發(fā)育過程中需要消耗比滯育期更多的肌醇以滿足快速發(fā)育需要。

脂肪作為昆蟲生長發(fā)育過程中的能源物質(zhì)，經(jīng)過一系列代謝途徑轉(zhuǎn)化，為昆蟲的生命活動提供營養(yǎng)及能量。本研究中，各發(fā)育階段蝗卵的脂肪含量無顯著差異，可能是由于埋于土中的蝗卵，較蟲體消耗能量少，糖類物質(zhì)作為直接能源物質(zhì)即可滿足其發(fā)育和代謝需要。此外，課題組前期的呼吸代謝研究也發(fā)現(xiàn)，意大利蝗卵的呼吸代謝底物主要為糖類而不是脂類[11]，本研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。1齡蝗蝻的脂肪含量顯著高于卵期所有發(fā)育階段，這是由于隨著蝗卵的發(fā)育，胚胎逐漸吸收和消耗卵黃致使胚胎變大，臨近孵化的胚胎占據(jù)整個蝗卵，孵化出的蝗蝻脫離了卵殼的保護(hù)，必須具備較多的脂肪才能更好適應(yīng)外界環(huán)境條件的變化。此外，研究結(jié)果還表明脂肪對意大利蝗卵越冬期間抵御不良環(huán)境的貢獻(xiàn)較小，不是越冬卵滯育階段的主要抗逆物質(zhì)。柑橘鳳蝶Papilioxuthus滯育蛹的脂肪含量遠(yuǎn)高于非滯育蛹[40]；沙蔥螢葉甲Galeruca daurica成蟲在越夏期間作為能源物質(zhì)的脂肪其含量逐漸下降[41]；這與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)槲锓N和蟲態(tài)不同，蛹、成蟲和卵對溫度、濕度等外界條件的響應(yīng)程度也不相同，從而導(dǎo)致能量消耗來源及含量不同。

氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，與昆蟲的抗寒性密切相關(guān)。在意大利蝗越冬卵發(fā)育過程中，氨基酸總量高低順序?yàn)椋簻A段＞早期發(fā)育階段＞滯育后發(fā)育階段，這與越北腹露蝗Fruhstorferiola tonkinensis卵在滯育解除后的氨基酸總量增加的結(jié)果不一致[42]，可能是由于剛產(chǎn)下的意大利蝗卵需經(jīng)歷早期胚胎發(fā)育階段才能進(jìn)入滯育，而越北腹露蝗產(chǎn)下的即為滯育卵。其次，越北腹露蝗位于粵北地區(qū)，本研究中的意大利蝗取自新疆，生境不同也會影響氨基酸總量，具體原因還有待進(jìn)一步研究。越冬過程中，第Ⅴ階段蝗卵處于深度滯育，此時谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸、脯氨酸的含量較高，由此推測這6種氨基酸可能是蝗卵越冬過程中主要的抗寒物質(zhì)。1齡蝗蝻所有氨基酸含量均減少，說明蝗卵順利孵化成蝗蝻需要消耗大量氨基酸，氨基酸對于蝗卵的發(fā)育不可或缺。由于胚胎的主要成分為蛋白質(zhì)，其主要構(gòu)成成分為谷氨酸，因此，在蝗卵整個發(fā)育過程中，谷氨酸總量較其他氨基酸高，這與葛婧等[43]研究結(jié)果一致?；嚷蚜涟彼岷吭黾映艘?yàn)榱涟彼釙绊懙鞍踪|(zhì)的合成和分解外[44]，谷氨酸的增多也會導(dǎo)致亮氨酸含量增加。精氨酸參與蛋白質(zhì)合成和激素分泌等生理過程[42,45]，本研究中深度滯育期蝗卵的精氨酸含量增加，推測其可能通過合成蛋白質(zhì)以及促使分泌維持滯育的激素，從而發(fā)揮抵御低溫脅迫的功能。作為昆蟲黑色素合成前體物質(zhì)的酪氨酸，參與蟲體的黑化作用[46]?；嚷训睦野彼岷吭黾樱蔀楹笃谂咛ンw色的黑化和順利孵化奠定基礎(chǔ)。當(dāng)蝗卵受低溫脅迫時脫水，脯氨酸則可插入生物膜磷脂分子中從而緩解低溫對細(xì)胞膜的損傷，因此深度滯育時脯氨酸含量的增加有助于保持昆蟲體內(nèi)水分，同時也可作為抗凍保護(hù)劑在體內(nèi)積累，并為其他蛋白質(zhì)的合成提供能量[47-50]。滯育期的昆蟲會以一種滯育蛋白的形式儲存氨基酸，這些氨基酸在滯育期具有合成代謝、維持呼吸代謝以及滯育后的恢復(fù)發(fā)育等作用[21]。此外大量研究表明氨基酸與昆蟲耐寒性密切相關(guān)，但部分氨基酸的耐寒機(jī)制尚不明晰，且一些氨基酸如丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸等的濃度還受氧氣、溫度及滯育狀態(tài)影響[51,52]。意大利蝗卵各氨基酸含量和氨基酸總量隨蝗卵滯育進(jìn)程的不同而發(fā)生變化，當(dāng)外界溫度最低時，處于深度滯育的蝗卵除胱氨酸外各個氨基酸含量和氨基酸總含量均顯著積累，推測在滯育期的大量積累有助于蝗卵維持呼吸代謝及蛋白活性，從而更好地抵御新疆低溫脅迫，為后期胚胎的快速發(fā)育提供能量。

越冬期間，昆蟲體內(nèi)可通過積累小分子抗寒物質(zhì)增加體內(nèi)束縛水的含量，也可與其他蛋白相互作用增強(qiáng)昆蟲的抗寒能力。滯育與低溫都會引起昆蟲體內(nèi)的小分子物質(zhì)發(fā)生變化。分布于寒帶地區(qū)的意大利蝗，通過采取以卵滯育的策略越冬，抵御低溫環(huán)境引起的損傷。由于抗寒性強(qiáng)弱與蝗卵內(nèi)積累的生理生化物質(zhì)密切相關(guān)，因此本研究通過分析意大利蝗卵越冬發(fā)育過程中的多種抗寒能源物質(zhì)含量的動態(tài)變化，結(jié)果表明，意大利蝗卵的抗寒物質(zhì)系統(tǒng)主要為“小分子碳水化合物（甘油、海藻糖、山梨醇）-氨基酸（谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、精氨酸、酪氨酸和脯氨酸）”。糖原、葡萄糖和肌醇在蝗卵發(fā)育過程中的變化幅度較大，主要發(fā)揮能量供給和參與代謝的作用。研究結(jié)果可為深入了解意大利蝗卵的滯育機(jī)制和適應(yīng)機(jī)理奠定基礎(chǔ)，但本研究涉及的這幾種物質(zhì)能否作為判定意大利蝗卵滯育狀態(tài)的指標(biāo)還有待進(jìn)一步探討。