新疆荒漠綠洲區(qū)越冬亞洲玉米螟病原真菌種類鑒定及多樣性分析

蔣旭東，丁新華，王小武，付開赟，袁梓涵，吐爾遜·阿合買提，何 江，賈尊尊,，郭文超，王志方，楊新平，代金平，謝玉清，周留艷，馮 蕾

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091）

昆蟲病原真菌具有高效、低毒、低殘留等特點(diǎn)，易引發(fā)昆蟲的流行病，在玉米螟[1]、蚜蟲[2]等害蟲的生物防治中有非常重要的作用，是自然界中控制害蟲種群消長的重要因子和生防資源[3-8]。有研究報(bào)道，不同生態(tài)環(huán)境由于生物與非生物因子不同，害蟲病原真菌的種類與優(yōu)勢種有很大差異[9]，開展病原微生物種質(zhì)資源及多樣性研究，調(diào)查不同生境病原真菌分布、物種多樣性及群落結(jié)構(gòu)，對了解、開發(fā)本土生防菌資源和開發(fā)生物源制劑都具有非常重要的作用，因此收集和分離病原真菌對生物農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用具有重要意義[10]。通過對病原真菌等主要生物致死因子的分析，掌握其對玉米螟等害蟲種群數(shù)量調(diào)節(jié)能力，估計(jì)種群發(fā)展趨勢，可為害蟲綜合防治及預(yù)測預(yù)報(bào)提供科學(xué)基礎(chǔ)[7]。

玉米是新疆主要糧食作物之一。2019年新疆玉米種植面積99.72×104hm2，占全疆農(nóng)作物面積的16.2%，占糧食作物面積的 45.7%，是當(dāng)?shù)胤N植業(yè)與畜牧業(yè)協(xié)調(diào)發(fā)展的重要支柱農(nóng)作物[11]。亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis作為玉米上的主要害蟲，一般發(fā)生年份玉米減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重發(fā)生年份減產(chǎn)達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)[12]，嚴(yán)重影響了新疆玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。新疆玉米生產(chǎn)屬荒漠綠洲生態(tài)環(huán)境，關(guān)于該地區(qū)玉米螟病原真菌的資源分布與優(yōu)勢種還未見報(bào)道。因此，本團(tuán)隊(duì)2019—2020年連續(xù)2年在新疆5個(gè)地州6個(gè)縣/市185個(gè)樣點(diǎn)采集越冬亞洲玉米螟幼蟲，分離鑒定玉米螟越冬幼蟲感染病原真菌的種類，旨在了解新疆荒漠綠洲區(qū)越冬玉米螟病原真菌資源及物種多樣性，為新疆玉米種植區(qū)的玉米螟的生物防治提供理論基礎(chǔ)與病原真菌資源[13-15]。

1 材料與方法

1.1 越冬亞洲玉米螟幼蟲采集

2019—2020年連續(xù)2年的4月，在新疆5個(gè)地州6個(gè)縣/市185個(gè)樣點(diǎn)采集越冬亞洲玉米螟幼蟲，單頭單管編號保存，共534號（份）（表1），帶回實(shí)驗(yàn)室，罹病蟲體單管保存于4 ℃冰箱，用于后續(xù)分離、鑒定等試驗(yàn)。

表1 亞洲玉米螟罹病蟲體來源及寄主（新疆2019—2020）Table 1 Sources and hosts of diseased Ostrinia furnacalis (Xinjiang 2019—2020)

1.2 菌種分離、純化與鑒定

菌株分離、純化與鑒定參照陳名君等[8]的方法。罹病幼蟲樣品和分離菌株均保存于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所菌種保藏中心。

1.2.1 蟲-菌分離 在超凈工作臺(tái)上，將采集到的長滿菌絲的幼蟲體挑取部分菌絲，接種到PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)；蟲體浸入75%的酒精中，消毒5 s，再用無菌水漂洗3次，用滅菌濾紙吸凈水分；用消毒后的解剖刀將蟲體剖開，放入無菌水中混勻；再進(jìn)行不同梯度濃度的稀釋，均勻涂布于 PDA平板上。將平板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待平板表面菌絲覆蓋一半的平板時(shí)，挑取單菌落進(jìn)行分離、純化（純化后的菌株再轉(zhuǎn)接到亞洲玉米螟2齡幼蟲以驗(yàn)證是否為玉米螟病原菌）。

1.2.2 菌種鑒定 使用CTAB法提取菌株的基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物測序（杰李生物技術(shù)（上海）股份有限公司）。將所得基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中保存的基因序列進(jìn)行比對，得到與目的菌株具有同源性的多株菌株相應(yīng)序列。從中選擇下載同源性較高的序列，使用MEGA 10.0軟件，運(yùn)用NJ法進(jìn)行1000次步長計(jì)算，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 優(yōu)勢種的確定 依據(jù)相對分離頻率（RF）來確定新疆亞洲玉米螟優(yōu)勢寄生真菌菌株：＞10%為優(yōu)勢種，1%～10%為常見種，＜1%為稀有種[16,17]。RF（%）＝ 樣本中分離得到的某種（屬）蟲生真菌菌株數(shù)/分離得到總菌株數(shù)×100 。

1.3.2 Sorenson相似性系數(shù)（Cs）分析 Cs計(jì)算公式[18]：Cs＝2j/a＋b；其中，j 是玉米螟兩個(gè)不同地理種群中共同具有的真菌種類數(shù)；a 是地理種群 A 中分離出真菌的種類數(shù)；b 是地理種群 B 中分離出真菌的種類數(shù)。

1.3.3 多樣性指數(shù) 采用Excel 2016對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)分析。菌株和寄主的分布特征采用種的豐富度、多度和相對多度統(tǒng)計(jì)，并用Shannon-Wiener 指數(shù)（H′）、均勻度（E）、相對多度，進(jìn)行計(jì)算分析[18-20]。具體公式：Shannon-Wiener 指數(shù)（H′），H′＝-∑PilnPi；均勻度（E），E＝H/lnS；相對多度＝某個(gè)種的株數(shù)/所有種的總株數(shù)×100%。其中 Pi＝Ni/N；Ni為第i種的個(gè)體數(shù)；N為群落中總的個(gè)數(shù)；均勻度公式中H為實(shí)測多樣性值，S為物種數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離到的亞洲玉米螟病原真菌

從534份樣本中共分離得到136株真菌，檢出率為26.2%。將分離到的菌株ITS 序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，其與已報(bào)道的菌株序列的相似度為98.38%以上（表2）；基于rDNA ITS序列片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1）顯示，分離純化得到的菌株依次為球孢白僵菌B.bassiana（27株）、紅綬曲霉Aspergillusnomius（30株）、漸狹蠟蚧菌Lecanicilliumattenuatum（9株）、波蘭青霉菌Penicillium polonicum（4株）、雷斯青霉菌Penicilliumraistrickii（2株）、鐮孢霉Fusariumsp.（18株）、花腐鐮孢菌Fusariumanthophilum（13株）、腐皮鐮孢菌Fusariumsolani（1株）、木賊鐮孢菌Fusariumequiseti（5株）、層出鐮孢菌Fusariumproliferatum（3株）、鏈格孢菌Alternariaalternate（7株）、Cladosporium perangustum（5株）、多頭被孢霉Mortierellapolycephala（8株）、直立枝頂孢霉Acremoniumstrictum（4株）（表2）。

表2 越冬玉米螟蟲體分離獲得病原真菌信息（2019，2020年）Table 2 Information of pathogenic fungi isolated from overwintering O.furnacalis (2019, 2020)

從越冬玉米螟罹病蟲體上已分離得到的14種真菌形成了6大分支：其球孢白僵菌與漸狹蠟蚧菌聚為一大支，各自又分為兩小支，說明漸狹蠟蚧菌與球孢白僵菌的關(guān)系較近；直立枝頂孢霉A.strictum單獨(dú)為一支，說明與其他菌種關(guān)系較遠(yuǎn)；腐皮鐮孢菌F.solani、層出鐮孢菌F.proliferatum、木賊鐮孢菌F.equiseti、鐮孢霉Fusariumsp.、花腐鐮孢菌F.anthophilum聚為一大支，且相互之間聚在一起，ITS序列不能較好將其區(qū)分，說明它們之間親源關(guān)系非常近，紅綬曲霉菌A.nomius、雷斯青霉菌P.raistrickii和波蘭青霉菌P.polonicum聚為一大支，與其他病原真菌種類的親源關(guān)系較遠(yuǎn)；C.perangustum、多頭被孢霉M.polycephala、鏈格孢菌A.alternata這幾個(gè)各自為一大支，說明與其他菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。

圖1 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（2019，2020年）Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on ITS sequence (2019, 2020 )

2.2 亞洲玉米螟病原真菌組成及分布

對分離獲得的病原真菌菌株分類地位統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，136株真菌分別隸屬于曲霉目 Aspergillus等7個(gè)目，曲霉科Aspergillus等7科，曲霉屬Aspergillus等9個(gè)屬（表3）。其中紅綬曲霉（22.06%）、球孢白僵菌（19.85%）、鐮孢霉（13.24%）為優(yōu)勢種；花腐鐮孢菌（9.56%）、波蘭青霉菌（2.94%）、雷斯青霉菌（1.47%）、漸狹蠟蚧菌（6.62%）、木賊鐮孢菌（3.68%）、層出鐮孢菌（2.21%）、多頭被孢霉（5.88%）、鏈格孢菌（5.15%）、直立枝頂孢霉（2.94%）、C.perangustum（3.68%）為常見種；腐皮鐮孢菌（0.74%）為稀有種。在分布地域上，菌株種類最多的是伊犁州霍爾果斯市（30.30%）和喀什地區(qū)疏勒縣（18.19%），烏魯木齊市新市區(qū)次之（15.16%），伊犁州新源縣最低（12.12%）。烏魯木齊新市區(qū)分離出的菌株數(shù)最多（58株），昌吉州昌吉市（30株）、伊犁州霍爾果斯市（21株）次之，伊犁州新源縣（6株）最低（表3，圖2）。

圖2 新疆不同玉米種植區(qū)玉米螟病原菌株數(shù)和種數(shù)（2019，2020年）Fig.2 The number of pathogenic strains and species of O.furnacalis in Xinjiang different corn growing areas（2019, 2020）

表3 新疆玉米種植區(qū)玉米螟病原真菌組成及分離頻率（2019，2020年）Table 3 Composition and isolation frequency of pathogenic fungi of O.furnacalis in Xinjiang’s main corn producing area（2019, 2020）

續(xù)表3

病原真菌種類、相對多度及豐富度在地區(qū)間存在很大差異。烏魯木齊市新市區(qū)昆蟲病原真菌相對多度最大，為41.43%，物種豐富度為5；其次為昌吉州昌吉市，相對多度為21.43%，物種豐富度為4；伊犁州霍爾果斯市和喀什地區(qū)疏勒縣相對多度分別為15%和11.43%，物種豐富度依次為10和6（圖3）。

圖3 新疆不同玉米種植區(qū)玉米螟病原菌相對多度和豐富度（2019，2020年）Fig.3 Relative abundance and richness of pathogens of O.furnacalis in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

2.3 新疆荒漠綠洲區(qū)越冬玉米螟病原真菌多樣性

2.3.1 病原真菌群落多樣性分析 較其他玉米種植區(qū)，伊犁州霍爾果斯市病原真菌多樣性指數(shù)和均勻度均偏高，為2.1743和0.9443，昌吉州昌吉市最低，為1.1198和0.8077。烏魯木齊市新市區(qū)（3，相對優(yōu)勢菌屬的種數(shù)）、伊犁州霍爾果斯市（3）、塔城地區(qū)沙灣市（2）和喀什地區(qū)疏勒縣（2）上述 4個(gè)玉米種植區(qū)其共有的相對優(yōu)勢菌屬均為鐮孢菌屬Fusarium，表明鐮孢菌屬分布范圍廣，生態(tài)位寬度較大（表4，5）。

表4 新疆玉米種植區(qū)昆蟲病原真菌豐富度（2019，2020年）Table 4 Entomopathogenic fungi richness in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

表5 新疆玉米種植區(qū)昆蟲病原真菌種群多樣性（2019，2020年）Table 5 Diversity of entomopathogenic fungi populations in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

2.3.2 病原真菌群落相似性 采用Sorenson相似性系數(shù)分析結(jié)果顯示，昌吉州昌吉市與烏魯木齊新市區(qū)、伊犁州新源縣與昌吉州昌吉市及伊犁州霍爾果斯市與喀什地區(qū)疏勒縣的病原真菌屬中等相似，相似性系數(shù)為0.5≤Cs＜0.75，伊犁州新源縣與烏魯木齊新市區(qū)、喀什地區(qū)疏勒縣與烏魯木齊新市區(qū)、伊犁州新源縣與塔城地區(qū)沙灣市、伊犁州霍爾果斯市與塔城地區(qū)沙灣市、喀什地區(qū)疏勒縣與伊犁州新源縣、伊犁州霍爾果斯市與伊犁州新源縣屬中等不相似，相似性系數(shù)為0.25≤Cs＜0.50，伊犁州霍爾果斯市與烏魯木齊新市區(qū)、喀什地區(qū)疏勒縣與昌吉州昌吉市、伊犁州霍爾果斯市與昌吉州昌吉市、喀什地區(qū)疏勒縣與塔城地區(qū)沙灣市極不相似，相似性系數(shù)為0＜Cs＜0.25（表6）。

表6 新疆玉米種植區(qū)玉米螟病原真菌相似性系數(shù)（2019，2020年）Table 6 Similarity coefficient of pathogenic fungi of O.furnacalis in Xinjiang corn planting area（2019, 2020）

2.4 新疆荒漠綠洲區(qū)越冬玉米螟感染優(yōu)勢病原真菌致死率

2019年和2020年新疆荒漠綠洲區(qū)越冬玉米螟中優(yōu)勢病原真菌總的感染致死率依次為1.2%～35.1%、2.1%～39.9%，平均致死率分別為7.02%、6.65%；2019年烏魯木齊新市區(qū)感染優(yōu)勢病原真菌致死率最高（28%），其次為喀什地區(qū)疏勒縣（2.1%），而塔城地區(qū)沙灣市最低（1.2%），卡方檢驗(yàn)表明各采集地區(qū)玉米螟感染優(yōu)勢病原真菌（球孢白僵菌屬致死率：χ2＝14.7，P＜0.05；曲霉屬致死率：χ2＝14.7，P＜0.05；鐮刀菌屬致死率：χ2＝14.6，P＜0.05）致死率差異性均顯著。2020年烏魯木齊新市區(qū)感染優(yōu)勢病原真菌致死率最高（14.6%），其次為昌吉州昌吉市（10.9%），伊犁州霍爾果斯市最低（1.6%），卡方檢驗(yàn)表明各采集地區(qū)玉米螟感染球孢白僵菌屬致死率差異性顯著（χ2＝12.2，P＜0.05），而曲霉屬（χ2＝2.7，P＞0.05）和鐮刀菌屬（χ2＝10.5，P＞0.05）無顯著差異性（表7）。

表7 玉米螟感染優(yōu)勢病原真菌致死率及卡方檢驗(yàn)表（2019，2020年）Table 7 O.furnacalis infection with dominant pathogenic fungi lethality and chi-square checklist (2019, 2020)

3 討論

本研究于2019―2020年連續(xù)2年對新疆荒漠綠洲區(qū)罹病越冬玉米螟樣本采集、分離，共獲得136株病原真菌，屬于7目7科9屬14種，其中以紅綬曲霉（22.06%）、球孢白僵菌（19.85%）、鐮孢霉（13.24%）的數(shù)量占絕對優(yōu)勢，3種病原真菌的數(shù)量占所有菌株的55.15%。

已報(bào)道具有生防潛力的菌屬為鐮刀菌屬、曲霉屬、白僵菌屬、蚧霉菌屬、鏈格孢屬和頂孢霉屬[35]，在本文中占比依次為 29.41%、22.06%、19.85%、6.62%、5.15%和 2.94%。關(guān)于我國玉米產(chǎn)區(qū)玉米螟病原真菌資源調(diào)查已有報(bào)道，段小莉等[7]對我國玉米主產(chǎn)區(qū)的東北春玉米區(qū)、黃淮海夏玉米區(qū)、西南山地丘陵玉米區(qū)、西北內(nèi)陸玉米區(qū) 14 個(gè)省、自治區(qū)亞洲玉米螟病原菌的寄生情況進(jìn)行了調(diào)查。明確了球孢白僵菌是該蟲的主要致死因子。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除了白僵菌外，紅綬曲霉、波蘭青霉菌、雷斯青霉菌、漸狹蠟蚧菌等 12種菌在新疆玉米產(chǎn)區(qū)均有發(fā)現(xiàn)且上述菌均為第一次報(bào)道寄生亞洲玉米螟。而造成這一差異的原因可能與昆蟲病原真菌的發(fā)生與環(huán)境溫濕度及寄主有關(guān)，導(dǎo)致部分真菌零星分布/發(fā)生量少，調(diào)查難度增大，而球孢白僵菌屬可寄生多種昆蟲，分布廣泛，容易調(diào)查[8,9]。

在自然環(huán)境中，病原真菌的分布與氣候環(huán)境（雨量）、人為活動(dòng)（外界干擾頻次）、動(dòng)植被豐富度、海拔高度以及歷史環(huán)境變遷等有關(guān)[36,37]。本研究表明，伊犁州霍爾果斯市玉米種植區(qū)病原真菌種類較多，昌吉州昌吉市種類較為單一。造成這一差異的原因可能與氣候條件（降雨多）[38]、人為活動(dòng)少有關(guān)，昌吉州玉米種植區(qū)以種植玉米為主，整個(gè)生育期外界干預(yù)頻次頻繁，尤其是化學(xué)制劑使用頻次高，導(dǎo)致病原真菌物種多樣性較低[39]。而霍爾果斯玉米種植區(qū)，地處伊犁河谷（發(fā)展有機(jī)農(nóng)業(yè)基地），整個(gè)生育期外界干預(yù)頻次?。ㄓ绕涫腔瘜W(xué)制劑使用頻次低），加之雨量充沛[40]，適宜病原真菌生存。這一結(jié)果同劉玉軍等[36]、王宏民等[37]、陳名君等[8]研究報(bào)道類似，其認(rèn)為昆蟲病原真菌多適宜生活在雨量多、氣候條件優(yōu)越、人為活動(dòng)干擾少的地區(qū)。

本研究僅對新疆玉米產(chǎn)區(qū)越冬玉米螟病原真菌種類進(jìn)行分離、鑒定及多樣性分析，有關(guān)其致病力及與天敵、環(huán)境的相容性、玉米螟攜菌與玉米莖腐病或穗腐病之間的關(guān)系還有待深入研究。此外，值得一提的是，室內(nèi)科赫氏驗(yàn)證表明，本文涉及的鐮刀菌屬的真菌對玉米螟的致死率為25%～45%，鐮刀菌屬真菌雖對玉米螟有一定的致病性，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鐮刀菌屬大多亦為玉米病害（穗腐?。┑牟≡婢鶾41]，因此，關(guān)于鐮刀菌屬的真菌作為大田殺蟲微生物，尤其是玉米田害蟲的生物防治，還需深入研究和評價(jià)。