消巖湯通過WNT通路抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究*

鄭旭 ，韓燕燕 ，顧麗麗 ，李翀

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381；2.國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381）

中國(guó)是世界上肺癌最多的國(guó)家，近年來肺癌發(fā)病率和病死率仍呈現(xiàn)不斷攀升的趨勢(shì)[1]。肺腺癌約占肺癌的50%，是肺癌最常見組織學(xué)類型，總體生存率較低[2]。肺為嬌臟，肺癌的病因病機(jī)以正虛之內(nèi)因?yàn)橹?，外因?yàn)閻憾緝?nèi)侵，合而生變，終成癌變。治療上以扶正為主、解毒祛瘀。消巖湯可扶正固本，是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”中醫(yī)腫瘤治則基礎(chǔ)上依據(jù)現(xiàn)代藥理研究開發(fā)出的院內(nèi)制劑，具有多種抗腫瘤活性，臨床治療效果較好[3-4]。但消巖湯調(diào)控腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制仍有待研究。本研究發(fā)現(xiàn)了消巖湯對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，以及消巖湯對(duì)WNT/β-catenin通路的調(diào)控作用。為消巖湯治療肺腺癌的機(jī)制研究提供了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞 人肺腺癌A549細(xì)胞購自ATCC。

1.2 試劑 中藥消巖湯（制劑號(hào)40019）是天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由黃芪、太子參、夏枯草、姜黃、郁金、白花蛇舌草組成。其主要化學(xué)成分為黃芪多糖、太子參環(huán)肽、夏枯草皂苷、姜黃素、齊墩果酸、熊果酸等[5-10]。經(jīng)嚴(yán)格回流提取，其終濃度為含生藥0.3 g/mL。中藥消巖湯10 000 r/min，離心半徑10 cm，離心3 min，用0.22 μm過濾器除菌，用培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度的溶液。

WNT通路激動(dòng)劑SKL2001，WNT通路抑制劑XAV939，均購自美國(guó)Selleck.cn公司。CCK8（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，南京），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）提取試劑盒及擴(kuò)增試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京），凋亡試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京），雙熒光報(bào)告檢測(cè)試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，北京），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（Roche Applied Science，美國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 A549肺腺癌細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞使在含10%胎牛血清的RPMI-DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè) 將A549細(xì)胞接種在96孔板中，密度為1×108/L，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔100μL，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同藥物，實(shí)驗(yàn)分組 空白對(duì)照組 、梯度濃度消巖湯組（100、50、10g/L），梯度濃度 XAV939 組（10、5、1 μmol/L），梯度濃度SKL2001 組（20、10、50 μmol/L）、消巖湯（10 g/L）加SKL2001組（10 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后，取上清液60 μL到新的孔中，加入已經(jīng)配置好的30 μL的LDH檢測(cè)工作液，避光孵育30 min，測(cè)定A值（490 nm）。LDH釋放率（%）＝培養(yǎng)液LDH含量/（培養(yǎng)液LDH含量＋細(xì)胞裂解液LDH含量）×100%。

2.3 CCK8法檢測(cè) 將A549細(xì)胞接種于96孔板中（5 000個(gè)/孔）。實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組、為消巖湯組（濃度10g/L）、消巖湯（10g/L）加SKL2001組（10μmol/L），SKL2001 組 （10 μmol/L）、XAV939 組 （5 μmol/L）每孔 200 μL，對(duì)照組 加入 200 μL 培養(yǎng)基。培養(yǎng) 24、48、72 h后每孔加入20 μL CCK8溶液，37℃再孵育4 h后取出。檢測(cè)各孔吸光度（A值）波長(zhǎng)為490 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 藥物處理細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，加入PBS把細(xì)胞濃度調(diào)整到2×106/mL，每組取1 mL的細(xì)胞懸液，1 000 r/min，離心半徑8 cm，4℃離心10 min，在細(xì)胞沉淀中用冰預(yù)冷PBS洗滌兩次，在細(xì)胞中加入緩沖液200 μL混合均勻，依次加入 5 μL 碘化丙啶（PI）和 5 μL 的膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC），避光環(huán)境，室溫，靜置15 min，加300 μL緩沖液，用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定對(duì)照組、XAV939組、消巖湯組、WNT通路激動(dòng)劑SKL2001組及消巖湯聯(lián)合SKL2001組的細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 RT-PCR 檢測(cè) β-catenin、c-myc、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、中藥組和XAV939組，給藥后48 h提取細(xì)胞RNA，檢測(cè)mRNA濃度，反轉(zhuǎn)錄（85℃ 45 min，4℃ 10 min）合成 cDNA。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書，設(shè)定程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性 10 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 32 s，40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，2－ΔΔCt法計(jì)算 DNA 水平。反應(yīng)引物見表1。

表1 聚合酶鏈反應(yīng)引物Tab.1 Polymerase chain reaction primers

2.6 WNT通路活性檢測(cè) 向各組細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT信號(hào)傳導(dǎo)通路活性報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-OT或pGl3-OF，pRL-TK質(zhì)粒為熒光素酶內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)情況。檢測(cè)最終值為各給藥組WNT通路活性比值與內(nèi)對(duì)照的比值（WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路活性以pGL3-OT/pGL3-OF比值表示，以內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒組值作為對(duì)照值），所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS18.0軟件分析。數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 消巖湯抑制A549細(xì)胞增殖的效果及對(duì)LDH釋放的影響 為篩選最適給藥濃度，應(yīng)用LDH檢測(cè)梯度濃度XAV939組、消巖湯組、SKL2001組細(xì)胞毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，10 μmol/L XAV939組，100 g/L和 50 g/L消巖湯組 及 20 μmol/L SKL2001組均具有顯著的細(xì)胞毒性（P＜0.01）。所以為排除細(xì)胞毒性影響，選擇藥物濃度為5 μmol/L XAV939，10 g/L 消巖湯，10 μmol/L SKL2001（圖 1A）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK8檢測(cè)對(duì)照組、消巖湯組，消巖湯加SKL2001組、SKL2001組、XAV939組細(xì)胞存活率。SKL2001組與對(duì)照組比較，細(xì)胞存活率上升，說明SKL2001作用后，細(xì)胞增殖率升高。而消巖湯組、消巖湯+SKL2001組、XAV939組與對(duì)照組比較，均可抑制細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明3組均可以抑制細(xì)胞增殖。此外，消巖湯組細(xì)胞存活率明顯低于消巖湯+SKL2001組，表明消巖湯+SKL2001組對(duì)單獨(dú)消巖湯組細(xì)胞增殖的抑制有恢復(fù)作用（見圖1B）。

圖1 消巖湯抑制A549細(xì)胞增殖Fig.1 Xiaoyan Decoction inhibited the proliferation of A549 cells

3.2 消巖湯可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡 采用AnnexinVFITC/PI雙染法檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡情況，消巖湯組、消巖湯+SKL2001組與對(duì)照組細(xì)胞晚期凋亡率、細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。結(jié)果表明，消巖湯組作用后細(xì)胞晚期凋亡明顯增多，而各組早期凋亡率無明顯差異。SKL2001組與對(duì)照組比較細(xì)胞晚期凋亡率減少，表明WNT通路激動(dòng)劑SKL2001能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。消巖湯組與消巖湯聯(lián)合SKL2001組比較晚期凋亡率更高，表明消巖湯組促進(jìn)細(xì)胞凋亡能力優(yōu)于消巖湯聯(lián)合SKL2001組，SKL2001可以減弱消巖湯的促細(xì)胞凋亡作用。而消巖湯組與XAV939組比較晚期凋亡率更高，表明消巖湯組促進(jìn)細(xì)胞凋亡能力優(yōu)于XAV939抑制劑組。

表2 各組A549細(xì)胞凋亡率（±s）Tab.2 Apoptosis rate of A549 cells among groups（±s）%

表2 各組A549細(xì)胞凋亡率（±s）Tab.2 Apoptosis rate of A549 cells among groups（±s）%

注：與對(duì)照組 比較，*P＜0.05；與消巖湯組 比較，#P＜0.05。

組別 早期凋亡率 晚期凋亡率 細(xì)胞凋亡率對(duì)照組 0.032±0.005 0.160±0.003 0.193±0.005消巖湯組 0.040±0.003 0.515±0.042* 0.555±0.039*消巖湯+SKL2001 組 0.037±0.001 0.234±0.030*#0.271±0.029*#SKL2001 組 0.023±0.002 0.092±0.003*#0.115±0.004*#XAV939 組 0.042±0.001 0.488±0.032* 0.530±0.032*

3.3 WNT通路相關(guān)基因β-catenin、c-myc的表達(dá) 為探究消巖湯對(duì)WNT通路的作用。檢測(cè)了消巖湯組、WNT通路抑制劑XAV939組、對(duì)照組給藥48 h后β-catenin、c-myc的表達(dá)。結(jié)果消巖湯組、XAV939組與對(duì)照組比較，β-catenin表達(dá)明顯下調(diào)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，c-myc表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明消巖湯和XAV939均可以下調(diào)低β-catenin和c-myc表達(dá)，兩者作用效果無明顯差異。見圖2。

圖2 各組β-catenin、c-myc的DNA表達(dá)水平Fig.2 β-catenin and c-myc DNA expression levels in each group

3.4 消巖湯抑制WNT通路活性 轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒以檢測(cè)WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性，消巖湯、XAV939給藥后WNT通路的活性顯著降低，見圖3。與對(duì)照組比較，WNT通路活性明顯降低（P<0.05）。該檢測(cè)明確了消巖湯可以降低WNT通路的活性，同時(shí)也佐證了RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果與WNT通路相關(guān)性。

圖3 各組中WNT通路活性表達(dá)情況Fig.3 Activity expression of WNT pathway in each group

3.5 凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Caspase-3的表達(dá) 檢測(cè)了消巖湯和XAV939抑制劑給藥48 h后凋亡通路相關(guān)基因Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果消巖湯組、XAV939組與對(duì)照組比較，抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明消巖湯和XAV939均可以顯著降低Bcl-2表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖4 各組中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Caspase-3的DNA表達(dá)Fig.4 DNA expression of apoptosis-related genes Bcl-2 and Caspase-3 in each group

4 討論

WNT經(jīng)典通路又稱為Wnt/β-catenin通路，該通路激活后導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin穩(wěn)定并積累而不能被降解，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可激活下游靶基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄等[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌中，下調(diào)WNT通路可以提高癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[13]?；虮磉_(dá)圖譜分析表明，WNT信號(hào)傳導(dǎo)主要參與乳腺癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移過程[14]。在結(jié)直腸癌中，異常的WNT信號(hào)對(duì)腫瘤干細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和維持至關(guān)重要[15]。WNT通路抑制劑XAV939與紫杉醇聯(lián)合使用，可以通過抑制WNT信號(hào)傳導(dǎo)來抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移、血管生成和生長(zhǎng)[16]。WNT通路抑制劑—2，4-二氨基喹唑啉，可以抑制胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[17]。隨WNT/βcatenin信號(hào)在許多類型的癌癥中被激活被證實(shí)，WNT通路抑制劑也逐漸成為腫瘤治療新靶點(diǎn)[18-22].

近年來，無論是中藥單體還是中藥復(fù)方，在腫瘤治療中的作用越來越受到重視，其作用機(jī)制研究也越來越深入。研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh1可以通過WNT通路抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖[23]。靈芝三萜可以通過WNT通路調(diào)節(jié)下游靶蛋白 c-myc、Caspase-3，CyclinD-1表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡[24]。益肺逐積方通過下調(diào)EGFR、GPRR30蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[25]。消巖湯抗腫瘤機(jī)制可能是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[26]。

本課題根據(jù)“扶正、解毒、祛瘀”的肺癌治療原則，應(yīng)用臨床經(jīng)驗(yàn)方劑“消巖湯”治療肺腺癌，該制劑抗腫瘤活性強(qiáng)，臨床應(yīng)用廣泛[27]。其中，黃芪、太子參共為君藥，滋陰氣，扶正抗腫瘤；夏枯草、牡蠣、白花蛇舌草為臣藥，清熱解毒，軟堅(jiān)散結(jié)；佐以姜黃、郁金行氣散結(jié)，活血解瘀。全方扶正抗癌、解毒祛瘀，全面調(diào)節(jié)，祛邪而不傷正[28]。

本研究首先證實(shí)了消巖湯具有抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的生物學(xué)特點(diǎn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證消巖湯可以通過WNT通路抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，應(yīng)用消巖湯組聯(lián)合WNT通路激動(dòng)劑進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。首先采用CCK8測(cè)定對(duì)照組、XAV939組、SKL2001組、消巖湯組和消巖湯聯(lián)合SKL2001組細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)后者兩組均可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，但是消巖湯組細(xì)胞存活率明顯低于消巖湯聯(lián)合SKL2001組，說明消巖湯雖然可以抑制WNT通路活性，但是消巖湯聯(lián)合WNT通路激動(dòng)劑SKL2001后，抑制WNT通路的活性減弱了，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制增殖作用也削減了。進(jìn)一步采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組 A549細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)早期凋亡率各組間無明顯差異。消巖湯組以誘導(dǎo)細(xì)胞晚期凋亡為主，且該組晚期凋亡率和細(xì)胞凋亡率均高于消巖湯聯(lián)合SKL2001組，說明消巖湯組促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力優(yōu)于聯(lián)合組，推測(cè)聯(lián)合組通過恢復(fù)激活WNT通路降低了消巖湯的促腫瘤凋亡能力，進(jìn)一步證實(shí)了消巖湯通過下調(diào)WNT通路促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的藥理學(xué)效應(yīng)。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)消巖湯對(duì)WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用方式和機(jī)制，在裂解肺腺癌A549細(xì)胞核后，選取了RT-PCR方法和WNT通路活性分析檢測(cè)核RNA的表達(dá)和WNT通路活性表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組 A549細(xì)胞核β-catenin基因、c-myc基因表達(dá)較強(qiáng)；而經(jīng)消巖湯作用48 h后，β-catenin、c-myc基因的表達(dá)均下調(diào)（P<0.05）。提示消巖湯可能通過抑制胞質(zhì)內(nèi)βcatenin蛋白入核，下調(diào)WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，進(jìn)而減少下游靶基因c-myc的表達(dá)。WNT通路活性檢測(cè)也證實(shí)了消巖湯可以明顯降低WNT通路活性，其作用與WNT通路抑制劑XAV939組效果基本一致。此外，通過檢測(cè)各組凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)消巖湯可以顯著降低抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Caspase-3基因表達(dá)。由此，推測(cè)消巖湯可能是通過阻止β-catenin入核，下調(diào)了WNT通路活性，抑制肺腺癌細(xì)胞增殖。通過抑制WNT通路后，進(jìn)而下調(diào)下游靶基因c-myc表達(dá)，并通過對(duì)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Caspase-3的調(diào)控促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

綜上，扶正祛瘀解毒法經(jīng)典復(fù)方“消巖湯”對(duì)肺腺癌腫瘤細(xì)胞促凋亡和抗增殖作用明顯，且對(duì)WNT經(jīng)典通路抑制作用突出，但是本研究對(duì)機(jī)制調(diào)節(jié)的探討尚不完善，仍有待進(jìn)一步研究。