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    壯骨健膝方含藥血清對脂多糖誘導(dǎo)兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應(yīng)的效應(yīng)濃度研究

    2022-04-21 03:30:22郭潔梅張英杰蘇友新
    福建中醫(yī)藥 2022年3期
    關(guān)鍵詞:壯骨含藥滑膜炎

    林 震,郭潔梅,陳 鵬,肖 艷,張 鵬,張英杰,蘇友新*

    (1.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350122;2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,福建 福州 350101;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,福建 福州 350122)

    90%膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)患者伴有不同程度的滑膜炎癥,且滑膜炎癥貫穿KOA發(fā)病的始終,其炎癥進展與KOA的病情發(fā)展呈正相關(guān)[1]。課題組前期從動物組織層面展開了研究,發(fā)現(xiàn)具有“痹痿同治”功效的壯骨健膝方可有效抑制兔KOA滑膜炎癥[2-4]?;ぞ奘杉毎鳛镵OA滑膜炎中的主要參與者[5],可用于壯骨健膝方抗炎功效的研究。血清藥理學(xué)是以機體含藥血清代替藥物干預(yù)細胞的實驗方法,被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的機制研究[6]。然而不同濃度的含藥血清對細胞的影響是多樣的[7],高濃度血清在起效的同時可能會對細胞產(chǎn)生毒性作用,低濃度血清可能由于藥效物質(zhì)濃度較低,達不到起效濃度,從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在開展含藥血清干預(yù)細胞的相關(guān)研究時,有必要對效應(yīng)濃度進行摸索。故本研究通過CCK8法和ELISA法研究壯骨健膝方含藥血清干預(yù)LPS誘導(dǎo)兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應(yīng)的效應(yīng)濃度,為后續(xù)相關(guān)實驗提供依據(jù)。

    1 實驗材料

    1.1 實驗動物與細胞 3月齡普通級新西蘭大白兔12只,體質(zhì)量(2.0±0.25)kg,由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供,許可證編號:SCXK(滬)2017-0008。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心代購并飼養(yǎng),許可證號:SYXK(閩)2014-0006。兔膝滑膜巨噬細胞由上海青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供,貨號:BFN2101831。

    1.2 實驗藥物 壯骨健膝方組成:骨碎補15 g,杜仲9 g,川牛膝12 g,生地黃15 g,獨活6 g,雞血藤15 g,秦艽9 g,徐長卿9 g,土鱉蟲6 g。上述藥材均購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂,并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院曾建偉副研究員鑒定,符合《中華人民共和國藥典》要求。全方中藥飲片置于600 mL水中浸泡20 min后,用武火煎煮至沸騰,然后轉(zhuǎn)文火煎煮15 min,倒出藥液。再次加水400 mL,煎煮30 min。將2次所煎得的藥液混合,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成含生藥1 g/mL的壯骨健膝方藥液備用。

    1.3 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司,批號:AE29163339);胎牛血清(澳洲ExCell Bio公司,批號:11G362);烏拉坦(上海源葉生物科技有限公司,批號:Z28N10Y104506);脂多糖(中國Biosharp公司,貨號:BS007);兔白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)和MMP-13 ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號:2112023、2112015、2112030、2112033);CCK8試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號:16J29C60)。

    1.4 實驗儀器 ELX800型全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);IC-1000型Countstar細胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司);DMIL/DFC295型倒置相差顯光學(xué)微鏡(德國LEICA公司);TDZ4A-WS型低速離心機(湖南湘儀儀器有限公司);E163302型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 含藥血清與空白血清制備 12只新西蘭大白兔,隨機分為壯骨健膝方組6只和空白組6只,根據(jù)前期研究并參照人與動物體質(zhì)量折算的等效劑量[8],壯骨健膝方組按4.58 mL/(kg·d)予壯骨健膝方藥液灌胃,空白組予等體積生理鹽水灌胃,分上下午2次,持續(xù)3 d。于末次給藥后1 h,應(yīng)用20%烏拉坦(5 mL/kg)對兔進行腹腔注射麻醉,待角膜反射消失后行腹主動脈采血,全血靜置于4℃冰箱4 h后,2 500 r/min離心30 min,分離血清,將同組血清混合,56℃水浴滅活30 min,用0.22μm過濾器過濾,分裝即得。

    2.2 不同濃度的血清完全培養(yǎng)液制備 取離心管,依次加入細胞培養(yǎng)液、壯骨健膝方含藥血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液,配制成5%、10%、15%、20%、25%壯骨健膝方含藥血清完全培養(yǎng)液(以下簡稱含藥完培),同法配制相同濃度空白血清完全培養(yǎng)液(以下簡稱空白完培)和10%胎牛血清完全培養(yǎng)液(以下簡稱普通完培),于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以(±s)表示,數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,多組間比較采用單因素方差分析,方差齊用LSD檢驗,方差不齊時采用Games-Howell檢驗,不符合正態(tài)分布,采用非參數(shù)檢驗。

    2.4 CCK8法篩選含藥血清干預(yù)濃度實驗 取生長狀況良好的兔膝滑膜巨噬細胞,按7×103個細胞/孔的密度接種于96孔板,隨機分為對照組、空白血清組及含藥血清組,分別采用普通完培、含藥完培(5%、10%、15%、20%、25%)和空白完培(5%、10%、15%、20%、25%)培養(yǎng)24 h,棄去原培養(yǎng)液,加入10%CCK8溶液避光孵育2 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定每孔的吸光度。實驗結(jié)果顯示,5%、10%、15%含藥血清組細胞活性與同濃度下空白血清組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),故篩選出對細胞沒有毒性的3個含藥完培濃度(5%、10%、15%)作為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度,見表1。

    表1 不同血清培養(yǎng)液干預(yù)后兔膝滑膜巨噬細胞活性比較(±s)

    表1 不同血清培養(yǎng)液干預(yù)后兔膝滑膜巨噬細胞活性比較(±s)

    注:與同濃度空白血清組比較,1)P<0.05。

    組別對照組空白血清組含藥血清組n6 66666 66666含藥血清干預(yù)濃度/%-5 10 15 20 25 5 10 15 20 25細胞活性/%100.00±0.00 99.86±0.75 98.69±1.28 98.58±1.69 97.32±0.89 99.67±1.12 99.16±1.03 99.68±1.25 98.13±0.87 88.26±0.791)87.79±1.361)

    2.5 篩選LPS誘導(dǎo)兔膝滑膜巨噬細胞致炎時間實驗 兔膝滑膜巨噬細胞以1×105個細胞/孔的密度接種于24孔板,隨機分為空白組和LPS組??瞻捉M加入普通完培,LPS組加入含1.0μg/mL的LPS培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后,收集各組細胞上清液,ELISA法檢測IL-1β、TNF-α含量。結(jié)果表明各組別上清液中于各檢測時間點均可見IL-1β、TNF-α的分泌。與空白組比較,LPS組各時間點的兔膝滑膜巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量均明顯升高(P<0.05);LPS組內(nèi)各時間點比較,刺激12 h后滑膜巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量最高(P<0.05),見表2。結(jié)合文獻[9],以IL-1β、TNF-α含量較高的12 h作為后續(xù)實驗LPS誘導(dǎo)兔膝滑膜巨噬細胞致炎的時間。

    表2 空白組和LPS組不同時間干預(yù)后細胞上清液IL-1β、TNF-α含量比較(±s)

    表2 空白組和LPS組不同時間干預(yù)后細胞上清液IL-1β、TNF-α含量比較(±s)

    注:與相同時間的空白組比較,1)P<0.05;與12 h LPS組比較,2)P<0.05;與24 h LPS組比較,3)P<0.05;與36 h LPS組比較,4)P<0.05。

    組別空白組LPS組干預(yù)時間12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h IL-1β/(ng/L)12.55±1.01 13.05±1.51 13.90±1.34 11.50±0.33 41.20±1.341)26.70±0.671)2)24.34±0.331)2)19.29±3.371)2)3)4)TNF-α/(pg/L)284.89±10.00 292.90±26.01 280.89±18.01 290.90±4.00 410.99±40.031)356.94±22.011)2)346.94±8.011)2)338.93±12.011)2)

    2.6 ELISA法檢測各組細胞上清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量 兔膝滑膜巨噬細胞以1×105個/孔接種于6孔板,隨機分為空白組、模型組和5%、10%、15%含藥血清組,空白組添加10%空白完培,模型組和5%、10%、15%含藥血清組經(jīng)1.0μg/mL的LPS培養(yǎng)液致炎12 h后,模型組添加10%空白完培,5%、10%、15%含藥血清組分別添加5%、10%、15%含藥完培,24 h后收集各組細胞上清液,ELISA法檢測各組上清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量。結(jié)果顯示,各組均可見IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13的分泌,與空白組比較,模型組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,10%、15%含藥血清組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量均明顯降低(P<0.05)。見表3。

    表3 各組兔膝滑膜巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較(n=3,±s)

    表3 各組兔膝滑膜巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較(n=3,±s)

    注:與空白組比較,1)P<0.05;與模型組比較,2)P<0.05。

    組別空白組模型組5%含藥血清組10%含藥血清組15%含藥血清組IL-1β/(ng/L)51.56±2.56 96.43±2.731)93.13±0.87 77.25±1.962)74.43±1.592)TNF-α/(pg/mL)456.88±11.25 587.67±8.561)582.33±15.22 526.94±18.522)519.17±15.892)MMP-3/(μg/L)18.97±1.57 44.35±1.011)41.95±1.67 33.87±0.892)31.86±1.362)MMP-13/(μg/L)130.61±3.49 220.94±4.011)217.18±3.78 173.13±4.212)168.50±2.712)

    3 討論

    KOA的發(fā)病雖以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹?,但其病理變化并不僅限于軟骨局部[10-11]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),滑膜炎癥與KOA的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),滑膜炎癥過程中各種因素反復(fù)刺激滑膜組織,促使炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等被大量釋放,它們在加重滑膜炎癥反應(yīng)的同時,又反復(fù)刺激關(guān)節(jié)軟骨,造成軟骨的損害,進一步加劇KOA的進展[12-14]。

    壯骨健膝方是蘇友新教授根據(jù)KOA“痹痿同病”病機特點所創(chuàng)立的效驗方,該方由骨碎補、杜仲、川牛膝等藥物組成,具有補肝腎、強筋骨、祛風(fēng)濕、止痹痛之功用,臨床療效顯著[2-3]。本研究采用血清藥理學(xué)的方法,通過LPS誘導(dǎo)兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應(yīng),研究壯骨健膝方含藥血清抑制滑膜炎癥的效應(yīng)濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5%、10%、15%壯骨健膝方含藥血清對兔膝滑膜巨噬細胞無毒性作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),10%、15%壯骨健膝方含藥血清可有效抑制LPS誘導(dǎo)的兔膝滑膜巨噬細胞炎性因子IL-1β和TNF-α以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3和MMP-13的生成,發(fā)揮抑制滑膜炎癥的功效,為該方含藥血清的效應(yīng)濃度,且二者抗炎作用相當(dāng)。而5%壯骨健膝方含藥血清無顯著的抗炎作用,推測可能是血清濃度較低,血清中的有效成分濃度尚未達到起效水平所致。

    綜上所述,本實驗結(jié)果表明10%、15%壯骨健膝方兔含藥血清為干預(yù)LPS誘導(dǎo)兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應(yīng)的效應(yīng)濃度,由于二者抗炎作用相近,為節(jié)約血清成本,故建議后續(xù)研究采用10%含藥血清更為適宜。

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