褪黑素通過介導(dǎo)線粒體自噬改善糖尿病心肌梗死后心肌損傷

焦陽，王繼航，李影，沈建，侯小玲，沈明志，付振虹*

(1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心心血管病醫(yī)學(xué)部，北京 100853；3中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院心血管內(nèi)科，海南 三亞 572013)

《中國心血管病報(bào)告2020》顯示我國心血管病人數(shù)3.3億，死亡率居首位，其中冠心病(coronary heart disease, CHD)患者1 139萬人。雖然藥物和介入手術(shù)治療降低了心肌梗死(myocardial infarction, MI)相關(guān)死亡的發(fā)生率，但由于心肌細(xì)胞不可再生，急性缺血造成的不可逆心肌細(xì)胞凋亡和梗死灶的形成，成為急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)預(yù)后不佳的重要因素[1]。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，心肌梗死后28 d的死亡率是非糖尿病患者的2倍[2]。線粒體損傷是MI后心肌受損的關(guān)鍵信號機(jī)制，受損的線粒體通過自噬途徑被清除，進(jìn)而維持線粒體質(zhì)量和數(shù)量的穩(wěn)定[3]。DM患者心肌梗死后線粒體自噬作用減弱，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損嚴(yán)重，加重心肌細(xì)胞凋亡。褪黑素(melatonin, Mel)是一種有效的抗氧化劑，對包括糖尿病、感染性疾病、代謝綜合征等多種疾病均有益處[4]。Mel能有效減輕線粒體功能障礙，抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞的損傷。然而，Mel是否通過增強(qiáng)線粒體自噬而發(fā)揮MI后心肌保護(hù)作用，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步明確，特別是在合并DM的AMI中的作用，還未見確切報(bào)道。本研究通過構(gòu)建小鼠糖尿病急性心肌梗死和細(xì)胞高糖高脂缺氧模型，觀察Mel通過增強(qiáng)線粒體自噬減少心肌細(xì)胞損傷，從而改善心臟功能的潛在機(jī)制，旨在為合并DM的AMI患者提供新的臨床治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

褪黑素、鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)(默克公司, 美國)；異氟烷(北京陽光英銳生物有限公司)；棕櫚酸(北京金鑫博達(dá)生物技術(shù)中心)；一抗：B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)抗體、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase-3)抗體、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl2-associated X, Bax)抗體和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(microtubules associated protein 1 light chain3-β, LC3)抗體、死骨片蛋白1(sequestosome 1, SQSTM1/P62)抗體、帕金蛋白(Parkin)抗體，β-肌動蛋白(β-actin)抗體和二抗(北京乾兆有限公司，中國)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；其他由解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科和心外科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組

本實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)動物為雄性C57BL/6J小鼠(6～8周齡)，體質(zhì)量20 g左右，均購自斯貝福(北京)生物有限公司。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物使用指南(No.8523, revised 1996)實(shí)施，并由中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將小鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(sham組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病心肌梗死組(DMI組)、糖尿病心肌梗死+褪黑素組(DMI+Mel組)，每組8只。DMI+Mel組小鼠在心肌梗死術(shù)后經(jīng)過腹腔注射方法補(bǔ)充Mel，劑量為50 mg/(kg·d)，直到第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 建立小鼠模型

1.3.1 糖尿病模型 高脂飼料(脂肪含量60%, 北京斯貝福生物有限公司)連續(xù)喂養(yǎng)小鼠4周，禁食12 h后，經(jīng)腹腔注射0.1 ml濃度為1%的鏈脲霉素(streptozotocin, STZ)溶液,連續(xù)5 d。STZ溶液使用0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液配置。注藥后2 h恢復(fù)飲食，第6天早上測尾靜脈空腹血糖，空腹血糖>11.1 mmol/L則建模成功。0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液配置方法如下。A液：一水合檸檬酸2.1 g溶于100 ml雙蒸水(double distilled water, ddH2O)；B液：檸檬酸鈉2.94 g溶于100 ml ddH2O，用時現(xiàn)配，A液與B液按照體積123∶77混合使用，pH值4.2～4.5。

1.3.2 急性心肌梗死模型 術(shù)前將小鼠胸前區(qū)毛發(fā)褪去。小鼠置于小動物氣體麻醉機(jī)中用1.5%異氟烷(氧氣氣化混合)麻醉2 min。麻醉好的小鼠置于手術(shù)臺上，底部放加熱墊保持體溫，整個手術(shù)過程持續(xù)異氟烷氣體麻醉。固定小鼠四肢于手術(shù)板，沿胸骨尖至左側(cè)腋下剪開皮膚約1.5 cm，5-0手術(shù)縫線荷包縫合切口但不收緊，鈍性分離胸前肌群，尖口鉗于第4肋間打開肋間隙，左手手指將心臟推出體外，暴露左心耳，從左心耳下緣2～3 mm處進(jìn)針，以7-0手術(shù)縫線結(jié)扎冠狀動脈前降支，可見心臟前壁和心尖組織變白，將心臟還納回胸腔，迅速關(guān)閉胸腔，擠壓胸腔充分排氣，防止氣胸，收緊荷包打結(jié)。從擠出心臟到還納心臟整個過程控制在30 s左右，不要超過1 min。術(shù)后小鼠注意保暖，直至蘇醒活動自如。Sham組、DM組與上述過程相同，只是不結(jié)扎冠狀動脈。

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

在杜爾貝科改良培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle′s medium, DMEM)內(nèi)加入10%的胎牛血清、100 U/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素，以下簡稱完全培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基在95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱(37℃，CO2含量為5%)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動物實(shí)驗(yàn)對應(yīng)，分為以下4組。(1)對照組(CON組)：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；(2)高糖高脂組(HG/HF組)：在HG/HF培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基中添加33 mmol/L葡萄糖和500 μmol/L棕櫚酸)中培養(yǎng)；(3)高糖高脂缺氧組(HG/HF+hypoxia組)：細(xì)胞在HG/HF培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后在缺氧孵箱(孵箱內(nèi)充滿94%N2，5%CO2和1%O2的氣體，濕度為95%)孵育6 h；(4)高糖高脂缺氧+Mel組(HG/HF+hypoxia+Mel組)：細(xì)胞在HG/HF培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，加入100 μmol/L褪黑素后缺氧處理6 h。每組重復(fù)5遍。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 多普勒超聲評價小鼠心功能 在術(shù)后第4周行超聲心動圖檢查。小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后置于平臺上利用小動物超聲(西門子公司，美國)檢測心臟功能。采集所有小鼠的M型超聲心動圖、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVESD)和左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD), 這些指標(biāo)均通過連續(xù)測量3個心動周期后取平均值得出。

1.5.2 心臟組織病理學(xué)檢測 將小鼠麻醉后處死，取出心臟，用磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline，PBS)充分清洗血凝塊后制成石蠟包塊，切成3～5 μm的切片，然后分別進(jìn)行HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變、Masson染色評價心肌纖維化程度、原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)熒光染色觀察心肌凋亡情況。(1)HE染色。組織切片脫蠟后使用蘇木素染液染細(xì)胞核、伊紅染液染胞漿。無水乙醇脫水后，使用二甲苯透明。封片后在顯微鏡下觀察。(2)Masson染色。組織切片脫蠟后使用重鉻酸鉀染液染色。使用鐵蘇木素染液染細(xì)胞核，漂洗干凈后使用麗春紅酸性品紅染液染色。冰醋酸漂洗后使用磷鉬酸水溶液浸染，放入苯胺藍(lán)染液中染色。分化、脫水、透明處理后封片，在顯微鏡下觀察。圖像中藍(lán)色區(qū)域是膠原陽性染色，排除心內(nèi)膜、心外膜和血管周圍纖維化的藍(lán)色區(qū)域，心肌間質(zhì)纖維化的面積使用藍(lán)染區(qū)域的面積占整個圖像的百分比來計(jì)算。(3)TUNEL染色。將組織切片脫蠟后滴加蛋白酶K處理。按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒使用說明配制TUNEL檢測液。處理好的樣品上加TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育后加入活細(xì)胞染色液(Hoechst 33342)染細(xì)胞核。封片后在熒光顯微鏡下觀察。視野中綠色熒光代表凋亡細(xì)胞，藍(lán)色熒光是使用Hoechst染液染的正常心肌細(xì)胞核，通過計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比(視野中凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞，%)評估細(xì)胞凋亡程度。

1.5.3 心肌細(xì)胞凋亡檢測 通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的含量。將H9c2細(xì)胞消化、勻漿、裂解，提取蛋白，用BCA蛋白定量法檢測蛋白濃度，然后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜。在搖床上室溫封閉1 h，TBST緩沖液漂洗后，分別加入抗Bax(1∶5000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)和β-actin(1∶5 000)一抗孵育，4 ℃過夜，加入兔抗鼠IgG(1∶5 000)二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像。使用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.5.4 細(xì)胞內(nèi)ATP濃度檢測 吸去培養(yǎng)液，加入裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃ 12 000 g離心5 min后取上清液用于檢測，加100 μl ATP檢測工作液到檢測管，室溫放置3～5 min后加入20 μl樣品，至少間隔2 s后，用化學(xué)發(fā)光儀測定相對發(fā)光單位(relative light unit, RLU)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度。

1.5.5 線粒體自噬檢測 Western blotting法檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白的含量，具體方法同上。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入LC3抗體(1∶1 000)、P62抗體(1∶10 000)、Parkin抗體(1∶2 000)、β-actin抗體(1∶5 000)一抗孵育，4 ℃過夜，加入兔抗鼠IgG(1∶5 000)二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像，對條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 4組小鼠心功能和心臟結(jié)構(gòu)變化

在心肌梗死術(shù)后4周，使用小動物超聲測量各組小鼠的LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD評估心功能和心臟結(jié)構(gòu)變化。與sham組相比，DM組小鼠LVEF、LVFS有所下降，LVESD和LVEDD指標(biāo)升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DMI組和DMI+Mel組小鼠LVEF、LVFS均較sham組明顯下降，LVESD、LVEDD較sham組明顯升高，DMI+Mel組這4項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于DMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖1，表1)。

表1 心肌梗死術(shù)后4周4組小鼠超聲心動圖指標(biāo)情況比較

圖1 心肌梗死術(shù)后4周4組小鼠心臟功能情況

2.2 4組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)、間質(zhì)纖維化程度和心肌細(xì)胞凋亡情況比較

在心肌梗死術(shù)后4周，對小鼠心臟進(jìn)行組織切片染色(HE染色)，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，測量心肌細(xì)胞橫截面積大小。Masson染色評價心肌間質(zhì)纖維化程度。結(jié)果顯示，DM組心肌細(xì)胞橫截面積和心肌間質(zhì)纖維化程度較sham組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但DMI組和DMI+Mel組心肌細(xì)胞橫截面積和心肌間質(zhì)纖維化程度均顯著增加，而Mel可以顯著減輕心肌細(xì)胞橫截面積的增大和心肌間質(zhì)纖維化的程度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

通過TUNEL熒光染色評估心肌細(xì)胞凋亡情況。Sham組和DM組心肌細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DMI組和DMI+Mel組細(xì)胞凋亡率均顯著高于sham組和DM組，但DMI+Mel組細(xì)胞凋亡率低于DMI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖2，表2)。

圖2 心臟組織切片染色評估心肌細(xì)胞橫截面積、間質(zhì)纖維化和心肌細(xì)胞凋亡情況

表2 4組小鼠心肌細(xì)胞橫截面積、間質(zhì)纖維化面積和細(xì)胞凋亡率比較

2.3 4組小鼠H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

與CON組相比，HG/GF組、HG/HF+hypoxia組和HG/HF+hypoxia+Mel組Bax和Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HG/GF組和HG/HF+hypoxia+Mel組相比，HG/HF+hypoxia組Bax和Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；圖3)。與TUNEL染色結(jié)果相一致，Mel在高糖高脂和缺氧加重心肌細(xì)胞凋亡的過程中起保護(hù)作用。

圖3 4組小鼠H9c2細(xì)胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況

2.4 4組小鼠H9c2細(xì)胞內(nèi)ATP濃度比較

細(xì)胞內(nèi)ATP含量是反映線粒體功能的一項(xiàng)敏感指標(biāo)[5]。為了測定線粒體的功能，本研究檢測了4組小鼠細(xì)胞中ATP的平均濃度。與CON組相比，HG/HF+hypoxia組的ATP濃度從(7.92±0.29)μmol/L下降至(0.35±0.12)μmol/L，而加入Mel后，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度升高至(3.78±0.27)μmol/L。因此，Mel可以減輕高糖高脂和缺氧造成的ATP含量降低，有效改善線粒體因高糖高脂和缺氧所造成的損傷(圖4)。

圖4 4組小鼠H9c2細(xì)胞內(nèi)ATP濃度情況

2.5 4組小鼠H9c2細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

LC3和P62是線粒體自噬相關(guān)蛋白，自噬小體形成時，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會被酶解掉一段多肽，形成膜型LC3(即LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高、P62表達(dá)下調(diào)[6]。Parkin是線粒體自噬特異性蛋白，當(dāng)線粒體自噬增強(qiáng)時，Parkin表達(dá)升高[7]。本研究結(jié)果顯示，高糖高脂和缺氧損傷顯著降低了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Parkin蛋白的表達(dá)，增加了P62的表達(dá)，表明線粒體自噬減弱，而HG/HF+hypoxia+Mel組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Parkin蛋白表達(dá)水平顯著高于其余3組，P62表達(dá)顯著低于其余3組(P<0.05；圖5)，因此Mel可以增強(qiáng)線粒體自噬水平。

圖5 4組小鼠H9c2細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，在DM狀態(tài)下，給予Mel可以減輕MI導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化，進(jìn)而改善心臟功能。進(jìn)一步完善細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Mel在糖尿病心肌梗死的益處在于Bax、Caspase-3、Bcl-2、LC3、P62、Parkin和細(xì)胞內(nèi)ATP水平的改變。本研究結(jié)果顯示，Mel可以通過增強(qiáng)線粒體自噬，減輕高糖高脂和缺氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，從而改善糖尿病心肌梗死后的心臟功能，為合并糖尿病的急性心肌梗死患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

目前，我國DM患者人數(shù)超過1.4億，持續(xù)位居世界首位。DM是CHD的等危癥，研究顯示，DM患者罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)是非DM患者的2倍[8]，其可能機(jī)制是由于DM加重心臟的微循環(huán)損傷和心肌細(xì)胞能量代謝障礙[9]?，F(xiàn)有的糖尿病心肌梗死治療策略中，缺乏發(fā)病早期心肌細(xì)胞保護(hù)藥物的相關(guān)研究。減輕梗死后缺血所誘發(fā)的心肌損傷是提高糖尿病心肌梗死患者臨床獲益、改善長期預(yù)后的關(guān)鍵手段。

線粒體是真核生物產(chǎn)生能量的細(xì)胞器，是細(xì)胞的“動力工廠”，在調(diào)節(jié)代謝、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等方面的作用十分重要[10，11]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體損傷和凋亡是心肌梗死后心肌受損的關(guān)鍵信號機(jī)制，在心肌梗死的發(fā)病過程中，缺血的心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)增多、Ca2+紊亂、細(xì)胞能量代謝受損，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常，而高血糖加重線粒體的損傷[12,13]。因此，尋找保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的治療靶點(diǎn)可能是減輕糖尿病心肌梗死后心肌損傷的核心。線粒體自噬是一個細(xì)胞識別并清除受損細(xì)胞器的過程，線粒體發(fā)生去極化損傷后通過溶酶體介導(dǎo)降解，對結(jié)構(gòu)和功能異常的線粒體進(jìn)行清除和溶解，進(jìn)而維持線粒體質(zhì)量和數(shù)量的穩(wěn)定[14]。國內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，上調(diào)線粒體自噬可以減輕靶細(xì)胞凋亡[15-17]。本研究中，在高糖高脂和缺氧的狀態(tài)下，線粒體自噬水平明顯降低，這與相關(guān)報(bào)道顯示的在糖尿病患者中線粒體自噬的細(xì)胞保護(hù)作用被顯著抑制這一結(jié)果一致[18]。

研究表明，Mel分泌不良會增加罹患DM和AMI的風(fēng)險(xiǎn)，這也意味著Mel在預(yù)防代謝性疾病的發(fā)生方面存在潛在益處[19,20]。在多種疾病模型中，褪黑素受體激動劑參與調(diào)節(jié)線粒體自噬，發(fā)揮對疾病的保護(hù)作用。例如在神經(jīng)細(xì)胞中，Mel上調(diào)線粒體自噬相關(guān)的蛋白質(zhì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、自噬相關(guān)5蛋白(autophagy related 5, Atg5)、線粒體自噬標(biāo)記Parkin 和同源性磷酸酶誘導(dǎo)激酶1(phosphatase and tensin homolog induced putative kinase 1, PINK-1)的表達(dá)，抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎癥體激活，發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[21]。然而，在合并糖尿病的心肌梗死模型中，Mel是否通過增強(qiáng)線粒體自噬發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用，還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究通過構(gòu)建小鼠糖尿病心肌梗死模型和細(xì)胞高糖高脂缺氧模型，探討Mel對糖尿病心肌梗死后心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。研究結(jié)果表明：(1)Mel可以減輕糖尿病心肌梗死小鼠的心肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化，改善心臟功能；(2)在高糖高脂缺氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞ATP水平降低，細(xì)胞凋亡增加，而Mel可以逆轉(zhuǎn)這種不良結(jié)局；(3)在高糖高脂缺氧狀態(tài)下，線粒體自噬水平顯著降低，加入Mel后線粒體自噬的水平顯著升高。綜上所述，糖尿病心肌梗死后，心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬水平降低，心肌細(xì)胞凋亡加劇，補(bǔ)充Mel可以增強(qiáng)線粒體自噬，減輕心肌細(xì)胞損傷，從而改善糖尿病心肌梗死后的心臟功能。本研究的結(jié)果將有助于更好地探索糖尿病心肌梗死治療的新靶點(diǎn)及Mel在其中潛在的臨床應(yīng)用價值。