產氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度研究*

夏 天 ，崔 迎 ，任文鑫 ，楊曉莉 ，毋堃杰 ，李宏鐸 △

（1. 陜西省西安市食品藥品檢驗所·國家藥品監(jiān)督管理局重點實驗室，陜西 西安 710054； 2. 陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

水分活度由澳大利亞科學家Scott 于1953 年提出，是指產品水蒸氣壓與同溫度下純水蒸氣壓的比值［1-2］。其在本質上可理解為結合水含量越高，水分活度越低［2］，可用于微生物生長繁殖的水越少［3-4］。作為微生物可利用水量度的重要參數，水分活度也是影響微生物生長的關鍵因素［5］，在食品和化妝品的微生物控制方面已有應用［6-7］。2006 年，《美國藥典》1112 章節(jié)中已發(fā)布水分活度測定在非無菌制劑中的應用指導原則［8］。本研究中參考該指導原則中產氣莢膜梭菌生長所需的最低水分活度（0.95）及文獻［9 - 12］，分別以氯化鈉、葡萄糖和甘油作為水分活度調節(jié)劑，調節(jié)培養(yǎng)基的水分活度值在 0.90～0.99 范圍內［2，13］，測定產氣莢膜梭菌生長所需的最低水分活度，以為《中國藥典》相關內容的增訂提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與菌種

儀器：Aqualab 4TE 型水分活度儀（美國Meter Group Inc.）；THERMO1378 型生物安全柜（賽默飛世爾科技有限公司）；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SX - 500 型高壓蒸汽滅菌器（日本Tomy公司）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為10 mg）。

試劑：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM，北京三藥科技開發(fā)公司，批號為170808）；胰胨- 亞硫酸鹽- 環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（TSC，北京路橋技術有限責任公司，批號為171108；氯化鈉（批號為20180509），丙三醇（批號為20180223），均購自國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號為20180110）。

菌種：產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，廣東環(huán)凱生物科技有限公司，編號為ATCC 13124，工作用菌株為第3代）。

1.2 方法

不同水分活度培養(yǎng)基的配制：分別以氯化鈉、葡萄糖及甘油作為水分活度調節(jié)劑，并測定其滅菌后的水分活度值，制備不同水分活度的FTM。以3 種水分活度調節(jié)劑的質量對培養(yǎng)基水分活度值繪制標準曲線。

產氣莢膜梭菌菌液的制備：將產氣莢膜梭菌轉接至FTM中，（36±1）℃厭氧培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水稀釋，制備成不同濃度的菌懸液。

定性試驗：按標準曲線，配制水分活度在0.90～0.99 范圍內梯度為0.01 的系列FTM；同時配制不調節(jié)水分活度的FTM，作為對照組（T0）。取產氣莢膜梭菌菌懸液，分別加入上述FTM 中，每管裝量20 mL，使菌液濃度達到102cfu/mL。各組培養(yǎng)物置（36±1）℃溫度條件下厭氧培養(yǎng)30 d，逐日觀察生長情況，目測判斷，渾濁表明有生長，澄清表明未生長。

定量試驗：通過定性試驗，初步獲得產氣莢膜梭菌在不同介質的FTM 中生長所需最低水分活度，選擇最低水分活度附近3 個水平，即低于水分活度限值0.01（T1）、水分活度限值（T2）和高于水分活度限值0.01（T3），同時配制不調節(jié)水分活度的FTM，裝量均為100 mL，接種產氣莢膜梭菌菌懸液，使菌液濃度達到102cfu/mL。于（36 ± 1）℃溫度條件下培養(yǎng)，分別于0，2，16，18，20，24，42，48，72，90，120，144 h時以TSC 培養(yǎng)計數。以測得平均菌落數的對數值（logcfu）對時間（t，h）作圖，繪制生長曲線，重復3次。

2 結果

2.1 不同介質調節(jié)FTM 水分活度的標準曲線繪制

由圖1 可知，隨著氯化鈉、葡萄糖和甘油質量的增加，水分活度呈下降趨勢。相同水分活度時，3 種水分活度調節(jié)劑質量差異較大。當水分活度為0.98時，每100 mL FTM 中分別需要添加氯化鈉3.51 g、葡萄糖13.80 g、甘油9.08 g。

圖1 FTM中3種水分活度調節(jié)劑質量-水分活度標準曲線A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.1 Standard curves of quality - water activity of three water activity regulators in FTM

2.2 定性試驗結果

以氯化鈉、葡萄糖和甘油為水分活度調節(jié)劑的FTM 中，產氣莢膜梭菌的最低生長水分活度分別為0.98，0.98，0.95。這與《美國藥典》中產氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度（0.95）［8］一致。

2.3 定量試驗結果

產氣莢膜梭菌在3 種不同水分活度調節(jié)劑中的生長曲線見圖2。從生長曲線來看，以氯化鈉和葡萄糖調節(jié)FTM 水分活度時，產氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度均為0.98；以甘油作調節(jié)劑時為0.95，與定性試驗結果一致。根據定性試驗結果，以氯化鈉和葡萄糖調節(jié)水分活度時，T1，T2，T3應分別為0.97，0.98，0.99，但T3與對照組水分活度相同。為保證試驗完整性，并探討產氣莢膜梭菌在水分活度限值以下的生長情況，本研究中將氯化鈉和葡萄糖介質中T1，T2，T3調整為0.96，0.97，0.98。

圖2 不同介質FTM中產氣莢膜梭菌的生長曲線A.NaCl B.Glucose C.GlycerolFig.2 Growth curves of Clostridium perfringens in FTM with different media

由圖2 可知，水分活度會影響產氣莢膜梭菌的生長。產氣莢膜梭菌在水分活度較高時生長較旺盛，在水分活度較低時生長緩慢，低于一定值時則停止生長甚至死亡。由圖2 A和圖2 B可知，產氣莢膜梭菌在水分活度大于0.98時生長較快，低于0.98時不生長，且3次試驗結果一致，重復性良好，表明以氯化鈉和葡萄糖調節(jié)水分活度，產氣莢膜梭菌最低生長水分活度為0.98。由圖2 C可知，當水分活度為0.96時，生長較快，生長趨勢與對照組相似；當水分活度為0.95 時，雖有生長現(xiàn)象，但其生長趨勢明顯弱于0.96，表明以甘油調節(jié)水分活度，產氣莢膜梭菌最低生長水分活度為0.95。

由圖2可知，水分活度與產氣莢膜梭菌的菌液濃度呈正相關，產氣莢膜梭菌的菌落數隨水分活度的降低而減少。同時，水分活度為0.98 時，氯化鈉的菌液濃度對數值略低于對照組，葡萄糖的低于氯化鈉；甘油在水分活度為0.95 時的菌液濃度對數值顯著低于對照組，第2次試驗中表現(xiàn)尤為明顯。不同介質調節(jié)水分活度會影響產氣莢膜梭菌生長遲緩期的長短。由圖2 A 可知，水分活度為0.98時，產氣莢膜梭菌的遲緩期為0～20 h。由圖2 B 可知，水分活度為0.98 時，產氣莢膜梭菌的遲緩期為0～40 h，且其生長先短暫停滯，隨著時間的延長生長繁殖逐漸恢復。由圖2 C 可知，當水分活度高于0.95 時，產氣莢膜梭菌生長較快，16 h 即開始對數生長期；當水分活度為0.95時，產氣莢膜梭菌44 h后開始進入對數期，遲緩期時間相對較長。表明產氣莢膜梭菌出現(xiàn)臨界生長狀態(tài)，與產氣莢膜梭菌生長所需最低水分活度（0.95）的結果一致。

3 討論

在厭氧培養(yǎng)條件下，以氯化鈉和葡萄糖為水分活度調節(jié)劑，當水分活度低于0.98時，產氣莢膜梭菌停止生長；以甘油為水分活度調節(jié)劑，當水分活度低于0.95時，產氣莢膜梭菌停止生長。其中，產氣莢膜梭菌對甘油最耐受。相同菌液接種量下，甘油的0 h 菌落數對數值高于葡萄糖，氯化鈉最低。這可能是因為產氣莢膜梭菌是一種革蘭陽性厭氧菌［14］，甘油可作為厭氧菌的一種保存助劑［15］，可在一定程度上促進其生長。

大多數微生物的代謝活動需要水分子參與，水分活度降低會導致微生物的代謝活性降低［16］。本研究結果表明，隨著水分活度的降低，產氣莢膜梭菌的生長活性逐漸受到抑制。由生長曲線可知，產氣莢膜梭菌菌液濃度的降低，停滯時間的延長，都與水分活度降低呈正相關。水分活度與微生物的生長密切相關，是判斷微生物風險與控制產品質量穩(wěn)定性的重要指標，但目前微生物污染控制方面的應用和研究仍屬罕見［17-18］。故有必要深入研究水分活度在非無菌藥品微生物檢驗中的應用，以縮短藥品放行周期，降低庫存成本和檢測成本。