轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)MYB在果樹花青素合成中的調(diào)控作用*

江春陽，杜美娥，梁兆林，叢佩華，張利義

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城125100）（2 鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者要求水果不僅要好吃，還要好看，而果實(shí)色澤是其顏值的重要表現(xiàn)，直接影響消費(fèi)者選擇，因此，果實(shí)著色問題一直以來都是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。果實(shí)著色主要?dú)w因于花青素[1]，關(guān)于花青素相關(guān)的果實(shí)著色的分子機(jī)制已取得了重要進(jìn)展[2-4]，本文重點(diǎn)就轉(zhuǎn)座子調(diào)控重要果樹果實(shí)著色的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為研究果樹花青素代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和改善果實(shí)品質(zhì)育種提供新的理論指導(dǎo)。

1 花青素的生理功能

花青素屬于水溶性黃酮類色素，通常都以糖苷形式存在液泡中，不同水果成熟時(shí)花青苷含量和種類不一樣，諸如影響蘋果和梨果皮的色苷主要為矢車菊素-3-O-半乳糖苷[4-6]，血橙和紅肉桃主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷[7-8]，葡萄主要為二甲花翠素-3-葡萄糖苷與二甲花翠素-3-乙酰葡萄糖苷[9]，藍(lán)莓主要為錦花葵素半乳糖苷[10]，草莓主要為天竺葵素3-葡萄糖苷[11]?；ㄇ嗨夭粌H賦予了眾多果實(shí)絢麗誘人的色彩、識(shí)別度以及成熟度[2]，而且在果樹生長(zhǎng)發(fā)育過程中有著重要的生理功能，包括吸引昆蟲授粉，抵御紫外線、低溫、干旱及創(chuàng)傷等逆境脅迫[1-2]。此外，花青素具有較強(qiáng)的抗氧化功效，對(duì)人體有保健功能[11]。

2 MYB轉(zhuǎn)錄因子為調(diào)控果樹花青素生物合成的核心

植物花青素合成途徑是源自苯丙烷代謝的類黃酮合成途徑的一個(gè)分支，涉及多個(gè)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因以及與其互作的環(huán)境因子[2-4]；其中，在果樹上通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與花青素的調(diào)控基因包括多種轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、bHLH、WD40、BBX、WRKY、ERF、b-ZIP等[12]；而MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)具有強(qiáng)烈的組織特異性，是花青素合成調(diào)控最核心的轉(zhuǎn)錄因子[1]。眾所周知，參與花青素代謝途徑上的任何一個(gè)基因突變都可能導(dǎo)致顏色表型變異；然而，從目前在多種果樹上全基因組或分離群體著色關(guān)聯(lián)分析可知，定位結(jié)果通常是MYB轉(zhuǎn)錄因子基因[11,13-17]。

MYB家族分4 個(gè)亞家族，包括1R-1MYB、R2R3-MYB、3R-MYB 和4R-MYB，而R2R3-MYB又是花青素合成調(diào)控最重要的轉(zhuǎn)錄因子[3-4]。目前，基于完成測(cè)序的包括蘋果、梨、葡萄以及柑橘等重要果樹的基因組及其轉(zhuǎn)錄組信息，眾多R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄激活因子和抑制因子被分離[3-4]；利用高質(zhì)量的基因組分析發(fā)現(xiàn)，通常是結(jié)構(gòu)上高度同源的MYB基因簇以串聯(lián)方式毗鄰排布在基因組上，諸如蘋果第9 號(hào)染色體上的MdMYB10和MdMYB90[18-19]與第17 號(hào)染色體上的MdMYB110a和MdMYB110b[19]、葡萄第2 號(hào)染色體上的VvMYBA1和VvMYBA2[20]以及柑橘第6 號(hào)染色體上的Ruby1和Ruby2[21]等。這些MYB基因簇通常與花青苷合成的能力息息相關(guān)，演化過程中2 個(gè)基因均受到不同程度的選擇；通常情況下，其中的1 個(gè)為主基因，而當(dāng)發(fā)生芽變等事件后，2 個(gè)基因協(xié)同發(fā)揮作用[18]；有時(shí)這些MYB基因簇發(fā)生突變后，在不同種中演化出亞功能化調(diào)控機(jī)制[21]，使彩色表型更加多樣化。

3 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)MYB 模式調(diào)控果樹花青素

轉(zhuǎn)座子或稱轉(zhuǎn)座元件（TEs），是基因組中可移動(dòng)的具有重復(fù)序列的遺傳元件，被喻為生命進(jìn)化的種子。轉(zhuǎn)座子特征是其序列兩端含有相同或逆向互補(bǔ)序列，常占植物基因組很大份額，許多果樹的轉(zhuǎn)座子在整個(gè)基因組序列占比超過50%，如蘋果、櫻桃等果樹（表1）。

表1 幾種重要果樹的基因組大小及TE 所占百分比

轉(zhuǎn)座元件可以分成2 類，其中I 型轉(zhuǎn)座子又被稱為逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，是一類通過“復(fù)制—粘貼”機(jī)制來實(shí)現(xiàn)其在基因組中“跳躍”的轉(zhuǎn)座元件，其長(zhǎng)末端重復(fù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR-RTs 是果樹中最為豐富的一類轉(zhuǎn)座元件，劃分為2 個(gè)大家族：Ty1/copialike 和Ty3/gypsy-like，LTR 通常具有5′-TG……CA-3′序列結(jié)構(gòu)，靶點(diǎn)重復(fù)序列TSDs 4～6 bp[22-23]。II 型轉(zhuǎn)座子也叫DNA 轉(zhuǎn)座子，主要是通過“剪切—粘貼”的機(jī)制進(jìn)行“跳躍”。2 類轉(zhuǎn)座子區(qū)別在于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子會(huì)通過RNA 逆轉(zhuǎn)錄自我復(fù)制，再逆轉(zhuǎn)錄成DNA 來完成轉(zhuǎn)座。

轉(zhuǎn)座子是果樹優(yōu)異性狀的形成以及在應(yīng)對(duì)逆境脅迫中不斷適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)[33]。轉(zhuǎn)座子插入對(duì)鄰近基因的影響主要表現(xiàn)為插入突變、結(jié)構(gòu)重排以及新調(diào)控元件和表觀修飾引入等[22-23]，這些影響可導(dǎo)致表型變異。其中，果實(shí)呈現(xiàn)絢麗多彩的表型，往往是具有多樣化調(diào)控色彩的轉(zhuǎn)座子之行為?；诋?dāng)前已完成的果樹基因組，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)MYB基因調(diào)控花青素合成在果樹上較具普遍性，以下列舉一些經(jīng)典的案例。

（1）蘋果。通過比較基因組，在果實(shí)著色的核心調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1的啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)redTE 逆轉(zhuǎn)座子插入，redTE 扮演了增強(qiáng)子角色，促進(jìn)了MdMYB1基因在低溫和強(qiáng)光條件下特異表達(dá)，使果實(shí)著色；該發(fā)現(xiàn)詮釋了紅元帥和紅富士等品種成熟時(shí)為什么易著色，而金冠及王林等品種卻不易著色的疑問；不易著色的品種是由于缺少這一起增強(qiáng)功能的轉(zhuǎn)座子，MdMYB1表達(dá)有限，不能有效合成花青素的結(jié)果[24]。進(jìn)一步通過電泳遷移率實(shí)驗(yàn)證明響應(yīng)低溫MdCBF2轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合到redTE 上，為我們理解低溫促進(jìn)果實(shí)著色提供了新的洞察。有趣的是，redTE 自我重組形成了只保留一個(gè)LTR 的“solo-redTE”，solo-redTE 塑造了一種果皮顏色為橘紅色的新表型[34]，如嘎拉蘋果（圖版2）。

最近10 多年紅肉蘋果選育是一個(gè)重要的方向，在紅肉蘋果MdMYB10啟動(dòng)子上游存在一個(gè)含6 個(gè)23 bp 的R6 重復(fù)序列（廣義上可視為轉(zhuǎn)座子），這個(gè)序列具有自激活及組成型表達(dá)特性，賦予了包括葉、果、花、枝干等整個(gè)植株為紅色的特性[35]。此外，還有一種II 型紅肉蘋果，葉片和植株是綠色的，而果肉是粉紅色的。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的功能特點(diǎn)及其在植物基因和基因組進(jìn)化中的作用，推測(cè)這種表型是由一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入調(diào)控與MdMYB10高度同源的MdMYB110轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)果[4,19]。

（2）葡萄。Kobayashi 等[36]2004 年在Science上發(fā)表論文表明，白色葡萄果實(shí)是由于VvMYBA1的啟動(dòng)子區(qū)插入了Gret1 逆轉(zhuǎn)座子，導(dǎo)致該基因表達(dá)受阻，無法調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，花青素?zé)o法合成，使果皮呈白色或綠色。Gret1 再次發(fā)生重組形成solo-LTR 使得VvMYBA1恢復(fù)了部分功能，使葡萄呈紅色表型[37]（圖版2）。

（3）柑橘。一個(gè)Copia LTR 逆轉(zhuǎn)座子Tcs1 插入MYB轉(zhuǎn)錄因子Ruby基因上游，為其提供了一個(gè)新的啟動(dòng)子，使Ruby在低溫條件下誘導(dǎo)表達(dá)，使果肉呈現(xiàn)出顯著的紅色；在雜交過程中，Tcs1 發(fā)生了重組形成一個(gè)solo-LTR 使得后代Moro 的果肉顏色更深；更加有趣的是，中國(guó)血橙Jingxian 和意大利Tarocco 在它們Ruby基因上游分別發(fā)生了不同的轉(zhuǎn)座子插入事件，但有著相類似的表型效應(yīng)，也說明這2 個(gè)品種有著不同起源史[38]（圖版2）。

（4）草莓。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)白色果實(shí)的二倍體野生草莓是由于FaMYB10轉(zhuǎn)錄因子中存在一個(gè)gypsy LTR 逆轉(zhuǎn)座子的插入，截?cái)嗔薋aMYB10編碼，進(jìn)而導(dǎo)致花青素苷合成受阻，因而發(fā)育為白色果實(shí)。而一個(gè)紅肉草莓突變體 FaEnSpm-2 是由于MYB10-2的啟動(dòng)子區(qū)插入1 個(gè)CACAT-like DNA 轉(zhuǎn)座子，增強(qiáng)了MYB10的表達(dá)，促進(jìn)了MYB10-2在草莓果肉中的表達(dá)和花色素苷的合成，導(dǎo)致了紅肉草莓的表型[11]（圖版2）。

（5）梨。已鑒定出PrMYB10（EU153575）和prMYB114（MF489219）是影響紅皮梨的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子[15,39]。其中，Yao 等[15,40]以八月紅和碭山酥梨等雜交群體圖譜定位并功能驗(yàn)證prMYB114是八月紅梨果實(shí)著色的關(guān)鍵基因，但沒有闡明prMYB114在群體中紅皮和非紅皮梨差異表達(dá)的原因。我們基于BartlettDH 基因組，在prMYB114轉(zhuǎn)錄因子ATG 上游1 299 bp 處發(fā)現(xiàn)插入了1 個(gè)LTR-RTs，該轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)5 295 bp，LTR 為492 bp，TSDs 為TATAT。此外，在PrMYB10的起始密碼子ATG 上游1 654 bp發(fā)現(xiàn)插入1 個(gè)LTR-RTs，該轉(zhuǎn)座子全長(zhǎng)3 938 bp，LTR 為526 bp，TSDs 為CATCT；在紅皮梨品種當(dāng)中，八月紅和早紅考密斯是2 類不同著色類型，果色發(fā)育模式有所不同；其中，八月紅只有果實(shí)成熟時(shí)果皮才變紅，而早紅考密斯幼果期和果實(shí)發(fā)育期都是紅色。根據(jù)這些表型，我們推測(cè)和蘋果一樣是這些轉(zhuǎn)座子調(diào)控了紅皮梨的多樣化著色表型。Wang等[39]基于紅巴梨及其綠色芽變系，發(fā)現(xiàn)綠色芽變是由于PrMYB10啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化導(dǎo)致的結(jié)果。已有研究表明，轉(zhuǎn)座子插入常常誘導(dǎo)周圍區(qū)域產(chǎn)生甲基化[41-43]，進(jìn)而導(dǎo)致不同表型的出現(xiàn)。此外，梨上是否還有其他轉(zhuǎn)座子或重組solo-LTR 調(diào)控果實(shí)著色，值得進(jìn)一步挖掘?？傊?，盡管以上這些發(fā)現(xiàn)仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但也為闡明紅色梨著色分子調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。

以上這些案例，顯示有重復(fù)序列特性的轉(zhuǎn)座子插入MYB基因，扮演了增強(qiáng)子[24]、沉默子[37]以及啟動(dòng)子[38]等多種功能角色，極大地拓展了我們以往對(duì)轉(zhuǎn)座子插入僅僅導(dǎo)致突變的簡(jiǎn)單理解。因?yàn)楫?dāng)攜帶豐富調(diào)控元件的轉(zhuǎn)座子整合到基因組中并被重新用作宿主基因的調(diào)節(jié)者時(shí)，便開啟了全新的演化選擇；而轉(zhuǎn)座子之所以頻繁選擇核心的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因作為靶標(biāo)并非隨機(jī)，是因?yàn)樵趹?yīng)對(duì)逆境時(shí)以這種調(diào)控方式可能更加靈活有效，進(jìn)而TE-MYB控制花青素合成模式在演化過程中被大多數(shù)果樹所選擇。

4 問題與展望

芽變育種是果樹重要育種途徑之一，轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)表觀修飾或轉(zhuǎn)座是果樹發(fā)生芽變的一個(gè)重要原因[44]；果樹上存在豐富的芽變，特別是顏色變化，易于視覺識(shí)別，是發(fā)現(xiàn)和揭示轉(zhuǎn)座子功能較好的材料。目前，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因調(diào)控功能的重要性在果樹上仍然未得到全面探討。結(jié)合逆境條件下RNA-seq分析，我們發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)座子如redTE 的LTR 區(qū)轉(zhuǎn)錄生成lncRNA（Long non-coding RNA），因?yàn)閞edTE 起增強(qiáng)子作用，常寫作eRNA（Enhancer RNA）。在蘋果著色方面研究表明，lncRNA 橋接了MdWRKY1和MdERF109轉(zhuǎn)錄因子，形成了MdWRKY1-lncRNA-MdERF109轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)模塊調(diào)控光誘導(dǎo)蘋果花青素生物合成[12]。那么諸如來源redTE 逆轉(zhuǎn)座子的非編碼作用機(jī)制又是什么呢？值得探討。

植物通過RdDM（RNA-directed DNA methylation）機(jī)制保證轉(zhuǎn)座子持續(xù)保持沉默，若轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)錄，其會(huì)被降解生成siRNA；而siRNA 又反過來攜帶DNA 甲基化酶將發(fā)生表達(dá)的轉(zhuǎn)座子通過DNA 甲基化修飾使其沉默[22]。最新發(fā)現(xiàn)表觀遺傳標(biāo)記修飾（mRNA 修飾是m5C 和m6A，DNA 為5mC 和6mA）在植物基因組上也普遍存在，且與基因表達(dá)、發(fā)育和脅迫響應(yīng)有關(guān)[45]。最近在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了m6A調(diào)控染色質(zhì)修飾水平與維持轉(zhuǎn)座子沉默狀態(tài)的新機(jī)制[46]，那么果樹上與著色相關(guān)的逆轉(zhuǎn)座子是否有類似的m6A 調(diào)控途徑和相似的功能？從RNA 甲基化的角度來認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)座子的作用和調(diào)控將豐富果樹轉(zhuǎn)座生物學(xué)，是個(gè)有趣而富有挑戰(zhàn)的科學(xué)方向。

從蘋果、葡萄以及柑橘中可以看到，solo-LTR是由完整的LTR-RTs 通過同源重組而生成的，這類短的攜帶調(diào)控位點(diǎn)的solo-LTR 轉(zhuǎn)座子可能更容易被宿主所固定；因?yàn)楫?dāng)LTR-RTs 插入宿主基因組時(shí)，在帶給宿主新的序列資源信息的同時(shí)，也給其基因組創(chuàng)造了不穩(wěn)定性的因素。而宿主先接受完整的逆轉(zhuǎn)座子插入，然后通過重組生成solo-LTR，這種趨利避害的進(jìn)化策略完美地實(shí)現(xiàn)物種多樣性。此外，果樹上這3 個(gè)典型案例也間接說明solo-LTR 作為一種順式元件參與了基因的表達(dá)與調(diào)控，而且具有發(fā)育時(shí)期和組織器官特異性，今后需利用CRISPR/Cas9 技術(shù)直接驗(yàn)證solo-LTR 調(diào)控果實(shí)著色的確切生物學(xué)功能。

總之，可以預(yù)見隨著測(cè)序與組裝基因組的成本大幅度的下降，更多個(gè)性化的果樹基因組序列將產(chǎn)生；通過比較基因組的方法，更多轉(zhuǎn)座子調(diào)控MYB基因的模式將在更多果樹上被發(fā)掘。從實(shí)踐而言，基于轉(zhuǎn)座子很容易開發(fā)出實(shí)用的分子標(biāo)記[11,24]，為輔助育種家精準(zhǔn)有效地培育具有理想果實(shí)顏色的新品種提供技術(shù)支撐。