基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索葛根-丹參藥對治療冠心病心絞痛的作用機制*

闕 斌 常佩芬 周紅梅 馮思婷 王 曉 郭 倩 聶紹平※

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院冠心病中心，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100700；3.北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029）

心絞痛（AP）是由于冠狀動脈供血不足，導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)暫時性缺血缺氧而導(dǎo)致的以胸痛為主要癥狀的臨床綜合征，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）最常見的表現(xiàn)。我國CHD 患病人數(shù)每年以20%的速度增長，其病死率占循環(huán)系統(tǒng)疾病的10%～20%[1]。本病隸屬中醫(yī)“胸痹”“真心痛”范疇，多由心脈痹阻而誘發(fā)疼痛[2]，故活血化瘀是臨床胸痹心痛的主要治法之一。

葛根-丹參是《施今墨對藥》中收載的常用藥對，其所針對的病機環(huán)境為瘀血阻滯，病位在血脈或經(jīng)脈[3]。葛根甘平，解肌退熱，通經(jīng)活絡(luò)，擴張心腦血管，改善血液循環(huán)；丹參味苦，性寒，活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。二藥配伍，相互促進(jìn)，活血化瘀，祛瘀生新[4]。葛根可促進(jìn)血管平滑肌的運動，以推動血液運行；丹參可祛除出血后或血流緩慢所形成的血管內(nèi)外瘀血，以保證血行暢通。該配伍自20 世紀(jì)以后成為現(xiàn)代臨床治療心腦血管病變的常用藥對，特別是對于冠心病心絞痛的治療具有較好療效。故本研究基于中藥“多成分、多靶點、多通路”研究思路，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測葛根-丹參藥對治療冠心病心絞痛的作用機制，進(jìn)而篩選有效活性成分、作用靶點及相關(guān)信號通路，為實驗研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選 在TCMSP 中分別錄入葛根、丹參進(jìn)行檢索，按生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）條件篩選出有效成分，通過該數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出所選活性成分對應(yīng)的靶點。然后將導(dǎo)出的靶點導(dǎo)入Unitprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.unitprot.org/），進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 靶標(biāo)蛋白基因名的確定及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中以“Coronary heart disease”“Angina”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將檢索到的蛋白名稱復(fù)制到Uniprot 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因的標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到疾病相關(guān)的靶點信息。將在Genecards、OMIM 中檢索得到的CHD 與葛根-丹參藥對的靶點在Venny 2.1 中映射篩選出共同靶點。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將該藥對所涉及的相關(guān)靶點上傳至在線STRING 11.0 軟件（https：//string-db.org/），通過參數(shù)設(shè)置將評分條件設(shè)定為＞0.40，并隱藏圖中孤立的蛋白質(zhì)，最終輸出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 關(guān)鍵核心基因GO功能注釋及KEGG富集通路分析 為進(jìn)一步了解上述篩選出的靶標(biāo)蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的葛根-丹參作用靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 富集通路分析，并基于R 軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 葛根-丹參活性成分的篩選及其作用靶點收集 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，檢索出葛根-丹參藥對的所有化學(xué)成分，包括丹參202 個、葛根18 個。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為參數(shù)共獲得了69 個滿足條件的化合物，其中丹參為65 個，葛根4 個。

2.2 葛根-丹參藥對與冠心病心絞痛靶點篩選 基于Genecards、OMIM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，獲得冠心病心絞痛相關(guān)的疾病靶點7556 個。剔除預(yù)測不到靶點的化合物共得到55 個，其中丹參52 個、葛根3 個。將7556 個疾病靶點與55 個藥對成分靶點通過Venny 2.1 軟件取交集后得到疾病-藥物成分共同靶點72 個。

2.3 潛在作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 運用STRING 11.0構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含72 個節(jié)點，638條邊，平均度值為17.7，其中節(jié)點表示靶標(biāo)蛋白，每條邊表示靶標(biāo)蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)節(jié)點的度值繪制出大于平均度值且較高的30 個關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點。度值排名前7 位的是IL6、FOS、CASP3、EGFR、JUN、MYC、VEGFA。見圖1。

2.4 潛在核心靶點的GO功能注釋與KEGG富集通路分析 利用DAVID 平臺對潛在功能靶點進(jìn)行基因功能分析，得到112 個GO 條目，涉及分子功能（MF）、生物過程（BP）和細(xì)胞組成（CC）3 個部分。DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等排列靠前，結(jié)果見圖2（根據(jù)P 值列出前20 個）。KEGG 富集通路結(jié)果共得到119 條通路，主要包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等。見圖3。

圖3 葛根-丹參藥對治療冠心病心絞痛KEGG富集通路氣泡圖

3 討論

研發(fā)表明，葛根-丹參合用具有防治心肌梗死、防治動脈硬化、抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等藥理作用[5，6]。丹參-葛根藥對在臨床應(yīng)用廣泛，以葛根為主要成分研制的愈風(fēng)寧心滴丸具有抗血小板聚集，擴張冠狀動脈血管，降低心肌耗氧量等作用[7]。而從丹參中提取的單體化合物丹參酮ⅡA 已被多項研究證實可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而起到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[8]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測，網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白節(jié)點主要包括IL-6、FOS、CASP3、EGFR 等。經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)介入治療術(shù)的術(shù)后再狹窄是局部血管損傷后的一種修復(fù)反應(yīng)，涉及炎癥反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞過度增殖及凋亡減少等多種因素參與。IL-6 通過促進(jìn)機體全身炎癥反應(yīng)及局部凝血作用，進(jìn)而刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，使動脈粥樣硬化斑塊增長且趨于不穩(wěn)定[9]。FOS 基因可編碼c-Fos 蛋白的合成，研究發(fā)現(xiàn)c-FOS 蛋白異常表達(dá)來源于心肌的缺血、缺血再灌注[10]。

GO 功能分析發(fā)現(xiàn)的潛在靶點主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等方面，提示葛根-丹參通過參與調(diào)控上述生物學(xué)過程進(jìn)而發(fā)揮其藥理作用。KEGG 富集分析篩選出與冠心病心絞痛密切相關(guān)的信號通路，如TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、IL-17 信號通路等，涉及免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡等生物學(xué)過程。PI3K-AKT 信號通路主要參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多個環(huán)節(jié)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮再生、炎癥反應(yīng)等影響心肌梗死的進(jìn)展[12]。炎癥與心絞痛關(guān)系密切，而TNF 則是經(jīng)典的炎癥靶標(biāo)，其可溶性受體（TNFR1 和TNFR2）在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有重要作用，且與心血管事件的風(fēng)險增加有關(guān)[13]。TNF-α 激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了血管功能障礙、動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展，以及心肌梗死后的心臟重構(gòu)[14]。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從系統(tǒng)生物學(xué)角度挖掘葛根-丹參治療冠心病心絞痛的潛在作用機制，發(fā)現(xiàn)各活性成分之間可能通過調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡等途徑發(fā)揮治療作用，為進(jìn)一步認(rèn)識疾病本質(zhì)，進(jìn)而探索藥物作用機制提供依據(jù)。