近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于川貝母真?zhèn)闻c規(guī)格的快速辨識(shí)研究

謝夢(mèng)迪，田亮玉，桂新景，施鈞瀚, 5，王君明，岳佑凇，[]張 璐, 5，王艷麗，姚 靜, 5，李學(xué)林, , 5，劉瑞新, , 5*

近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)應(yīng)用于川貝母真?zhèn)闻c規(guī)格的快速辨識(shí)研究

謝夢(mèng)迪1，田亮玉1，桂新景2, 3, 4，施鈞瀚2, 3, 4, 5，王君明1，岳佑凇1，[1]張 璐2, 3, 4, 5，王艷麗2, 3, 4，姚 靜2, 3, 4, 5，李學(xué)林1, 2, 3, 4, 5，劉瑞新1, 2, 3, 4, 5*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000 3. 河南省中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化工程研究中心，河南 鄭州 450000 4. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000 5. 河南省中藥臨床藥學(xué)中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（建設(shè)單位），河南 鄭州 450000

目的 探究近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于川貝母快速辨識(shí)的可行性。方法 收集80個(gè)川貝母待測(cè)樣品（含爐貝、松貝、青貝及川貝母?jìng)纹返龋瑸楂@取上述樣品的真?zhèn)魏鸵?guī)格信息，首先進(jìn)行傳統(tǒng)人工鑒別（M1法）與《中國(guó)藥典》法鑒別（M2法），并以M1法和M2法相結(jié)合的辨識(shí)結(jié)果作為標(biāo)桿信息（）；近紅外光譜儀采集待測(cè)樣品粉末的光譜信息（），結(jié)合主成分分析-判別分析（principal component analysis-discriminant analysis，PCA-DA）、偏最小二乘-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、最小二乘支持向量機(jī)（least squares support vector machines，LS-SVM）3種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立并優(yōu)化真?zhèn)渭吧唐芬?guī)格辨識(shí)模型[＝M()]（M3法）。結(jié)果 80個(gè)樣品均參與真?zhèn)伪孀R(shí)，經(jīng)留一法交互驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種真?zhèn)伪孀R(shí)模型中均無(wú)未分類(lèi)樣品，準(zhǔn)確率依次為98.75%、98.75%、97.50%；80個(gè)樣品中有5個(gè)因?qū)＜覍?duì)規(guī)格的判定意見(jiàn)難以達(dá)成一致或樣品本身原因等不參與建模，最終以75個(gè)樣品參與規(guī)格辨識(shí)，模型準(zhǔn)確率分別為100.00%（無(wú)未分類(lèi)樣品）、100.00%（有4個(gè)未分類(lèi)樣品）、100.00%（無(wú)未分類(lèi)樣品）。結(jié)論 真?zhèn)伪孀R(shí)均以PCA-DA、PLS-DA為最終辨識(shí)模型，商品規(guī)格分類(lèi)以PCA-DA、LS-SVM為最優(yōu)辨識(shí)模型。表明近紅外光譜技術(shù)在川貝母真?zhèn)魏鸵?guī)格質(zhì)量快速辨識(shí)方面具有良好應(yīng)用前景。

近紅外光譜技術(shù)；川貝母；快速辨識(shí)；真?zhèn)?；?guī)格；主成分分析-判別分析

川貝母為百合科植物川貝母D. Don、暗紫貝母Hsiao et K. C. Hsia、甘肅貝母Maxim.、梭砂貝母Franch．、太白貝母P. Y. Li或瓦布貝母Hsiao et KCHsiavar. Wabuensis (SYTanget SCYue) ZDLiu，SWanget S. C. Chen的干燥鱗莖，按性狀不同分別習(xí)稱“松貝”“青貝”“爐貝”和“栽培品”。川貝母始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，具有潤(rùn)肺散結(jié)、止咳化痰等功效，可用于治療虛勞咳嗽、吐痰咯血等癥，有“止咳圣藥”之稱[1]。由于川貝母的藥用價(jià)值高、療效顯著、市場(chǎng)需求量大，過(guò)度的濫采濫挖使川貝母瀕臨滅絕[2]，資源量急劇下降，導(dǎo)致川貝母的價(jià)格日益昂貴，市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多仿偽品。因此，鑒別川貝母的仿偽品、摻雜狀況[3]及商品規(guī)格分類(lèi)對(duì)保證中藥飲片質(zhì)量確保臨床療效至關(guān)重要。傳統(tǒng)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)[4]主要為經(jīng)驗(yàn)鑒別，即根據(jù)外觀性狀特征來(lái)判斷真?zhèn)蝃5]優(yōu)劣。但傳統(tǒng)人工辨識(shí)方法存在個(gè)體差異，如感官靈敏度不同、主觀性強(qiáng)、易于疲勞等問(wèn)題，對(duì)辨識(shí)結(jié)果造成影響；隨著現(xiàn)代技術(shù)發(fā)展，出現(xiàn)了越來(lái)越多的鑒別方法，比如薄層鑒別[6]、理化鑒別[7]、分子鑒定[8]、熒光鑒別[9-10]、高效液相鑒別[11]等方法，但這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng)，效率低，價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。如何快速[12]準(zhǔn)確鑒別川貝母規(guī)格及真?zhèn)问乾F(xiàn)階段需解決的問(wèn)題。

近紅外光譜技術(shù)（near infrared spectroscopy，NIRS）[13]系通過(guò)測(cè)定物質(zhì)在近紅外光譜區(qū)（按波數(shù)計(jì)為12 800～4 000 cm?1）的特征光譜并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法[14]提取相關(guān)信息，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析[15]的一種光譜分析技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、對(duì)樣品無(wú)破壞的檢測(cè)特性。該技術(shù)[16]廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)[17]、肉類(lèi)新鮮度評(píng)估[18]、不同年份大米的產(chǎn)地溯源檢測(cè)[19]，煙草中總糖、還原糖、總煙堿的含量測(cè)定[20]，另外在中藥及復(fù)雜樣品定量分析[21-24]、定性鑒別[25-29]等方面也有較多的應(yīng)用。已有學(xué)者基于便攜式聲光可調(diào)濾光器（AOTF）-近紅外光譜技術(shù)通過(guò)主成分分析法（principal component analysis，PCA）分別對(duì)貝母類(lèi)藥材、川貝母類(lèi)藥材及商品“松貝”與偽品進(jìn)行鑒別[30]，該文獻(xiàn)采用近紅外技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)[31]對(duì)川貝母進(jìn)行鑒別，具有一定的學(xué)術(shù)價(jià)值及鑒別意義。然而該文獻(xiàn)用于分析的部分樣品數(shù)相對(duì)較少，同時(shí)僅運(yùn)用簡(jiǎn)單無(wú)指導(dǎo)的PCA，并且未對(duì)川貝母中青貝、爐貝規(guī)格進(jìn)行分類(lèi)。因此，為了建立更加準(zhǔn)確、完善的模型，本研究收集80個(gè)川貝母待測(cè)樣品，擬采用NIRS結(jié)合多種有指導(dǎo)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分析，從樣品的整體信息進(jìn)行判別，建立并優(yōu)化“川貝母”的NIRS真?zhèn)渭吧唐芬?guī)格辨識(shí)模型，以實(shí)現(xiàn)對(duì)川貝母樣品的快速、準(zhǔn)確鑒別分析，為中藥飲片的快速鑒別提供參考。

1 儀器與材料

Nicolet 6700型傅里葉變換近紅外光譜儀，配InGaAs檢測(cè)器，Opus5.5分析軟件，TQ analys軟件；藥典篩（四號(hào)篩，0.25 μm孔徑，浙江上虞市道墟五四儀器廠）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰公司）；DM1000型電子顯微鏡（Leica公司）；電子游標(biāo)卡尺（精密度0.01 mm，GB/T21389，成都成量工具集團(tuán)有限公司）；BCA2248-CW型1/1萬(wàn)電子天平（Sartorius公司），CP225D型1/10萬(wàn)電子分析天平（Sartorius公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW-100，60～180目，北京科偉永興儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9146MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HK250型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品貝母素甲（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.2%，批號(hào)110750-201612，中國(guó)食品藥品檢定研究院），貝母素乙（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)B20081，上海源葉生物科技有限公司），平貝母對(duì)照藥材（批號(hào)Y29A9H69015，上海源葉生物有限公司），西貝母堿（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%，批號(hào)110767-201710，中國(guó)食品藥品檢定研究院），二乙胺（批號(hào)20121006，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心產(chǎn)品），二氯甲烷（批號(hào)20170812，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），甲醇（批號(hào)20180301，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司），氨水（批號(hào)20161101，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司），醋酸乙酯（批號(hào)20150324，天津市永大化學(xué)試劑有限公司），稀甘油（國(guó)藥準(zhǔn)字H20073910，南昌白云藥業(yè)有限公司），娃哈哈純凈水，色譜級(jí)乙腈，三氯甲烷、濃氨水等均為分析純。實(shí)驗(yàn)用80批川貝母待測(cè)樣品分別購(gòu)自于鄭州中醫(yī)院、藥材市場(chǎng)、醫(yī)藥公司等，產(chǎn)地及批號(hào)信息見(jiàn)表1。

表1 川貝母樣品購(gòu)買(mǎi)信息(含20批平貝母樣品)

Table 1 Purchase information of Fritillariae Cirrhosae Bulbus samples (contains 20 batches of Fritillariae Ussuriensis Bulbussamples)

編號(hào)產(chǎn)地批號(hào)購(gòu)買(mǎi)單位編號(hào)產(chǎn)地批號(hào)購(gòu)買(mǎi)單位 1四川1712073河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院41四川?三七西洋參專(zhuān)賣(mài) 2四川1712143河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院42四川171101鄭州市中醫(yī)院（小包裝） 3四川1801201河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院43四川180201鄭州市中醫(yī)院（散裝） 4四川1801211河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院44四川1712043河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 5四川1803261河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院45四川1801141河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 6四川180408河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司46四川1710273河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 7四川180409河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司47四川180110河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 8四川180410河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司48四川180111河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 9四川180411河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司49四川180112河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 10四川180412河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司50四川180113河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 11四川180413河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司51四川180114河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 12四川180414河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司52四川180115河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 13四川180415河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司53四川180116河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 14四川180416河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司54四川180117河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 15四川180417河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司55四川180118河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 16四川180418河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司56四川180119河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 17四川180419河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司57四川180120河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 18四川180420河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司58四川180121河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 19四川180421河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司59四川180122河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 20四川180422河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司60四川180123河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 21四川?三七參茸堂61浙江?三七參茸行專(zhuān)賣(mài)店 22四川?三七西洋參專(zhuān)賣(mài)62四川?三七參茸堂 23四川?鄭州市鯤鵬藥材行63貴州?三七西洋參專(zhuān)賣(mài) 24四川?鄭州市鯤鵬藥材行64四川?昌盛藥材行 25四川1701073河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司65四川?昌盛藥材行 26四川1707233河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司66黑龍江180301河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 27四川1711263河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司67黑龍江180302河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 28四川1803051河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司68黑龍江180303河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 29四川1712271河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司69黑龍江180304河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 30四川180125河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司70黑龍江180305河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 31四川180126河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司71黑龍江180306河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 32四川180201河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司72黑龍江180307河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 33四川180202河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司73黑龍江180308河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 34四川180203河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司74黑龍江180309河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 35四川180204河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司75黑龍江180310河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 36四川180205河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司76黑龍江180311河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 37四川180206河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司77吉林1710241河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 38四川180207河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司78吉林1711261河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 39四川180208河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司79黑龍江180313河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司 40四川180209河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司80黑龍江180312河中一醫(yī)藥經(jīng)營(yíng)有限公司

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)桿信息的確定

M1法為傳統(tǒng)人工鑒別方法，聘請(qǐng)?jiān)谥兴庤b定研究領(lǐng)域具有豐富經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家8名，參照《中國(guó)藥典》2020年版[6]一部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)外觀性狀規(guī)定，將樣品編號(hào)后隨機(jī)放置，由專(zhuān)家依據(jù)氣味、顏色、性狀、味道、質(zhì)地等外觀指標(biāo)的差異進(jìn)行真?zhèn)舞b別及規(guī)格辨識(shí)。M2法為經(jīng)典的藥典方法，參照《中國(guó)藥典》2020年版一部[6]，其中含量測(cè)定方法是基于文獻(xiàn)方法[32]改進(jìn)的高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-ELSD），選擇3位操作人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值，色譜條件為Waters XBridge shield RP18色譜柱，流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%二乙胺水溶液（B）梯度洗脫（0～15 min，50%～23% A；15～16 min，23%～50% A；16～28 min，50% A），體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃。ELSD參數(shù)為漂移管溫度108 ℃，載氣體積流量2.8 L/min，進(jìn)樣量10 μL。當(dāng)M1法與M2法結(jié)果出現(xiàn)差別時(shí)，將對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)檢確定最終結(jié)果。若結(jié)果仍不統(tǒng)一時(shí)，考慮到M2法比M1法更具有客觀性和系統(tǒng)性，考慮以藥典結(jié)果作為最終結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 川貝母樣品信息及2種辨識(shí)方法的結(jié)果

Table 2 Sample of Fritillariae Cirrhosae Bulbus and two identification results

編號(hào)真?zhèn)伪孀R(shí)商品規(guī)格辨識(shí)編號(hào)真?zhèn)伪孀R(shí)商品規(guī)格辨識(shí) M1M2標(biāo)桿信息YM1M2標(biāo)桿信息YM1M2標(biāo)桿信息YM1M2標(biāo)桿信息Y 111111141?11133 21111114217110101100 31111114318020102200 411111144171204311133 511111145180114111133 611111146171027311133 71111114718011011133 81111114818011111133 91111114918011211133 101111115018011311133 111111115118011411133 121111115218011511133 131111115318011611133 141111115418011711133 151111115518011811133 161111115618011911133 171111115718012011133 181111115818012111133 191111115918012211133 201111116018012311133 2111122261?22244 2211112262?22244 2322200063?22244 2422200064?22244 2511122265?22244 261112226618030122244 271112226718030222244 281112226818030322244 291112226918030422244 301112227018030522244 311112227118030622244 321112227218030722244 331112227318030822244 341112227418030922244 351112227518031022244 361112227618031122244 371802061112277171024122244 381802071112278171126122244 39180208111227918031322200 40180209111228018031222244

真?zhèn)舞b別：0-未分類(lèi) 1-真品 2-偽品；商品規(guī)格：0-未分類(lèi) 1-爐貝 2-松貝 3-青貝 4-平貝 ?不可得

Identification of authenticity: 0-unclassified 1-authentic 2-counterfeit; specifications: 0-Unclassified 1-furnace Fritillary 2-pine Fritillary 3-green fritillary 4-flat fritillary ?not available

2.2 傅里葉變換近紅外光譜信息的采集

將1～80號(hào)貝母樣品放置于60 ℃烘箱中烘干6 h，粉碎，過(guò)篩（四號(hào)藥典篩），粉末置于提前標(biāo)記好的自封袋內(nèi)，置干燥器中，待測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)裝樣置石英樣品池中，每次掃描前搖蕩石英杯，使樣品均勻平整，平行掃描3次，見(jiàn)圖1。取平均值作為其近紅外光譜基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品導(dǎo)出CSV文件，每個(gè)CSV文件包含2列共2076行數(shù)據(jù)。

圖1 近紅外采集80個(gè)貝母樣品光譜圖

2.3 真?zhèn)文Ｐ偷慕⒓皟?yōu)化

結(jié)合M1法和M2法所得最終結(jié)果作為標(biāo)桿信息（），如表2所示。利用NIRS對(duì)80批川貝母待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，提取其光學(xué)數(shù)據(jù)并借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立適宜的辨識(shí)模型，模型以近紅外采集的2075個(gè)色度信息值為自變量矩陣（80×2075），建立和之間的關(guān)系＝M()模型。利用MATLAB 2016b軟件建模，分別建立80個(gè)樣品的PCA-DA、PLS-DA、LS-SVM真?zhèn)伪孀R(shí)模型（M3法）[33-34]。

2.3.1 PCA-DA辨識(shí)模型及交互驗(yàn)證結(jié)果 參數(shù)設(shè)置：變量選擇7個(gè)，識(shí)別模式選擇線性，模型最優(yōu)正判率為98.75%。前3個(gè)主成分之和達(dá)75%以上，可解釋原變量大部分信息。PCA-DA辨識(shí)結(jié)果示：23個(gè)偽品中79號(hào)被錯(cuò)分為正品，不存在未分類(lèi)樣品。見(jiàn)圖2。

2.3.2 PLS-DA辨識(shí)模型及交互驗(yàn)證結(jié)果 參數(shù)設(shè)置：變量選擇6、7、8、9、10時(shí)正判率最高，識(shí)別模式選擇線性；模型最優(yōu)正判率為98.75%。前4個(gè)主成分之和達(dá)75%以上，可解釋原變量大部分信息。PLS-DA辨識(shí)結(jié)果示，23個(gè)偽品中79號(hào)被錯(cuò)分為正品，不存在未分類(lèi)樣品。見(jiàn)圖3。

圖2 PCA-DA模型主成分得分圖

圖3 PLS-DA模型主成分得分圖

2.3.3 LS-SVM辨識(shí)模型及交互驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)LS-SVM R2009b-R2011a載入矩陣（80×2075）、矩陣（80×1），采用3種不同函數(shù)代入程序進(jìn)行運(yùn)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：線性核函數(shù)（lin-kernel）正判率為97.50%，徑向基核函數(shù)（RBF-kernel）正判率為71.25%，多核函數(shù)（poly-kernel）正判率為86.25%。因此，以正判率最高的線性核函數(shù)為最終運(yùn)行函數(shù)，運(yùn)行結(jié)果：23個(gè)偽品有2個(gè)被錯(cuò)分為正品，不存在未分類(lèi)樣品，模型整體正判率為97.50%。

提取的酵母菌DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后為單一條帶，無(wú)拖尾。說(shuō)明提取的DNA完整無(wú)降解，可用于下一步酵母菌28S rDNA的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在650 bp左右位置有一條明亮清晰的條帶，與目的條帶相符。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化與T-A克隆，并將陽(yáng)性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.4 商品規(guī)格模型的建立及優(yōu)化

結(jié)合M1法和M2法所得最終結(jié)果作為標(biāo)桿信息（），如表2所示。利用NIRS對(duì)75批（剔除5個(gè)未分類(lèi)樣品）川貝母待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，提取其光學(xué)數(shù)據(jù)并借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立適宜的辨識(shí)模型，模型以近紅外采集的2075個(gè)色度信息值為自變量矩陣（75×2075），標(biāo)桿信息為因變量矩陣（80×1）建立和之間的關(guān)系＝M（）模型。利用MATLAB 2016b軟件，分別建立75個(gè)樣品的PCA-DA、PLS-DA、LS-SVM商品規(guī)格辨識(shí)模型（M3法），方法同上。

2.4.1 PCA-DA辨識(shí)模型及交互驗(yàn)證結(jié)果 參數(shù)設(shè)置：變量選擇16、17、18、19、20個(gè)時(shí)正判率最高，識(shí)別模式選擇線性；模型最優(yōu)正判率為100.00%。前3個(gè)主成分之和達(dá)75%以上，可解釋原變量大部分信息。PCA-DA辨識(shí)結(jié)果顯示：20個(gè)爐貝、18個(gè)松貝、18個(gè)青貝、19個(gè)平貝樣品分類(lèi)均正確；不存在未分類(lèi)的樣品。見(jiàn)圖4。

圖4 PCA-DA模型得分圖

2.4.2 PLS-DA辨識(shí)模型及交互驗(yàn)證結(jié)果 參數(shù)設(shè)置：變量選擇9個(gè)，識(shí)別模式選擇線性；模型最優(yōu)正判率為100.00%。前4個(gè)主成分之和達(dá)75%以上，可解釋原變量大部分信息。PLS-DA辨識(shí)結(jié)果顯示：20個(gè)爐貝分類(lèi)正確；26、46、66、80號(hào)未被分類(lèi)。見(jiàn)圖5。

圖5 PLS-DA模型主成分得分圖

2.4.3 LS-SVM辨識(shí)模型及交互驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)LS-SVM R2009b-R2011a，載入矩陣（80×2075）、矩陣（80×1），同“2.3.2”項(xiàng)的方法一致，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線性核函數(shù)（lin-kernel）正判率為100.00%，徑向基核函數(shù)（RBF-kernel）正判率為93.33%。因此，最終以線性核函數(shù)為最優(yōu)函數(shù)，模型整體正判率為100.00%。

2.5 M3方法最優(yōu)辨識(shí)結(jié)果

M3法以正判率最高的模型結(jié)果為最終判別結(jié)果，真?zhèn)伪孀R(shí)模型正判率最高的PLS-DA與PCA-DA分類(lèi)結(jié)果相同，不作分開(kāi)表述，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 M3辨識(shí)方法的結(jié)果

Table 3 M3 identification results

編號(hào)真?zhèn)伪孀R(shí)商品規(guī)格辨識(shí) 1～20真品爐貝 21～22真品松貝 23～24偽品 未分類(lèi) 25～40真品松貝 41真品青貝 42真品 未分類(lèi) 43偽品 未分類(lèi) 44真品青貝 45真品青貝 46～59真品青貝 60真品平貝 61～78真品平貝 79真品 未分類(lèi) 80真品爐貝

2.6 M3法的時(shí)效性計(jì)算

參照參考文獻(xiàn)的方法[34]進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：M3法耗費(fèi)的時(shí)間遠(yuǎn)少于M2法（＜0.01）。

2.7 近紅外傳感器信息值（變量）對(duì)模型貢獻(xiàn)度分析

真?zhèn)闻c多規(guī)格模型分類(lèi)優(yōu)選結(jié)果：真?zhèn)文Ｐ瓦x擇PLS-DA及PCA-DA辨識(shí)模型，多規(guī)格模型選擇PCA-DA、LS-SVM辨識(shí)模型。圖6-B、D圖中編號(hào)僅代表波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的序號(hào)，因變量數(shù)太多不能完整顯現(xiàn)出來(lái)最優(yōu)波長(zhǎng)數(shù)。圖7-B圖貢獻(xiàn)率最大的波長(zhǎng)范圍是7 960.837～8 045.691 cm?1，D圖貢獻(xiàn)率最大的波長(zhǎng)范圍是8 045.691～8 091.975 cm?1。圖7-B中編號(hào)僅代表波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的序號(hào)，其對(duì)應(yīng)最優(yōu)波長(zhǎng)范圍是8 153.687～8 296.396 cm?1。

3 討論

3.1 被剔除樣品的原因

A-PCA-DA真?zhèn)伪孀R(shí)模型變量載荷圖 B-PCA-DA真?zhèn)伪孀R(shí)模型變量載荷圖最優(yōu)波長(zhǎng)放大圖 C-PLS-DA真?zhèn)伪孀R(shí)模型變量載荷圖 D-PLS-DA真?zhèn)伪孀R(shí)模型變量載荷圖最優(yōu)波長(zhǎng)放大圖

A-PCA-DA規(guī)格辨識(shí)模型變量載荷圖 B-PCA-DA規(guī)格辨識(shí)模型變量載荷圖最優(yōu)波長(zhǎng)放大圖

3.2 判錯(cuò)樣品原因分析

真?zhèn)伪孀R(shí)PCA-DA、PLS-DA模型均認(rèn)為79號(hào)為正品，M1法4個(gè)專(zhuān)家認(rèn)為79號(hào)既不屬于川貝母也不屬于平貝母，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有摻偽樣品，使建立的模型準(zhǔn)確率較低，導(dǎo)致79號(hào)樣品判定錯(cuò)誤。

3.3 未分類(lèi)樣品分析

PCA-DA、PLS-DA模型是有監(jiān)督的判別分析方法[35-36]，相對(duì)于無(wú)監(jiān)督的PCA，當(dāng)樣本組間差異小時(shí)，它也能實(shí)現(xiàn)良好的區(qū)分。規(guī)格辨識(shí)PLS-DA模型中正判率為100%，26、46、66、80號(hào)樣品未被分類(lèi)，但M1法、M2法均能夠明確將其分類(lèi)，表明PLS-DA模型不是規(guī)格辨識(shí)的最優(yōu)模型。

3.4 近紅外光譜法的不足之處

本研究運(yùn)用傅里葉近紅外光譜技術(shù)結(jié)合多種有指導(dǎo)的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對(duì)80個(gè)川貝母待測(cè)樣品分析，優(yōu)選的模型正判率與藥典方法相比無(wú)顯著性差異（＜0.01），相對(duì)于人工鑒別大大縮短了時(shí)間，節(jié)省大量人力物力，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系快速[37]、無(wú)損定性分析。該技術(shù)同時(shí)也有不足之處：（1）分析需要建立模型，對(duì)模型建立要求較高；（2）模型傳遞技術(shù)尚不成熟，如果能建立成熟的模型傳遞[38]，使在一臺(tái)儀器上建立的定性或定量校正模型可靠地移植到其他相同或類(lèi)似的儀器上使用，就能減少建模所需的時(shí)間和費(fèi)用。當(dāng)然，隨著光譜技術(shù)計(jì)算機(jī)技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，使模型建立難度下降，模型準(zhǔn)確度增強(qiáng)、模型傳遞技術(shù)更加成熟。今后，近紅外光譜技術(shù)在中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域?qū)⒕哂懈訌V闊的前景。

3.5 真?zhèn)闻c多規(guī)格分類(lèi)正判率比較

川貝母真?zhèn)文Ｐ驼新蚀笮镻LS-DA=PCA-DA＞LS-SVM，最終優(yōu)選PCA-DA、PLS-DA為真?zhèn)巫顑?yōu)判別模型；多規(guī)格分類(lèi)模型正判率大小為PCA-DA＝PLS-DA＝LS-SVM，但因PLS-DA模型中未被分類(lèi)數(shù)太多，故最終優(yōu)選PCA-DA、LS-SVM為最優(yōu)判別模型。

綜合比較，近紅外辨識(shí)正判率與傳統(tǒng)人工經(jīng)驗(yàn)鑒別無(wú)顯著性差異，近紅外辨識(shí)不如傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)辨識(shí)快，但較藥典檢測(cè)時(shí)間極顯著縮短。綜上所述，近紅外技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法快速準(zhǔn)確的辨識(shí)川貝母真?zhèn)魏蜕唐芬?guī)格，可為中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)及質(zhì)量鑒別提供一種新思路和新技術(shù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 李瑞琦, 吳翠, 徐靚, 等. 基于傳統(tǒng)性狀客觀化分析的川貝母質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2020, 55(1): 14-18.

[2] 仰鐵錘, 謝慧敏, 謝慧淦, 等. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶多態(tài)法檢查川貝母的摻偽情況 [J]. 華西藥學(xué)雜志, 2020, 35(3): 265-269.

[3] Rodionova O Y, Fernández P J A, Baeten V,. Chemometric non-targeted analysis for detection of soybean meal adulteration by near infrared spectroscopy [J]., 2021, 119: 107459.

[4] 崔治家, 馬艷珠, 張小榮, 等. 川貝母化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測(cè)分析 [J]. 中草藥, 2021, 52(9): 2768-2784.

[5] 蘭青闊, 趙新, 陳銳, 等. 基于LAMP的中藥材川貝母真?zhèn)舞b別方法的建立 [J]. 藥物分析雜志, 2019, 39(3): 551-556.

[6] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 126.

[7] 翟映紅, 于國(guó)強(qiáng), 楊永茂, 等. 從川貝母中檢出平貝母的理化鑒別方法 [J]. 華西藥學(xué)雜志, 2017, 32(6): 633-635.

[8] 時(shí)圣明, 潘明佳, 王潔, 等. 分子鑒定技術(shù)在中藥中的應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2016, 47(17): 3121-3126.

[9] 羅達(dá)龍, 黃林杰, 黃琳. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)川貝母的鑒別應(yīng)用 [J]. 中國(guó)藥師, 2016, 19(6): 1068-1070.

[10] 吳雪莉, 王毅, 趙筱萍. 基于熒光探針的消渴安中DPP-4抑制劑的篩選與鑒定 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(7): 1241-1245.

[11] 劉晶, 王曙, 辛貴忠, 等. HPLC-ELSD測(cè)定太白貝母和瓦布貝母中貝母辛的含量 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2010, 45(13): 1032-1034.

[12] 楊靖雯, 高秀強(qiáng), 田清存, 等. 10種中藥材快速經(jīng)驗(yàn)鑒別方法總結(jié) [J]. 中藥材, 2018, 41(12): 2792-2794.

[13] 中國(guó)藥典[S]. 四部. 2020: 29.

[14] Arndt M, Drees A, Ahlers C,. Determination of the geographical origin of walnuts (L.) using near-infrared spectroscopy and chemometrics [J]., 2020, 9(12): 1860.

[15] Yan H, Pu Z J, Wang Y J,. Rapid qualitative identification and quantitative analysis ofMume based on Fourier transform near infrared spectroscopy [J]., 2021, 249: 119344.

[16] Mishra P, Herrmann I, Angileri M. Improved prediction of potassium and nitrogen in dried bell pepper leaves with visible and near-infrared spectroscopy utilising wavelength selection techniques [J]., 2021, 225: 121971.

[17] 周冰谷, 花振新, 楊榮, 等. 近紅外光譜技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用飼料技術(shù) [J]. 廣東飼料, 2019, 28(8): 44-46.

[18] 陶瑞, 史智佳, 貢慧, 等. 傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)金槍魚(yú)新鮮度 [J]. 肉類(lèi)研究, 2017, 31(4): 43-49.

[19] 宋雪健, 錢(qián)麗麗, 張東杰, 等. 基于漫反射傅里葉變換近紅外光譜技術(shù)對(duì)不同年份的大米產(chǎn)地溯源檢測(cè) [J]. 食品科學(xué), 2017, 38(18): 286-291.

[20] 蔣宏霖, 劉會(huì)杰, 王學(xué)杰, 等. 近紅外光譜技術(shù)在煙葉化學(xué)分析中的應(yīng)用 [J]. 科技與創(chuàng)新, 2019(18): 153-155.

[21] 陳佳樂(lè), 金葉, 陳紅英, 等. 川芎藥材的近紅外多指標(biāo)快速質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2016, 47(6): 1004-1009.

[22] 雷曉晴, 李耿, 王秀麗, 等. 基于近紅外光譜法快速測(cè)定丹參中5種成分模型的建立 [J]. 中草藥, 2018, 49(11): 2653-2661.

[23] 戰(zhàn)皓, 吳宏偉, 張東, 等. 近紅外光譜法測(cè)定不同產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量 [J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2017, 37(5): 1391-1396.

[24] 馬越, 劉永強(qiáng), 門(mén)宇鳳, 等. 近紅外光譜法快速測(cè)定芍藥根中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷 [J]. 中草藥, 2018, 49(3): 700-707.

[25] 閆珂巍, 王福, 梅國(guó)榮, 等. 基于近紅外光譜技術(shù)快速定性鑒別廣陳皮模型的建立 [J]. 中草藥, 2015, 46(20): 3096-3099.

[26] 張敏, 韓正洲, 嚴(yán)萍, 等. 基于近紅外漫反射光譜的雞血藤藥材定性分析 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014, 16(7): 1491-1496.

[27] 徐亞, 李慧, 馮學(xué)峰, 等. 基于顯微和近紅外方法定性鑒別中藥材威靈仙不同基原品種的比較研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(7): 1278-1282.

[28] 余馳, 姜紅, 劉愛(ài)萍. 近紅外漫反射光譜法建立厚樸藥材的定性模型 [J]. 藥物分析雜志, 2009, 29(4): 656-658.

[29] 胡鋼亮, 陳瑞珍, 程柯, 等. 近紅外漫反射光譜快速檢測(cè)川貝母中浙貝母的摻入量 [J]. 藥物分析雜志, 2005, 25(2): 150-152.

[30] 楊復(fù)森, 武衛(wèi)紅, 王寧, 等. 基于AOTF-近紅外光譜技術(shù)的川貝母藥材即時(shí)快速鑒別研究 [J]. 中成藥, 2013, 35(1): 135-140.

[31] Hua H M, Yi Y, Li H L,. Monitoring the extraction process of acidic polysaccharides inby near infrared spectroscopy combined with chemometrics [J]., 2021, 113: 103613.

[32] 雷艷輝, 李會(huì)軍, 李萍. 川貝母藥材生物堿成分HPLC-ELSD特征圖譜的研究 [J]. 中成藥, 2014, 36(7): 1477-1481.

[33] 應(yīng)雨棋, 張洋洋, 虞立, 等. 基于LS-SVM模型的丹參有效成分超聲提取工藝優(yōu)化 [J]. 中藥材, 2020, 43(4): 936-941.

[34] 劉瑞新, 郝小佳, 張慧杰, 等. 基于電子眼技術(shù)的中藥川貝母真?zhèn)渭耙?guī)格的快速辨識(shí)研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(14): 3441-3451.

[35] Ramírez-Elías M G, Guevara E, Zamora-Pedraza C,. Assessment of mezcal aging combining Raman spectroscopy and multivariate analysis techniques [J]., 2017, 6(1/2): 75-81.

[36] Wong K H, Razmovski-Naumovski V, Li K M,. Differentiatingandusing HPTLC coupled with multivariate classification analyses [J]., 2014, 95: 11-19.

[37] 雷曉晴, 王秀麗, 李耿, 等. 近紅外光譜法快速測(cè)定當(dāng)歸中7種成分的含量 [J]. 中草藥, 2019, 50(16): 3947-3954.

[38] 梁晨. 近紅外光譜多元校正模型傳遞方法的研究 [D]. 北京: 北京化工大學(xué), 2016.

Fast identification of authenticity and specification ofby near infrared spectroscopy combined with chemometrics

XIE Meng-di1, TIAN Liang-yu1, GUI Xin-jing2, 3, 4, SHI Jun-han2, 3, 4, 5, WANG Jun-ming1, YUE You-song1, ZHANG Lu2, 3, 4, 5, WANG Yan-li1, YAO Jing2, 3, 4, 5, LI Xue-lin1,2, 3, 4, 5, LIU Rui-xin1,2, 3, 4, 5

1. Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 2. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 3. Henan Engineering Research Center for Modernization of clinical application of Chinese Herbal Pieces, Zhengzhou 450000, China 4. Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Respiratory Diseases with Traditional Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 5. Henan Provincial Key Laboratory of TCM Clinical Pharmacy, Zhengzhou 450000, China

Objective To explore the feasibility of the application of near infrared spectroscopy in the rapid identification of. Methods A total of 80 samples ofwere collected. In order to obtain the authenticity and specification information of the samples, traditional manual identification (M1method) and pharmacopoeia identification (M2method) were carried out, and the identification results combined with M1method and M2method were used as benchmark information (). Near Infrared Spectroscopy to collect spectral information of the sample powder (), combined with principal component analysis, discriminant analysis (PCA-DA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), the least squares support vector machines (LS-SVM) three chemometrics methods to establish and optimize the authenticity and commodity specification identification model [Y=M ()] (M3) Results All the 80 samples participated in the identification of authenticity and falsification. The results showed that there were no unclassified samples in the three identification models, and the accuracy rates were 98.75%, 98.75% and 83.75%, respectively. Among the 80 samples, five samples did not participate in the modeling due to the difficulty in reaching an agreement on the specification by experts or due to the sample itself. Finally, 75 samples were selected to participate in the specification identification, and the model accuracy rates were 100.00% (no unclassified samples), 100.00% (four unclassified samples) and 100.00% (no unclassified sample), respectively. Conclusion PCA-DA and PLS-DA were used as the final identification models for authenticity identification, and PCA-DA and LS-SVM were used as the optimal identification model for commodity specification classification. Near infrared spectroscopy has a good application prospect in the rapid identification of the authenticity and specification of.

near infrared spectroscopy technology;; fast identification; authenticity; specifications; principal component analysis-discriminant analysis

R286.2

A

0253 - 2670(2022)08 - 2490 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.026

2021-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81773892）；河南省衛(wèi)生健康中青年學(xué)科帶頭人專(zhuān)項(xiàng)（HNSWJW-2020014）；河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項(xiàng)目（重點(diǎn)項(xiàng)目）（2019ZYBJ07）；河南省高層次人才特殊支持“中原千人計(jì)劃”—“中原青年拔尖人才”項(xiàng)目（ZYQR201912158）；中管局基地專(zhuān)項(xiàng)（2018JDZX087）

謝夢(mèng)迪，在讀碩士，從事中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)研究。E-mail: 2082176197@qq.com

劉瑞新，博士，主任藥師，從事中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)研究。Tel: (0371)66233562 E-mail: liuruixin7@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]