忍冬葉化學成分及其保肝活性研究

王 凱，劉 雙，李 蒙，李麗麗，于金倩，王 曉*

忍冬葉化學成分及其保肝活性研究

王 凱1, 2，劉 雙2，李 蒙2，李麗麗2，于金倩2，王 曉2*

1. 山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250300 2. 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）山東省分析測試中心 山東省大型精密儀器應用技術重點實驗室，山東 濟南 250014

研究忍冬葉化學成分及其保肝活性。采用硅膠柱色譜、反相C18柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、半制備型高效液相色譜等方法進行分離與純化，并根據(jù)理化性質(zhì)和波譜學數(shù)據(jù)分析鑒定化合物結(jié)構(gòu)；利用體外肝細胞損傷模型，采用MTT法檢測化合物單體抵抗對乙酰氨基酚（APAP）誘導的人肝癌HepG2細胞損傷的作用。從忍冬葉醇提物中分離得到19個化合物，分別鑒定為斷氧化馬錢苷酸（1）、8-表番木鱉酸（2）、馬錢苷酸（3）、咖啡酸（4）、綠原酸（5）、隱綠原酸（6）、新綠原酸（7）、6′--β--呋喃芹糖基獐牙菜苷（8）、demethylsecologanol（9）、獐牙菜苷（10）、斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯（11）、表斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯（12）、木犀草素-7--β--葡萄糖苷（13）、異綠原酸A（14）、異綠原酸B（15）、木犀草苷（16）、木犀草素-7--[α--吡喃阿拉伯糖基-(1→6)]-β--吡喃葡萄糖苷（17）、木犀草素-7--木糖（18）、忍冬苷（19）；其中化合物2～11、1～15、17具有較好的抗APAP肝損傷作用。化合物1、2、8、11、12、18均首次從忍冬葉中分離得到，其中化合物18首次從忍冬植物中分離得到，化合物2～11、13～15、17具有明顯的保肝活性。

忍冬葉；保肝活性；斷氧化馬錢苷酸；8-表番木鱉酸；6′--β--呋喃芹糖基獐牙菜苷；斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯

忍冬Thunb.為忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬屬Linn. 多年生半常綠纏繞灌木，是一種具有悠久歷史的常用中藥，其花、莖、葉均可入藥[1]。忍冬資源豐富，在全國各地均有分布，主產(chǎn)區(qū)主要有山東、河南、河北等地區(qū)。其入藥可追溯到梁代，始載于陶弘景《本草經(jīng)集注》，“今處處皆有，似藤生，凌冬不凋，故名忍冬”“十二月采，陰干”，說明在古代忍冬藥用部位為莖、葉?，F(xiàn)代研究表明忍冬葉中含有黃酮類、有機酸、環(huán)烯醚萜類、揮發(fā)油等化學成分。藥理活性實驗發(fā)現(xiàn)其具有抗病原微生物、保肝、消炎、抗氧化、降調(diào)血脂等作用[2]。忍冬葉作為中藥金銀花的副產(chǎn)品，產(chǎn)量是花的10倍左右[3]，具有很好的潛在開發(fā)利用價值。

為使忍冬非藥用部位價值最大化，發(fā)現(xiàn)新藥源，本研究對忍冬葉醇提物的化學成分進行系統(tǒng)性研究，從中分離得到19個化合物，分別鑒定為斷氧化馬錢苷酸（secologanoside，1）、8-表番木鱉酸（8-epiloganic acid，2）、馬錢苷酸（loganic acid，3）、咖啡酸（caffeic acid，4）、綠原酸（chlorogenic acid，5）、隱綠原酸（cryptochlorogenic acid，6）、新綠原酸（neochlorogenic acid，7）、6′--β--呋喃芹糖基獐牙菜苷（6′--β--apiofuranosyl sweroside，8）、demethylsecologanol（9）、獐牙菜苷（sweroside，10）、斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯（vogeloside，11）、表斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯（-vogeloside，12）、木犀草素- 7--β--葡萄糖苷（luteolin-7--β--glucoside，13）、異綠原酸A（isochlorogenic acid A，14）、異綠原酸B（isochlorogenic acid B，15）、木犀草苷（cynaroside，16）、木犀草素-7--[α--吡喃阿拉伯糖基- (1→6)]-β--吡喃葡萄糖苷（luteolin-7--[α-- pyranafinosyl-(1→6)]-β--glucopyranoside，17）、木犀草素-7--木糖（luteolin-7--xyloside，18）、忍冬苷（lonicerin，19）?；衔?、2、8、11、12、18均首次從忍冬葉中分離得到，其中化合物18首次從忍冬植物中分離得到。化合物2～11、13～15、17具有明顯的保肝活性。

1 儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Bruker-400核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；EYELA N-1200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（日本東京理化）；半制備HPLC分析儀器為島津LC-20A（日本島津公司）；普源L-3000型色譜儀（北京普源精電科技有限公司）；AB-8大孔樹脂（天津南開和成科技有限公司）；薄層硅膠GF254、柱色譜硅膠（200～300目）（青島海洋化工廠）；HPLC用甲醇、乙腈為色譜純（天津市康科德科技有限公司），其余試劑均為分析純；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力升科學儀器）；Nikon Eclipse Ts 2倒置顯微鏡；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；Spark多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；湘儀離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（武漢賽維爾生物科技有限公司）；青鏈霉素混合液、PBS、MTT、胰酶（索萊寶生物科技有限公司）；對乙酰氨基酚（paracetamol，APAP）、雙環(huán)醇（中國食品藥品檢定研究院）；人肝癌HepG2細胞（中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心）。

忍冬葉藥材采集自山東省平邑縣流峪鎮(zhèn)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬Thunb.的干燥葉。

2 提取與分離

干燥的忍冬葉30 kg，粉碎后過篩，用30%乙醇滲漉提取，提取液減壓濃縮至無醇味膏狀物，得到浸膏3 kg。隨后采用AB-8大孔樹脂柱色譜進行分離，以不同梯度乙醇（0、20%、40%、60%、80%、95%）進行洗脫，得到6個部位（Fr. 1～6）。

選取水部位Fr. 1（1 kg）經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（15∶1、10∶1、5∶1、1∶1）進行梯度洗脫，得到4個部位（Fr. 1-1～1-4），F(xiàn)r. 1-4（200 g）經(jīng)中壓-Flash液相以甲醇-水（15%、20%、25%、30%、35%、100%）進行洗脫，經(jīng)高效液相色譜分析檢測合并得到6個組分（Fr. 1-4-1～1-4-6），F(xiàn)r. 1-4-4即是化合物1（0.4 g）；Fr. 1-4-2經(jīng)半制備高效液相色譜儀（乙腈-0.1%甲酸水9∶91）得到化合物2（20 mg）、3（23 mg）、4（30 mg）、5（120 mg）、6（40 mg）；Fr. 1-4-1經(jīng)半制備高效液相色譜（乙腈- 0.1%甲酸水8∶92），得到化合物7（11 mg）；Fr. 1-4-5經(jīng)半制備HPLC（乙腈-0.1%甲酸水10∶90）得到化合物8（21 mg）；Fr. 1-4-3經(jīng)半制備HPLC（乙腈-0.1%甲酸水10∶90）得到化合物9（34 mg）、10（52 mg）。

將大孔樹脂40%乙醇部位Fr. 3（90 g）過中壓C18色譜柱，用甲醇-水（10%、20%、30%、35%、40%、50%、60%、100%）進行洗脫，經(jīng)分析檢測合并得到8個組分（Fr. 3-1～3-8），其中Fr. 3-1采用普源L-3000液相色譜儀（乙腈-0.1%甲酸水14∶86）分離，得到化合物11（10 mg）、12（2 mg）；將Fr. 3-4（3.3 g）溶解后過凝膠柱，以80%甲醇等度洗脫，得到5個組分（Fr. 3-4-1～3-4-5）。將Fr. 3-4-3、Fr. 3-4-4、Fr. 3-4-5分別濃縮，即得化合物13（105 mg）、14（44 mg）、15（16 mg）；將Fr. 3-4-2經(jīng)過半制備HPLC（乙腈-0.1%甲酸水15∶85），得到化合物16（25 mg）；采用普源L-3000液相色譜儀（乙腈-0.1%甲酸水16∶84）對Fr. 3-4-1進行細分，得到化合物17（21 mg）、18（43 mg）、19（22 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色粉末。ESI-MS/: 413.3 [M＋Na]+，C16H22O11Na。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.40 (1H, brs, H-3), 5.54 (1H, m, H-8), 5.37 (1H, d,= 4.0 Hz, H-1), 5.21 (1H, d,= 16.0 Hz, H-10a), 5.20 (1H, d,= 12.0 Hz, H-10b), 4.50 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1′), 3.43 (1H, m, H-5), 2.90～3.70 (6H, m, H-2′～6′), 2.93 (1H, m, H-9), 2.71 (1H, m, H-6), 2.09 (1H, m, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 173.7 (C-7), 168.1 (C-11), 151.9 (C-3), 134.0 (C-8), 120.2 (C-10), 109.2 (C-4), 99.0 (C-1′), 95.8 (C-1), 77.7 (C-3′), 77.2 (C-5′), 73.5 (C-2′), 70.4 (C-4′), 61.5 (C-6′), 43.5 (C-9), 34.0 (C-6), 27.3 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[4]，故鑒定化合物1為斷氧化馬錢苷酸。

化合物2：淡黃色粉末。ESI-MS/: 377.4 [M＋H]+，C16H25O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.27 (1H, s, H-3), 5.36 (1H, d,= 4.0 Hz, H-1), 4.48 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1′), 3.67 (1H, m, H-6′a), 3.43 (1H, m, H-6′b), 2.85 (1H, m, H-5), 2.39 (1H, m, H-8), 1.99 (1H, m, H-9), 1.89 (1H, m, H-6a), 1.69 (1H, m, H-6b), 0.94 (3H, d,= 7.2 Hz, H-10)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.7 (C=O), 150.3 (C-3), 113.5 (C-4), 98.6 (C-1′), 94.6 (C-1), 77.7 (C-5′), 77.3 (C-3′), 77.2 (C-7), 73.6 (C-2′), 70.6 (C-4′), 61.8 (C-6′), 44.0 (C-9), 41.6 (C-8), 40.1 (C-6), 30.2 (C-5), 14.4 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[5]，故鑒定化合物2為8-表番木鱉酸。

化合物3：淺黃色粉末。ESI-MS/: 377.4 [M＋H]+，C16H25O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.30 (1H, s, H-3), 5.09 (1H, d,= 5.2 Hz, H-1), 4.48 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1′), 3.43 (1H, dd,= 6.4, 12.0 Hz, H-7), 2.06 (1H, m, H-9), 1.81 (1H, m, H-6a), 1.72 (1H, m, H-6b), 1.45 (1H, m, H-8), 0.99 (1H, s, H-10)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 166.4 (C=O), 148.4 (C-3), 111.0 (C-4), 96.9 (C-1′), 94.4 (C-1), 75.6 (C-3′), 75.1 (C-5′), 71.5 (C-7), 70.5 (C-2′), 68.5 (C-4′), 59.5 (C-6′), 43.1 (C-9), 40.1 (C-6), 38.9 (C-8), 29.3 (C-5), 11.9 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[6]，故鑒定化合物3為馬錢苷酸。

化合物4：黃色粉末。ESI-MS/: 181.2 [M＋H]+，C9H9O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 9.49 (1H, s, H-9), 7.44 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7), 7.06 (1H, s, H-2), 6.98 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.20 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.4 (C-9), 148.6 (C-4), 146.0 (C-3), 145.0 (C-7), 126.2 (C-1), 121.6 (C-6), 116.2 (C-8), 115.6 (C-5), 115.1 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[7]，故鑒定化合物4為咖啡酸。

化合物5：淡黃色粉末。ESI-MS/: 353.3 [M－H]?，C16H17O9。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 9.61 (2H, brs, 3′, 4′-OH), 7.43 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′), 7.04 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2′), 6.99 (1H, dd,= 2.2, 8.4 Hz, H-6′), 6.77 (1H , d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.16 (1H, brs, H-8′), 4.94 (1H, m, H-3), 3.93 (1H, m, H-4), 3.57 (1H, m, H-5), 2.03～1.79 (2H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 175.4 (C=O), 166.2 (C-9′), 148.8 (C-4′), 146.0 (C-7′), 145.4 (C-3′), 126.1 (C-1′), 121.8 (C-6′), 116.2 (C-2′), 115.2 (C-8′), 114.8 (C-5′), 73.9 (C-1), 71.3 (C-3), 70.9 (C-4), 68.5 (C-5), 37.7 (C-6), 36.7 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物5為綠原酸。

化合物6：淡黃色粉末。ESI-MS/: 377.3 [M＋Na]+，C16H18O9Na。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.51 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′), 7.05 (1H, s, H-2′), 7.01 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6′), 6.78 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.28 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8′), 4.77 (1H, d,= 6.0 Hz, H-4), 4.10 (1H, m, H-5), 4.01 (1H, m, H-3), 1.92～2.04 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 175.9 (C=O), 166.8 (C-9′), 148.8 (C-4′), 146.0 (C-7′), 145.3 (C-3′), 126.1 (C-1′), 121.7 (C-6′), 116.3 (C-5′), 115.2 (C-2′), 115.1 (C-8′), 77.4 (C-4), 74.6 (C-1), 67.0 (C-5), 64.4 (C-3), 41.2 (C-2), 38.2 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[9]，故鑒定化合物6為隱綠原酸。

化合物7：白色粉末。ESI-MS/: 377.3 [M＋Na]+，C16H18O9Na。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.47 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′), 7.03 (1H, d,= 4.0 Hz, H-2′), 6.98 (1H, dd,= 8.0, 4.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.21 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8′), 5.18 (1H, m, H-5), 4.90 (1H, s, H-3), 3.87 (1H, m, H-4), 1.93～2.19 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 176.5 (C=O), 166.5 (C-9′), 148.6 (C-4′), 146.0 (C-7′), 144.9 (C-3′), 126.2 (C-1′), 121.5 (C-6′), 116.3 (C-5′), 115.5 (C-8′), 115.1 (C-2′), 73.4 (C-1), 71.7 (C-5), 71.4 (C-4), 67.7 (C-3), 40.4(C-2), 35.6 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[10]，故鑒定化合物7為新綠原酸。

化合物8：淺黃色粉末。ESI-MS/: 513.5 [M＋Na]+，C21H30O13Na。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.39 (1H, s, H-3), 5.69 (1H, m, H-8), 5.33 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1), 5.20 (1H, d,= 16.0 Hz, H-10), 4.52 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 4.03 (1H, d,= 4.0 Hz, H-1′′), 2.96～3.70 (13H, m, H2-7, H-2′～H2-6′, H-2′′, 4′′, 5′′), 2.67 (1H, m, H-5), 2.45 (1H, m, H-9), 1.94 (1H, m, H-6a), 1.61 (1H, m, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 168.6 (C-11), 151.5 (C-3), 135.3 (C-8), 119.2 (C-10), 113.0 (C-1′′), 103.7 (C-4), 99.1 (C-1′), 96.0 (C-1), 77.7 (C-3′′), 77.1 (C-2′′), 73.5 (C-3′), 73.0 (C-5′), 71.0 (C-4′′), 70.5 (C-2′), 68.0 (C-7), 67.5 (C-4′), 65.6 (C-6′), 61.6 (C-5′′), 43.7 (C-9), 30.3 (C-5), 30.1 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物8為6′--β--呋喃芹糖基獐牙菜苷。

化合物9：白色粉末。ESI-MS/: 377.1 [M＋H]+，C16H25O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.44 (1H, s, H-3), 5.76 (2H, m, H-1, 8), 5.50 (1H, d,= 2.0 Hz, H-10a), 5.25 (1H, d,= 2.0 Hz, H-10b), 4.67 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 3.55 (2H, m, H-7a, 7b), 2.60 (1H, m, H-9), 1.82 (1H, m, H-6a), 1.71 (1H, m, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 170.1 (C-11), 151.8 (C-3), 134.6 (C-8), 117.7 (C-10), 104.6 (C-4), 98.7 (C-1′), 96.2 (C-1), 76.9 (C-5′), 76.5 (C-3′), 73.2 (C-2′), 70.1 (C-4′), 68.3 (C-6′), 59.7 (C-7), 42.4 (C-9), 27.0 (C-6), 24.5 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[12]，故鑒定化合物9為demethylsecologanol。

化合物10：淺黃色粉末。ESI-MS/: 359.3 [M＋H]+，C16H23O9。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.49 (1H, s, H-3), 4.51 (1H, d,= 5.2 Hz, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 165.1 (C-11), 151.9 (C-3), 132.8 (C-8), 120.7 (C-10), 105.3 (C-4), 96.0 (C-1), 98.5 (C-1′), 77.8 (C-3′), 76.8 (C-5′), 73.6 (C-2′), 70.5 (C-4′), 68.1 (C-7), 61.5 (C-6′), 41.9 (C-9), 27.2 (C-5), 24.7 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物10為獐牙菜苷。

化合物11：淺灰色粉末。ESI-MS/: 389.4 [M＋H]+，C17H25O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.53 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3), 5.41 (2H, overlapped, H-1, 8), 5.34 (1H, m, H-7), 5.27 (1H, m, H-10a), 5.24 (1H, m, H-10b), 4.52 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 3.01 (1H, m, H-5), 2.87～3.17 (6H, m, H-5, 2′～6′), 2.64 (1H, m, H-9), 2.00 (1H, m, H-6a), 1.28 (1H, m, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 164.5 (C-11), 152.7 (C-3), 132.7 (C-8), 121.0 (C-10), 104.3 (C-4), 98.5 (C-7), 99.2 (C-1′), 96.7 (C-1), 77.8 (C-5′), 77.2 (C-3′), 73.6 (C-2′), 70.5 (C-4′), 61.5 (C-6′), 56.5 (OCH3), 41.8 (C-9), 30.4 (C-6), 24.0 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物11為斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯。

化合物12：黃色粉末。ESI-MS/: 389.4 [M＋H]+，C17H25O10。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.51 (1H, d,= 2.4 Hz, H-3), 5.52 (2H, m, H-l, 8), 5.32 (1H, m, H-7), 4.52 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′), 2.85～3.70 (6H, m, H-5, 2′～6′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 164.2 (C-11), 152.2 (C-3), 132.5 (C-8), 121.0 (C-10), 104.3 (C-4), 101.5 (C-1′), 99.2 (C-7), 96.0 (C-1), 77.8 (C-5′), 76.8 (C-3′), 73.5 (C-2′), 70.4 (C-4′), 61.4 (C-6′), 56.5 (OCH3), 41.7 (C-9), 28.9 (C-6), 21.8 (C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[14]，故鑒定化合物12為表斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯。

化合物13：淺黃色粉末。ESI-MS/: 463.4 [M＋H]+，C21H19O11。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.46 (1H, m, H-2), 7.43 (1H, d,= 4.0 Hz, H-6′), 6.92 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.80 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.76 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 5.10 (1H, d,= 4.4 Hz, H-1′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.3 (C-4), 164.9 (C-2), 163.4 (C-7), 161.6 (C-5), 157.4 (C-9), 150.4 (C-4′), 146.2 (C-3′), 121.9 (C-1′), 119.6 (C-6′), 116.4 (C-5'), 114.0 (C-2′), 105.8 (C-10), 103.6 (C-3), 100.4 (C-1′′), 100.0 (C-6), 95.2 (C-8), 77.6 (C-3′′), 76.9 (C-5′′), 73.6 (C-2′′), 70.0 (C-4′′), 61.1 (C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物13為木犀草素-7--β--葡萄糖苷。

化合物14：淺綠色粉末。ESI-MS/: 517.5 [M＋H]+，C25H25O12。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.53 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′), 7.47 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′′), 7.01 (1H, d,= 8.0 Hz, H-2′′), 7.01 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6′), 7.01 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6′′), 6.80 (1H, d,= 16.0 Hz, H-5′), 6.80 (1H, d,= 16.0 Hz, H-5′′), 6.28 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8′), 6.21 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8′′), 5.20 (2H, overlapped, H-3, 5), 3.85 (1H, m H-4), 1.98～2.15 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 176.2 (C-7), 166.6 (C-9′′), 166.2 (C-9′), 148.9 (C-4′′), 148.7 (C-4′), 146.1 (C-7′′), 146.0 (C-7′), 145.6 (C-3′′), 145.2 (C-3′), 126.1 (C-1′′), 126.0 (C-1′), 121.9 (C-6′′), 121.7 (C-6′), 116.3 (C-5′′), 116.2 (C-5′), 115.2 (C-2′′), 115.1 (C-2′), 114.6 (C-8′′), 114.1 (C-8′), 73.1 (C-1), 71.4 (C-5), 70.4 (C-3), 68.4 (C-4), 36.7 (C-6), 35.3 (C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物14為異綠原酸A。

化合物15：黃色粉末。ESI-MS/: 517.5 [M＋H]+，C25H25O12。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.51 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′), 7.45 (1H, d,= 16.0 Hz, H-7′′), 7.05 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 7.04 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′′), 6.99 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 6.98 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6′′), 6.77 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′), 6.76 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′′), 6.27 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8′), 6.18 (1H, d,= 16.0 Hz, H-8′′), 5.40 (1H, m, H-3), 4.99 (1H, s, H-4), 4.21 (1H, s, H-5), 2.05～2.24 (4H, m, H-2, 6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 175.3 (C-7), 166.5 (C-9′), 166.1 (C-9′′), 149.0 (C-4′), 148.9 (C-4′′), 146.0 (C-7′, 7′′), 145.9 (C-3′, 3′′), 125.9 (C-1′, 1′′), 122.0 (C-6′), 121.9 (C-6′′), 116.3 (C-5′), 116.2 (C-5′′), 115.2 (C-2′), 115.1 (C-2′′), 114.3 (C-8′), 114.1 (C-8′′), 74.1 (C-1), 73.9 (C-4), 68.1 (C-3), 66.9 (C-5), 37.9 (C-2), 37.7 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[17]，故鑒定化合物15為異綠原酸B。

化合物16：淺黃色粉末。ESI-MS/: 447.4 [M－H]?，C21H19O11。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.45 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6′), 6.90 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.79 (1H, s, H-8), 6.75 (1H, s, H-3), 6.40 (1H, d,= 16.0 Hz, H-6), 5.08 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.3 (C-4), 165.0 (C-2), 163.4 (C-7), 161.6 (C-9), 157.4 (C-5), 150.8 (C-3′), 146.4 (C-4′), 121.5 (C-6′), 119.7 (C-1′), 116.4 (C-5′), 113.8 (C-2′), 105.8 (C-10), 103.5 (C-3), 100.4 (C-1′′), 100.0 (C-6), 95.2 (C-8), 77.6 (C-5′′), 76.9 (C-3′′), 73.6 (C-2′′), 70.1 (C-4′′), 61.1 (C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[18]，故鑒定化合物16為木犀草苷。

化合物17：黃色粉末。ESI-MS/: 581.0 [M＋H]+，C26H29O15。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.49 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6′), 7.46 (1H, d,= 7.6 Hz, H-2′), 6.92 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.80 (1H, d,= 1.2 Hz, H-8), 6.75 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 1.2 Hz, H-6), 5.09 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1′′), 4.18 (1H, d,= 6.4 Hz, H-1′′′), 3.95 (1H, d,= 10.8 Hz, H-6′′), 3.31～3.76 (8H, m, H-2′′～5′′, 2′′′～5′′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.3 (C-4), 165.1 (C-2), 163.3 (C-7), 161.6 (C-5), 157.4 (C-9), 150.7 (C-4′), 146.3 (C-3′), 121.6 (C-1′), 119.7 (C-6′), 116.5 (C-5′), 114.0 (C-2′), 105.9 (C-10), 103.5 (C-3), 103.5 (C-1′′′), 100.3 (C-1′′), 100.1 (C-6), 95.2 (C-8), 76.6 (C-5′′), 76.0 (C-3′′), 73.5 (C-2′′), 72.9 (C-2′′′), 71.0 (C-3′′′), 69.9 (C-4′′), 68.0 (C-6′′), 67.6 (C-4′′′), 65.1 (C-5′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[19]，故鑒定化合物17為木犀草素-7--[α--吡喃阿拉伯糖基-(1→6)]-β--吡喃葡萄糖苷。

化合物18：淺黃色粉末。ESI-MS/: 441.2 [M＋Na]+，C20H18O10Na。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.47 (1H, dd,= 8.0, 2.0 Hz, H-6′), 7.45 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.90 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5′), 6.78 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.74 (1H, s, H-3), 6.48 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 5.06 (1H, d,= 8.0 Hz, H-1′′), 3.25～3.88 (5H, m, H-2′′～5′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.3 (C-4), 165.1 (C-2), 163.3 (C-7), 161.7 (C-5), 157.4 (C-9), 151.0 (C-4′), 146.4 (C-3′), 121.4 (C-1′), 119.7 (C-6′), 116.5 (C-5′), 113.9 (C-2′), 105.8 (C-10), 103.4 (C-3), 100.4 (C-6), 100.0 (C-1′′), 95.2 (C-8), 77.0 (C-3′′), 73.8 (C-2′′), 70.0 (C-4′′), 66.1 (C-5′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[20]，故鑒定化合物18為木犀草素-7--木糖。

化合物19：黃色粉末。ESI-MS/: 593.5 [M－H]?，C27H29O15。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 13.17 (1H, s, 5-OH), 7.45 (1H, dd,= 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 7.42 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′), 6.92 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.77 (1H, s, H-3), 6.75 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.38 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 5.26 (1H, d,= 7.2 Hz, H-1′′), 5.14 (1H, s, H-1′′′), 3.22～3.79 (m, H-2′′～6′′, 2′′′～5′′′), 1.21 (3H, d,= 7.6 Hz, H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 182.3 (C-4), 165.0 (C-2), 163.0 (C-7), 161.6 (C-5), 157.4 (C-9), 150.5 (C-4′), 146.3 (C-3′), 121.7 (C-1′), 119.6 (C-6′), 116.5 (C-5′), 114.0 (C-2′), 105.9 (C-10), 103.7 (C-3), 100.9 (C-1′′′), 99.8 (C-1′′), 98.2 (C-6), 94.8 (C-8), 77.6 (C-2′′), 77.5 (C-3′′), 76.8 (C-5′′), 72.3 (C-4′′′), 71.0 (C-3′′′), 70.9 (C-2′′′), 70.1 (C-4′′), 68.8 (C-5′′′), 61.0 (C-6′′), 18.6 (C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[21]，故鑒定化合物19為忍冬苷。

4 體外保肝活性評價

4.1 APAP誘導HepG2細胞肝損傷模型的建立

將人肝癌HepG2細胞以2×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h，待細胞完全貼壁后，分別給予1.875、3.75、7.5、15、30 mmol/L濃度的APAP進行造模，對照組不加APAP，每個濃度平行6個復孔，孵育48 h后，每孔加入1 mg/mL的MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。試驗重復進行3次。多功能酶標儀490 nm波長下測定各孔的吸光度（）值，并計算細胞存活率，結(jié)果見圖1。

圖1 APAP對HepG2細胞活性的影響

如圖1所示，與對照組相比，隨著APAP誘導濃度的增加，HepG2細胞存活率逐漸降低。其中7.5 mmol/L的APAP誘導48 h，細胞存活率為50%左右，肝損傷模型通常選用細胞存活半數(shù)的濃度進行模型構(gòu)建。故選用7.5 mmol/L的APAP誘導HepG2細胞48 h作為肝損傷模型并開展后續(xù)保肝活性篩選實驗。

4.2 保肝活性實驗

取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入濃度為2×105個/mL的細胞懸液100 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)12 h后，吸出原培養(yǎng)液棄去，分對照組、模型組、實驗組，對照組加入100 μL新鮮培養(yǎng)基，模型組加入100 μL的含7.5 mmol/L APAP培養(yǎng)基，陽性對照組加入100 μL雙環(huán)醇（10 μmol/L）的培養(yǎng)基（含7.5 mmol/L APAP），實驗組加入100 μL受試藥物（10 μmol/L）的培養(yǎng)基（含7.5 mmol/L APAP），每個濃度平行6個復孔。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入1 mg/mL的MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩，使結(jié)晶物充分溶解。多功能酶標儀490 nm處測量各孔的吸光度（）值，試驗重復進行3次，并按下式計算抑制率[22]，結(jié)果見圖2。

抑制率＝(實驗－模型)/(對照－模型)

圖2 化合物體外保肝活性結(jié)果

由圖2可知，化合物2～11、13～15、17作用于APAP誘導損傷的HepG2肝細胞，抑制率明顯升高，說明具有一定的抵抗APAP引起的肝損傷作用；相較于陽性對照藥雙環(huán)醇，化合物2、3、5、7～9、11、13、15的抑制率均高于10.6%，高于陽性對照組，表明以上化合物的保肝活性要強于陽性對照藥。采用GraphPad Prism 5.0軟件對所得數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

5 討論

忍冬葉和金銀花均來源于同一種藥用植物忍冬，忍冬葉作為金銀花的副產(chǎn)品，古時有“花與葉同功[23]”，在現(xiàn)代研究中也表明了忍冬葉與金銀花均含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機酸、揮發(fā)油等化學成分，并且在抗病原微生物、抗炎、抗氧化等藥理活性方面具有相似作用[24-25]。據(jù)上述可知，忍冬葉有望作為金銀花的代用品[26]。

本研究通過忍冬葉化學成分的系統(tǒng)分離，從忍冬葉醇提物中分離得到19個化合物，其中包括6個有機酸類化合物（咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B）、5個黃酮類化合物（木犀草素-7--β--葡萄糖苷、木犀草苷、木犀草素-7--[α--吡喃阿拉伯糖基-(1→6)]-β--吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7--木糖、忍冬苷）、8個環(huán)烯醚萜類化合物（斷氧化馬錢苷酸、8-表番木鱉酸、馬錢苷酸、6′--β--呋喃芹糖基獐牙菜苷、demethylsecologanol、獐牙菜苷、斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯、表斷馬錢子苷半縮醛內(nèi)酯），其中化合物1、2、8、11、12、18均首次從忍冬葉中分離得到，化合物18首次從忍冬植物中分離得到。

APAP是目前臨床使用較為廣泛的一種解熱鎮(zhèn)痛藥，經(jīng)肝臟代謝，過量會造成一定的肝損傷，常用于制備藥物性肝損傷模型，來篩選具有保肝活性的藥物。本實驗通過APAP誘導的HepG2肝細胞損傷模型，利用MTT法對化合物單體進行保肝活性篩選，并選用雙環(huán)醇為陽性對照藥。結(jié)果表明，化合物2～11、13～15、17對APAP誘導的HepG2細胞損傷具有一定保護作用，在給藥10 μmol/L濃度下，化合物2、3、5、7～9、11、13、15的保肝活性強于陽性對照藥，而其他化合物未顯示出明顯的保肝活性。本研究通過對忍冬葉的化學成分和保肝活性的研究，進一步明確忍冬葉保肝活性的藥效物質(zhì)基礎，為忍冬葉開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents fromleaves and their hepatoprotective activities

WANG Kai1, 2, LIU Shuang2, LI Meng2, LI Li-li2, YU Jin-qian2, WANG Xiao2

1. School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250300, China 2. Shandong Key Laboratory for Applied Technology of Sophisticated Analytical Instruments, Shandong Analysis and Test Center, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250014, China

To study the chemical constituents ofleaves and their hepatoprotective activities.The chemical constituents fromleaves were isolated and purified by the chromatography on silica gel column, reversed-phase C18column, Sephadex LH-20 column, and semi-preparative HPLC and their structures were identified by various spectroscopic analysis. In this experiment, anhepatocyte injury model was used, and the MTT method was used to detect the effects of compounds against acetaminophen (APAP)-induced injury of human liver cancer HepG2 cells.Nineteen compounds were isolated from the ethanol extract ofleaves, which were identified as secologanoside (1), 8-epiloganic acid (2), loganic acid (3), caffeic acid (4), chlorogenic acid (5), cryptochlorogenic acid (6), neochlorogenic acid (7), 6′--β--apiofuranosyl sweroside (8), demethylsecologanol (9), sweroside (10), vogeloside (11),-vogeloside (12) , luteolin-7--β--glucoside (13), isochlorogenic acid A (14), isochlorogenic acid B (15), cynaroside (16), luteolin-7--[α-- pyranafinosyl-(1→6)]-β--glucopyranoside (17), luteolin-7--xyloside (18) and lonicerin (19). Among them, compounds 2—11, 13—15, 17 showed significant anti-APAP liver injury effects.Compounds 1, 2, 8, 11, 12 and 18 are isolated fromleaves for the first time, while compound 18 is obtained fromfor the first time. Compounds 2—11, 13—15, 17 showed significant hepatoprotective activities.

leaves; hepatoprotective activity; secologanoside; 8-epiloganic acid; 6′--β--apiofuranosyl sweroside; vogeloside

R284.1

A

0253 - 2670(2022)08 - 2285 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.004

2021-12-03

山東省重大科技創(chuàng)新工程（2021CXGC010508）；國家自然科學基金項目（21904080）；濟南市“高校20條”項目（2020GXRC007）

王 凱，男，碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量控制。E-mail: 987878472@qq.com

王 曉，男，研究員，從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: wangx@sdas.org

[責任編輯 王文倩]