無(wú)葉假木賊的化學(xué)成分及抗菌活性研究

孫 艷，沈慶國(guó)，屈玲霞，趙森森，張娜娜，王竣楠，郇旭升，莊華青，張 麗，關(guān)永霞*，汪 冶

無(wú)葉假木賊的化學(xué)成分及抗菌活性研究

孫 艷1, 2，沈慶國(guó)1, 2，屈玲霞1, 2，趙森森1, 2，張娜娜1, 2，王竣楠1, 2，郇旭升1, 2，莊華青1, 2，張 麗1, 2，關(guān)永霞1, 2*，汪 冶3*

1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006 3. 麗水學(xué)院，浙江 麗水 323000

研究無(wú)葉假木賊的化學(xué)成分及其抗菌活性。采用RP-C18、Sephadex LH-20、硅膠等柱色譜進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)。采用MTT比色法對(duì)化合物進(jìn)行抗枯草芽孢桿菌、番茄瘡痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌pv.活性篩選。從無(wú)葉假木賊中分離了10個(gè)化合物，分別鑒定為假木賊堿（1）、-甲基假木賊堿（2）、6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3-ol（3）、2-(2-(pyridine-3-yl) pyridin-5-yl)-6- (pyridin-3-yl)piperidine（4）、2-(pyridine-3-yl)-5-(6-(pyridine-3-yl) pyridine-2-yl) pyridine（5）、白羽扇豆堿（6）、12-甲基金雀花堿（7）、金雀花堿（8）、水楊酸（9）、香草酸（10）?；衔?對(duì)番茄瘡痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）分別為20.0、10.0、10.0、20.0 μg/mL?；衔?和5為新化合物，分別命名為無(wú)葉假木賊堿A和無(wú)葉假木賊堿B；化合物6～10為首次從該屬植物中分離得到?；衔?具有明顯的抗菌活性；從無(wú)葉假木賊中分離得到的生物堿類化合物1～8對(duì)上述病原微生物抑制作用不明顯。

無(wú)葉假木賊；生物堿；抗菌活性；無(wú)葉假木賊堿A；無(wú)葉假木賊堿B；白羽扇豆堿；12-甲基金雀花堿；金雀花堿

無(wú)葉假木賊L.為藜科假木賊屬植物[1]，又稱毒藜、無(wú)葉毒藜、阿那培斯、木煙等，半灌木，高20～50 cm。主要分布于我國(guó)甘肅西部、新疆，歐洲、中亞以及俄羅斯西伯利亞也有分布，生長(zhǎng)于荒漠、戈壁、沙丘及干旱山坡[2]。該植物具有殺蟲止癢的功效，可用于治療疥癬、疥瘡和濕疹癢痛；民間主要用于防治菜青蟲、蚜蟲等多種害蟲[3]。目前報(bào)道的化學(xué)成分主要有生物堿、萜類、皂苷類和生物大分子等[4]，表現(xiàn)出抗膽堿酯酶活性、抗微生物和殺蟲等活性[5-6]。

我國(guó)對(duì)該植物化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，為了明確無(wú)葉假木賊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，合理開發(fā)其藥用資源，本實(shí)驗(yàn)對(duì)無(wú)葉假木賊地上部分95%乙醇提取物開展了化學(xué)成分研究及抗菌活性研究。從中分離得到10個(gè)化合物（圖1），分別鑒定為假木賊堿（anabasine，1）、-甲基假木賊堿（-methyl anabasine，2）、6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3-ol（3）、2-(2-(pyridine-3-yl) pyridin-5-yl)-6-(pyridin-3- yl)piperidine（4）、2-(pyridine-3-yl)-5-(6-(pyridine-3- yl)pyridine-2-yl)pyridine（5）、白羽扇豆堿（lupanine，6）、12-甲基金雀花堿（12-methylcytisine，7）、金雀花堿（cytisine，8）、水楊酸（2-hydroxybenzoic acid，9）、香草酸（vanillic acid，10）。其中化合物3和5為新化合物；化合物6～10為首次從該屬植物中分離得到。化合物9具有明顯的抗菌活性，對(duì)番茄瘡痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌pv.的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）為20.0、10.0、10.0、20.0 μg/mL。化合物10具有一定的抗細(xì)菌活性，對(duì)溶血葡萄球菌和根癌土壤桿菌的MIC均為50.0 μg/mL。從無(wú)葉假木賊中分離得到的生物堿類化合物1～8對(duì)上述病原微生物抑制作用不明顯。

圖1 化合物1～10的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

INOVA-400核磁共振儀（Varian公司，美國(guó)）；HP-5973型質(zhì)譜儀、HP1100MSD（ESI）型質(zhì)譜儀（Agilent公司，美國(guó)）；Waters 2489型液相色譜儀（Waters公司，美國(guó)），半制備用色譜柱為SunFireTM-C18（Waters，150 mm×10 mm，10 μm）柱和Kromasil-C18（Kromasil，250 mm×10 mm，5 μm）柱；Rotavapor R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Büchi公司，瑞士）；柱色譜材料：粗硅膠40～80目、柱色譜硅膠200～300目、薄層色譜硅膠H（60型）、薄層色譜硅膠GF254及預(yù)制硅膠板GF254（青島海洋化工有限公司）；反相色譜硅膠（RP-C18，德國(guó)Merck公司）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（Amersham Pharmacia Biotech公司）。

藥材采自新疆石河子，由新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院閆平教授鑒定為無(wú)葉假木賊L. 地上部分，樣本（000156）存放于貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?？咕钚运镁N由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系提供。

2 提取與分離

干燥的無(wú)葉假木賊地上部分（13.0 kg），用8倍量95%乙醇加熱提取3次，每次3 h，合并提取液。減壓濃縮提取液至無(wú)醇味，得到乙醇粗提物，用蒸餾水加熱溶解制成水懸液。首先，用10%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0左右，醋酸乙酯萃取，濃縮后得到醋酸乙酯組分（116.0 g）；剩余的水溶液，用10%的氨水調(diào)節(jié)pH值至9.0左右，氯仿萃取次，減壓濃縮萃取液，得到氯仿部分（生物堿組分118.5 g）和水部分[7]。

氯仿部位加適量甲醇和氯仿溶解，經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝膠柱色譜, 得到生物總堿。生物總堿部分經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-二乙胺梯度洗脫（6∶1～1∶1），通過(guò)TLC檢測(cè)合并相似組分后得到6個(gè)部分（Fr. 1～6）。Fr. 1經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝膠柱色譜和反相硅膠（RP-C18）柱色譜分離純化，分別得到化合物2（239.0 mg）和4（62.0 mg）。Fr. 2經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-二乙胺（5∶1～4∶1）洗脫，再經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20（甲醇）凝膠柱色譜，得到化合物3（39.0 mg）、7（20.0 mg）和8（15.0 mg）。Fr. 3經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝膠柱色譜、反相硅膠（RP-18）柱色譜（甲醇-水60∶40）和半制備型高效液相色譜儀（pre-HPLC，甲醇-水70∶30，ODS柱）分離純化，得到化合物6（18.0 mg）。其中Fr. 4經(jīng)Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）凝膠柱色譜、正相硅膠（硅膠300～400目）柱色譜 [石油醚-二乙胺（3∶1～2∶1）]，得到化合物1（32.0 mg）和5（14.0 mg）。

醋酸乙酯部位氯仿溶解后經(jīng)用石油醚、石油醚-醋酸乙酯（80∶1～1∶1）梯度洗脫，通過(guò)TLC檢測(cè)合并相似組分后得到4個(gè)部分（Fr. 7～10），F(xiàn)r. 7經(jīng)硅膠常壓柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（60∶1～10∶1）梯度洗脫，洗脫液采用薄層色譜檢測(cè)，合并相同組分，進(jìn)一步分離，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（氯仿-甲醇1∶1）色譜純化，得到化合物9（20.0 mg）和10（19.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)，ESI-MS/: 163 [M＋H]+；C10H14N2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.63 (1H, s, H-2′), 8.49 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6′), 7.85 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′), 7.26 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5′), 5.85 (1H, -NH, brs), 3.80 (1H, dd,= 3.2, 11.2 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 148.8 (C-2′), 148.7 (C-6′), 137.6 (C-3′), 134.7 (C-4′), 123.5 (C-5′), 58.9 (C-2), 46.5 (C-6), 32.7 (C-3), 24.2 (C-5), 23.9 (C-4). 以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，故鑒定化合物1為假木賊堿。

化合物2：黃色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)，ESI-MS/: 177 [M＋H]+；C11H16N2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.58 (1H, s, H-2′), 8.48 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6′), 7.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′), 7.25 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5′), 2.18 (3H, s, -CH3)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 148.5 (C-2′), 148.4 (C-6′), 140.6 (C-3′), 134.1 (C-4′), 123.4 (C-5′), 59.7 (C-2), 47.5 (C-6), 34.7 (C-3), 29.2 (-CH3), 25.6 (C-5), 25.1 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9-10]，故鑒定化合物2為-甲基假木賊堿。

化合物3：黃色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)，推斷為生物堿類化合物。EI-MS: 243 (M+，80), 228 (90), 214 (100), 200 (93)；ESI-MS: 244 [M＋H]+，266 [M＋Na]+；表明該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為243，提示含有奇數(shù)個(gè)氮原子。

1H-NMR (400 MHz, DMSO-6) 低場(chǎng)區(qū)H9.24 (2H, s), 8.46 (1H, d,= 4.8 Hz), 8.40 (1H, d,= 8.0 Hz), 7.42 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz) 提示有ABX偶合系統(tǒng)；H7.20 (1H, d,= 8.4 Hz), 6.55 (1H, d,= 8.4 Hz) 提示有相鄰芳香質(zhì)子；在高場(chǎng)區(qū)H3.45 (4H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (6H, t,= 7.2 Hz) 提示有對(duì)稱乙基結(jié)構(gòu)片段。13C-NMR (100 MHz, DMSO-6) 低場(chǎng)區(qū)有10個(gè)碳原子信號(hào)，分別是C151.0 (s), 149.5 (d), 147.8 (d), 142.8 (s), 136.9 (s), 135.5 (d), 134.4 (s), 127.9 (d), 123.0 (d), 106.8 (d)，在高場(chǎng)區(qū)有2個(gè)碳信號(hào)C42.1 (t), 13.1 (q)。結(jié)合質(zhì)譜、氫譜和碳譜數(shù)據(jù)分析可推測(cè)該化合物的分子式為C14H17N3O，不飽和度Ω＝8，提示含有2個(gè)吡啶結(jié)構(gòu)單元，從H3.45 (4H, q,= 7.2 Hz), 1.10 (6H, t,= 7.2 Hz) 和C42.1 (t), 13.1 (q) 可以推測(cè)含有-(CH2CH3)2結(jié)構(gòu)單元。還有1個(gè)羥基化學(xué)位移在H9.24與吡啶單元質(zhì)子信號(hào)重疊。

2個(gè)吡啶單元取代情況需要借助二維譜解析。從HMBC譜可以看出H3.45 (H-1″) 與C151.0 (C-6) 相關(guān)，H7.20 (H-4) 與C151.0 (C-6), 136.9 (C-2),142.8 (C-3) 相關(guān)。H6.55 (H-5) 與C142.8 (C-3) 相關(guān)，羥基質(zhì)子H9.24與C142.8 (C-3) 和C136.9 (C-2) 相關(guān)。從以上-(CH2CH3)2和羥基在同一個(gè)吡啶結(jié)構(gòu)單元中并確定它們的取代位置。通過(guò)H7.42 (H-5′) 分別與C147.8 (C-6′), 135.5 (C-4′), 134.4 (C-3′) 相關(guān)，8.40 (H-4′) 與136.9 (C-2) 相關(guān)，H9.24 (H-2′) 分別與134.4 (C-3′), 136.9 (C-2) 相關(guān)可以確定另一個(gè)吡啶結(jié)構(gòu)單元取代位置，由此確定2個(gè)吡啶結(jié)構(gòu)單元的連接方式。因此確定化合物3的結(jié)構(gòu)為6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3-ol，其結(jié)構(gòu)和HMBC主要相關(guān)見圖2。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定化合物3是新化合物，命名為無(wú)葉假木賊堿A。氫譜和碳譜數(shù)據(jù)詳細(xì)歸屬見表1。

圖2 化合物3的結(jié)構(gòu)和HMBC圖譜

表1 化合物3的氫譜(400 MHz, DMSO-d6) 和碳譜(100 MHz, DMSO-d6) 數(shù)據(jù)

Table 1 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) and 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) data of compound 3

碳位δCδHDEPT碳位δCδHDEPT 1 2′149.59.24 (1H, s)CH 2136.9 C3′134.4 C 3142.8 C4′135.58.40 (1H, d, J = 8.0 Hz)CH 4127.97.20 (1H, d, J = 8.4 Hz)CH5′123.07.42 (1H, dd, J = 8.0, 4.8 Hz)CH 5106.86.55 (1H, d , J = 8.4 Hz)CH6′147.88.46 (1H, d, J = 4.8 Hz)CH 6151.0 C1″42.13.45 (4H, q, J = 7.2 Hz)CH2 1′ 2″13.11.10 (6H, t, J = 7.2 Hz)CH3

化合物4：黃色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)，ESI-MS/: 317 [M＋H]+；C20H20N4，1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 9.17 (1H, s, H-2"), 8.75 (1H, s, H-6′), 8.66 (1H, s, H-2′′′), 8.63 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6"), 8.50 (1H, d,= 4.8 Hz, H-6′′′), 8.31 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′′), 7.95 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′), 7.83 (1H, d,= 8.0 Hz, H-4′′′), 7.30 (1H, d,= 8.0 Hz, H-3′), 7.40 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5), 7.28 (1H, dd,= 4.8, 8.0 Hz, H-5′′′), 3.94 (1H, d,= 10.2 Hz, H-2), 3.90 (1H, d,= 10.2 Hz, H-6), 2.03 (1H, m, Ha-4), 1.69 (1H, m, He-4), 1.84 (2H, m, Ha-3, 5), 1.60 (2H, m, He-3, 5)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 153.7 (C-2′), 149.7 (C-6′′), 148.9 (C-6′), 148.7 (C-6′′′), 148.6 (C-2′′′), 148.0 (C-2), 140.4 (C-3′′′), 139.8 (C-5′), 135.4 (C-4′), 134.7 (C-3), 134.4 (C-4′′′), 134.2 (C-4), 123.5 (C-5), 123.4 (C-5′′′), 120.4 (C-3′), 59.9 (C-6), 59.6 (C-2), 34.4 (C-3, 5), 25.3 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故鑒定化合物4為2-(2-(pyridin-3-yl) pyridin-5-yl)- 6-(pyridin-3-yl) piperidine。

化合物5：淡黃色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)，推斷可能為生物堿類化合物。EI-MS: 310 (M+，100)；ESI-MS: 311 [M＋H]+；表明該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量為310；1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 顯示質(zhì)子信號(hào)全部位于低場(chǎng)區(qū)，其中H9.44, 9.35, 9.29提示含有3個(gè)吡啶結(jié)構(gòu)單元，1H-1H COSY譜顯示，H-2′′/H-6′′/H-4′′，H-2′′′/H-6′′′/H-4′′′，H-3/H-4/H-5存在相關(guān)。提示含有2個(gè)3-取代吡啶結(jié)構(gòu)單元，分別是H9.35 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2′′), 8.69 (1H, t,= 8.0, 3.6 Hz, H-6′′), 8.42 (1H, dd,= 8.0, 3.6 Hz, H-4′′), 7.46 (1H, t,= 8.0 Hz, H-5′′) 和H9.29 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2′′′), 8.69 (1H, t,= 8.0, 3.6 Hz, H-6′′′), 8.49 (1H, dd,= 8.0, 4.0 Hz, H-4′′′), 7.46 (1H, t,= 8.0 Hz, H-5′′′)。還有1個(gè)2,5-二取代吡啶結(jié)構(gòu)單元H9.44 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6′), 8.59 (1H, dd,= 2.0, 8.4 Hz, H-4′), 7.92 (1H, d,= 8.4 Hz, H-3′)。另外從H7.94 (1H, t,= 8.0 Hz, H-4), 7.84 (1H, d,= 8.0 Hz, H-3), 7.80 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5) 可知還有1個(gè)2,6-二取代吡啶結(jié)構(gòu)單元。13C-NMR譜給出20個(gè)碳信號(hào)峰，結(jié)合DEPT譜將它們歸屬為14個(gè)叔碳和6個(gè)季碳，結(jié)合質(zhì)譜和氫譜分析可推斷其分子式為C20H14N4，不飽和度為16，因此結(jié)構(gòu)中有4個(gè)吡啶環(huán)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 數(shù)據(jù)顯示骨架與化合物4相似，在低場(chǎng)區(qū)比化合物4多出1個(gè)吡啶結(jié)構(gòu)單元，在高場(chǎng)區(qū)沒(méi)有出現(xiàn)哌啶環(huán)結(jié)構(gòu)信息。

從HMBC圖譜（圖3）可以觀察到H9.29 (H-2′′′), 8.49 (H-4′′′) 分別與C154.6 (C-6) 相關(guān)，H9.44 (H-6′), 8.59 (H-4′), 8.42 (H-4′′) 分別與C154.8 (C-2′) 相關(guān)，H7.92 (H-3′) 與C134.3 (C-3′′) 相關(guān)，H7.84 (H-3) 分別與C133.4 (C-5′), 154.1 (C-2) 相關(guān)。從而確定4個(gè)吡啶環(huán)連接順序，通過(guò)HMQC譜將C和H的關(guān)系進(jìn)行了歸屬。由此將化合物5的結(jié)構(gòu)確定為6-(diethylamino)-[2,3′-bipyridin]-3- ol，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，確定化合物5為新化合物，命名為無(wú)葉假木賊堿B，1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 和13C-NMR (100 MHz, CDCl3) 數(shù)據(jù)見表2。

圖3 化合物5結(jié)構(gòu)和1H-1H COSY、HMBC圖譜

表2 化合物5的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(400/100 MHz, CDCl3)

Table 2 1H-NMRand 13C-NMR data of compound 5(400/100 MHz, CDCl3)

碳位δCδHDEPT碳位δCδHDEPT 1 1′′ 2133.4 C2′′148.39.35 (1H, d, J = 2.0 Hz)CH 3119.47.84 (1H, d, J = 8.0 Hz)CH3′′134.3 C 4138.17.94 (1H, t, J = 8.0 Hz)CH4′′134.48.42 (1H,dd, J = 8.0, 3.6 Hz)CH 5119.47.80 (1H, d, J = 8.0 Hz)CH5′′123.67.46 (1H,t, J = 8.0 Hz)CH 6154.6 C6′′150.18.69 (1H, dd, J = 8.0, 3.6 Hz)CH 1′ 1′′′ 2′154.8 C2′′′148.39.29 (1H, d, J = 1.6 Hz)CH 3′120.47.92 (1H, d, J = 8.4 Hz)CH3′′′134.3 C 4′135.38.59 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz)CH4′′′134.48.49 (1H, dd, J = 8.0, 4.0 Hz)CH 5′133.4 C5′′′123.67.46 (1H, t, J = 8.0 Hz)CH 6′148.59.44 (1H, d, J = 2.0 Hz)CH6′′′150.18.69 (1H, dd, J = 8.0, 3.6 Hz)CH

化合物6：無(wú)色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)；ESI-MS/: 249 [M]+；分子式C15H24N2O。1H-NMR (400 MHZ, CDCl3): 1.80 (2H, m, H-3), 1.84 (2H, m, H-4), 2.01 (2H, m, H-7), 1.48 (1H, m, H-8α), 1.78 (1H, d,= 12.0 Hz, H-8β), 1.77 (1H, m, H-9), 2.29 (1H, m, H-10β), 4.61 (1H, m, H-10α), 2.11 (1H, m, H-11), 1.78 (1H, d,= 12.0 Hz, H-13β), 1.39 (1H, m, H-13α), 4.48 (1H, m, H-14), 2.77 (1H, d,= 8.0 Hz, H-15β), 1.80 (1H, m, H-15α), 2.58 (1H, d,= 8.0 Hz, H-17β), 1.83 (1H, m, H-17α)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 169.4 (C-2), 65.6 (C-11), 60.1 (C-6), 54.5 (C-15), 51.5 (C-17), 46.6 (C-10), 37.6 (C-9), 34.5 (C-7), 34.0 (C-3), 32.5 (C-12), 29.1 (C-5), 28.9 (C-8), 22.3 (C-4), 23.3 (C-14), 23.0 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8,13]，故鑒定化合物6為白羽扇豆堿。

化合物7：無(wú)色油狀物；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)；ESI-MS/: 205 [M＋H]+；C12H16ON2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.28 (1H, m, H-4), 6.32 (1H, d,= 7.0 Hz, H-3), 6.07 (1H, dd,= 6.7, 1.2 Hz, H-5), 3.88 (1H, d,=12.2 Hz, H-10eq), 3.72 (1H, d,= 12.1 Hz, H-10ax), 3.00～3.18 (4H, m, H-11, 13), 2.90 (1H, m, H-7), 2.04 (3H, s,-CH3), 1.79 (2H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 162.1 (C-2), 151.1 (C-6), 138.8 (C-4), 115.7 (C-3), 103.4 (C-5), 59.6 (C-13), 58.2 (C-11), 49.4 (C-10), 45.6 (C-14), 35.5 (C-7), 27.6 (C-9), 25.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，故鑒定化合物7為12-甲基金雀花堿。

化合物8：白色針狀晶體（丙酮）；改良碘化鉍鉀溶液噴霧顯色呈紅色斑點(diǎn)；mp 154～155 ℃；ESI-MS/: 191 [M＋H]+；C11H14N2O。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 7.31 (1H, dd,= 9.0, 6.7 Hz, H-4), 6.45 (1H, d,= 9.0 Hz, H-3), 5.95 (1H, dd,= 6.7, 1.2 Hz, H-5), 4.08 (1H, d,=15.6 Hz, H-10eq), 3.88 (1H, dd,= 15.6, 6.6 Hz, H-10ax), 2.85～3.14 (5H, m, H-11, 13, 7), 2.34 (1H, m, H-9), 1.90 (2H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 164.3 (C-2), 150.1 (C-6), 138.8 (C-4), 116.7 (C-3), 103.0 (C-5), 54.0 (C-13), 53.0 (C-11), 49.9 (C-10), 35.7 (C-7), 28.6 (C-9), 26.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]，故鑒定化合物8為金雀花堿。

化合物9：白色粉末；ESI-MS/: 139 [M＋H]+；C7H6O3。1H NMR (400 MHz, CD3COCD3): 7.87 (1H, m, H-6), 7.52 (1H, m, H-4), 6.93 (2H, m, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3): 113.1 (C-1), 162.9 (C-2), 118.0 (C-3), 136.7 (C-4), 119.9 (C-5), 131.2 (C-6), 172.7 (C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[15-16]，故鑒定化合物9為水楊酸。

化合物10：白色粉末；ESI-MS/: 169 [M＋H]+；C8H8O4；1H NMR (400 MHz, CD3OD): 7.89 (1H, s, H-6), 7.54 (1H, s, H-2), 6.83 (1H, d,= 8.8 Hz, H-5), 3.88 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.1 (s, COOH), 113.7 (s, C-1), 115.8 (d, C-2), 148.6 (s, C-3), 152.6 (s, C-4), 123.1 (d, C-5), 125.3 (d, C-6), 56.3 (q, OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，故鑒定化合物10為香草酸。

4 抗菌活性篩選

本實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法（MTT colorimetric assay method）對(duì)化合物1～10進(jìn)行抗5種菌株（枯草芽孢桿菌、番茄瘡痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌pv.）活性篩選，具體步驟如下：將供試菌種接種到LB固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h。接種于25 mL LB液體培養(yǎng)基中，25 ℃搖培。用無(wú)菌水把生長(zhǎng)后的菌液校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)（×108CFU/mL），再用LB液體培養(yǎng)基1∶100稀釋，將菌液稀釋到×106CFU/mL。將90 μL×106CFU/mL的菌液加到96孔培養(yǎng)板中；再分別加入10 μL的測(cè)試樣品液，分別設(shè)空白對(duì)照（水）組、溶劑對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照（硫酸鏈霉素）組、加藥組。每組設(shè)4次重復(fù)；培養(yǎng)板四周用封口膜封好，培養(yǎng)24 h；每孔中加入5 mg/mL 10 μL MTT溶液，共培養(yǎng)4 h后，在96孔培養(yǎng)板中無(wú)藍(lán)紫色物質(zhì)生成的藥劑最低濃度即為MIC，結(jié)果見表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物9具有較強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)番茄瘡痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌的MIC為20.0、10.0、10.0、20.0 μg/mL；化合物10對(duì)以上4種靶標(biāo)細(xì)菌的MIC分別為100.0、50.0、50.0、100.0 μg/mL；從無(wú)葉假木賊中分離得到的生物堿類化合物1～8未對(duì)上述5種植物病原微生物表現(xiàn)出明顯的抑制活性。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了無(wú)葉假木賊的化學(xué)成分及其抗菌活性，采用現(xiàn)代色譜技術(shù)手段分離鑒定了10個(gè)化合物，其中化合物1～5哌啶類生物堿，6～8為喹諾里西啶類生物堿，9～10為苯甲酸類衍生物?；衔?和5為新化合物，化合物6～10為首次從該屬植物中分離得到。

表3 化合物1～10對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度

Table 3 Minimal inhibitory concentration (MIC) of compounds 1—10 on bacteria growth

化合物MIC/(μg·mL?1)B. subtilisX. vesicatoriaS. haemolyticusA. tumefaciensP. syringae pv.lachrymans 1100.0100.0100.0100.0100.0 2100.0100.0200.0100.0100.0 3100.0100.0200.0100.0100.0 4100.0100.0100.0100.0100.0 5100.0100.0100.0100.0100.0 6100.0100.0200.0100.0100.0 7100.0100.0100.0100.0100.0 8100.0100.0100.0100.0100.0 950.020.010.010.020.0 10100.0100.050.050.0100.0 硫酸鏈霉素5.05.01.02.01.5

對(duì)分離得到的10個(gè)化合物進(jìn)行抗菌活性篩選，研究結(jié)果表明化合物9對(duì)番茄瘡痂病菌、溶血葡萄球菌、根癌土壤桿菌、黃瓜角斑病菌表現(xiàn)出比較明顯的抗細(xì)菌活性；其他化合物對(duì)上述5種植物病原微生物沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制活性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了無(wú)葉假木賊的化學(xué)成分，不僅為其物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)，同時(shí)在一定程度上豐富了無(wú)葉假木賊化合物藥理活性的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents fromand their antibacterial activities

SUN Yan1, 2, SHEN Qing-guo1, 2, Qu Ling-xia1, 2, ZHAO Sen-sen1, 2, ZHANG Na-na1, 2, WANG Jun-nan1, 2, HUAN Xu-sheng1, 2, ZHUANG Hua-qing1, 2, ZHANG Li1, 2, GUAN Yong-xia1, 2, WANG Ye3

1. Lunan Hope Pharmaceutical Co., Ltd.,Linyi 276006, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Traditional Chinese Medicine of Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 3. Lishui University,Lishui 323000, China

To study the chemical constituents ofand their antibacterial activitiesChromatographic methods were used for the isolation and purification of chemical constituents, and the structures of the isolated compounds were elucidated by spectroscopic analyses and spectroscopic data. And the antimicrobial activities of compounds against,,,,pv.were evaluated by MTT assay.Ten compounds were isolated, and their structures were identified as anabasine (1),-methyl anabasine (2), 6-(diethylamino)-[2,3′–bipyridin]-3-ol (3), 2-(2-(pyridin-3-yl)pyridin-5-yl)-6-(pyridine-3-yl) piperidine (4), 2-(pyridine-3-yl)-5- (6-(pyridine-3-yl)pyridine-2-yl) pyridine (5), lupanine (6), 12-methylcytisine (7), cytisine (8), 2-hydroxybenzoic acid (9), vanillic acid (10). The minimal inhibitory concentration (MIC) of compound 9 against,,andby MTT assay were 20.0, 10.0, 10.0 and 20.0 μg/mL, respectively.Compounds 3 and 5 are two new compounds, named as anabasis aphylla A andanabasis aphylla B, respectively. Compounds 6—10 are isolated from the plants of this genus for the first time. Compound 9 was observed to exhibited good antibacterial activities. The alkaloid compounds 1—8 isolated fromhad no obvious inhibitory effect on the above pathogenic microorganisms.

L; alkaloid; antibacterial activity;anabasis aphylla A; anabasis aphylla B; lupanine; 12-methylcytisine; cytisine

R284.1

A

0253 - 2670(2022)08 - 2278 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.003

2021-09-27

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（重大科技創(chuàng)新工程）項(xiàng)目（2020CXGC010505）

孫 艷（1984—），碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)與工藝優(yōu)化。Tel: 15069956136 E-mail: 253341135@qq.com

汪 冶，研究員，研究方向?yàn)樗幱蒙镔Y源開發(fā)與利用。Tel: 15157810683 E-mail: 33301816@qq.com

關(guān)永霞，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)與制藥共性技術(shù)研究。Tel: (0539)8336639 E-mail: jmsgyx@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]