小兒消積止咳口服液抗腸炎靶點與作用機制研究

羅倩微，姚 璐，楊 倬，姚景春，孫成宏，張貴民*，曾克武*

小兒消積止咳口服液抗腸炎靶點與作用機制研究

羅倩微1，姚 璐1，楊 倬1，姚景春2，孫成宏2，張貴民2*，曾克武1*

1. 北京大學藥學院 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191 2. 魯南制藥集團股份有限公司 中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006

探索小兒消積止咳口服液改善腸道炎癥作用的直接靶點，從炎癥靶點生物學功能的角度，闡釋小兒消積止咳口服液保護腸道并發(fā)揮消積功效的作用機制?；诎悬c“鉤釣”策略從脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠腸道組織中捕獲并通過高分辨質譜鑒定小兒消積止咳口服液提取物的直接作用靶點蛋白，基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析靶點蛋白相關信號通路。通過qRT-PCR、免疫組化等方法進行靶點蛋白的功能驗證。累計從腸道組織鑒定到1333個結合蛋白，并通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)靶點蛋白群主要與腸道動力學、腸道免疫、黏膜屏障等功能有關。進而利用免疫組化、qRT-PCR等方法確證了小兒消積止咳口服液具有上述保護腸道功能的潛在作用。小兒消積止咳口服液具有改善小鼠腸道組織炎癥損傷的作用，其作用機制可能與增強腸道動力、改善腸道免疫微環(huán)境以及維持腸道黏膜完整性有關。

小兒消積止咳口服液；腸炎；靶點鑒定；腸道動力；免疫微環(huán)境

腸炎是一種常發(fā)生于大腸和小腸的消化系統(tǒng)疾病，通常由細菌、病毒等微生物感染所致[1]，也可以由寄生蟲感染、攝入化學毒物或藥物引起。腸炎一般表現(xiàn)為食欲下降、惡心嘔吐、腹部絞痛等，會導致營養(yǎng)吸收障礙、消化不良、排便異常等，嚴重者可能會發(fā)生腸道出血、腸穿孔甚至癌變，影響到患者的正常生活[2]。小兒消積止咳口服液臨床上主要用于治療小兒積食咳嗽[3-4]，組方中含山楂、枇杷葉、枳實、連翹、桔梗等多種苦寒中藥，改善積食和通便的效果良好。方中枇杷葉具有清肺止咳、降逆止嘔的功效，現(xiàn)代研究表明其有抗炎祛痰、抗氧化、止嘔等藥理活性[5]。枳實、萊菔子能用于瀉痢后重、大便不通等證，研究表明枳實有促進腸胃蠕動，保護胃腸屏障，抑制炎癥加重的作用[6]。連翹、桔梗有良好的抗炎與抗菌活性[7-8]，因此小兒消積止咳口服液常與抗生素聯(lián)用于微生物感染誘發(fā)的兒童胃腸道炎性疾病治療[9]。但是小兒消積止咳口服液抗腸炎的作用機制尚不清楚。本研究通過建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠腸道炎癥模型，并結合中藥成分靶點“鉤釣”策略，對小兒消積止咳口服液調節(jié)腸道功能及潛在靶點蛋白進行了系統(tǒng)研究，進而基于靶點的生物學功能探討了小兒消積止咳口服液改善腸道功能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠32只，8周齡，體質量20～22 g，購自北京大學醫(yī)學部實驗動物中心，許可證號SYXK（京）2016-0041。小鼠于動物房（保持12 h光照、12 h黑暗循環(huán)，恒溫25 ℃）適應性飼養(yǎng)7 d，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)北京大學生物醫(yī)學倫理會批準（批準號LA2020475）。

1.2 藥品與試劑

1.3 儀器

FDU-1100型冷凍干燥機（日本EYALA公司）；FastPrep-245G型組織勻漿機（美國MP Biomedicals公司）；5424R型臺式冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；800TS型多功能酶標儀（美國BioTek公司）；Orbitrap Velos Pro二維納升高效液相色譜儀串聯(lián)線性離子阱質譜（nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS，美國Thermo Fisher Scientific公司）；101-1BS型烤箱（邦西儀器科技公司）；SK-R1807-E型搖床（美國Scilogex公司）；Nikon Ci-S型倒置顯微鏡、Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；Mx3005P型qRT-PCR儀（安捷倫科技有限公司）。

2 方法

2.1 藥物的配制

小兒消積止咳口服液凍干，得到小兒消積止咳口服液總提取物，于4 ℃的干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆?。稱取1 g小兒消積止咳口服液總提取物，加入50 mL純凈水溶解，配成20 mg/mL的母液；取10 mL母液，用30 mL純凈水稀釋成5 mg/mL藥液備用。

2.2 LPS的配制

精密稱取2 mg的LPS粉末，溶解于10 mL純凈水配制成0.2 mg/mL的LPS溶液，用0.22 μm濾膜濾過備用。

2.3 小兒消積止咳口服液提取物微球芯片的制備

將FeCl3溶于乙二醇，同時加入乙酸鈉和檸檬酸鈉，溶解后200 ℃反應9 h，合成空白磁性微球。通過與二巰基丁二酸于50 ℃恒溫孵育，使其表面修飾巰基后，加入-賴氨酸三異氰酸酯將已修飾巰基的磁性微球與二苯甲酮連接，即完成表面化學物的修飾。取磁性微球5 mg分散于20 mL甲醇溶液，準確稱量5 mg小兒消積止咳口服液提取物溶解于上述體系，將反應體系置于反應器中，通氮氣30 min，紫外照射1 h后，用PBS溶液清洗得到鍵合小兒消積止咳口服液提取物的磁性微球，備用[10]。

2.4 造模、分組及給藥

32只雄性BALB/c小鼠隨機分為對照組、模型組和小兒消積止咳口服液提取物低、高劑量（50、200 mg/kg）組，每組8只。各給藥組ig 200 μL相應藥物，對照組ig 200 μL生理鹽水，1次/d，連續(xù)5 d；除對照組外，其余各組小鼠在末次給藥時ip 200 μL LPS，建立小鼠腸炎模型，對照組ip 200 μL生理鹽水，飼養(yǎng)12 h。按表1對各組小鼠的狀態(tài)進行評分后，小鼠麻醉處死，解剖并完整取出腸組織，用生理鹽水清洗后置于冰上留用。

表1 小鼠狀態(tài)評分量表

Table 1 State rating scale of mice

體表表征分值表現(xiàn) 眼鼻0眼鼻正常、干凈 1上瞼下垂，無分泌物 2上瞼下垂，有分泌物 被毛0光滑 1豎毛 2脫毛 糞便0糞便顆粒正常 1糞便變黑 2腹瀉 肛門0正常 1肛門外翻 2排便困難 精神狀態(tài)0活潑 1精神萎靡，反應遲鈍 2雙目無神、嗜睡 行為情況0行為敏捷 1活動減少，行為呆滯 2易蜷縮扎堆

2.5 基于微球芯片的靶點蛋白捕獲

各組小鼠腸組織加入裂解液，將腸組織蛋白裂解液分為9份，設置空白組、結合組和競爭組，每組3個重復?？瞻捉M加入未鍵合藥物成分的空白磁性微球；結合組加入鍵合小兒消積止咳口服液提取物的磁性微球；競爭組先將組織裂解液與10 mg/mL小兒消積止咳口服液提取物于4 ℃孵育1 h，再加入鍵合小兒消積止咳口服液提取液的磁性微球，4 ℃孵育8 h，用0.5%十二烷基硫酸鈉溶液洗脫雜蛋白，進行后續(xù)實驗。

2.6 靶點蛋白的高分辨質譜鑒定

利用nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS鑒定捕獲的蛋白。將各組磁性微球捕獲的蛋白用胰酶消化后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過并進樣分析。色譜條件：流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%乙腈水溶液（B）；洗脫條件為：0～70 min，2%～40% B；70～75 min，40%～95% B。串聯(lián)質譜采用線性離子肼靜電場軌道肼質譜儀（LTQ-Orbitrap Velos Pro），一級質譜采用Orbitrap檢測，分辨率/400處為60 000；采集質量范圍為350～2000/，依次選取一級質譜中離子強度最強的15個離子進行CID二級串聯(lián)質譜分析。

2.7 基于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的靶點蛋白生物學功能研究

基于質譜檢測結果，篩選出（結合組質譜強度－空白組質譜強度）與（競爭組質譜強度－空白組質譜強度）比值大于2的蛋白。將篩選得到的差異蛋白輸入Cytoscape軟件，應用其中的ClueGO進行KEGG分析，種屬設置為小鼠，閾值為＜0.05，其余均采用默認參數(shù)。

一個有經(jīng)驗的小兒骨科醫(yī)生，對于典型的生長痛，通常不需要過多的輔助檢查，僅通過詳細地詢問病史和仔細的查體就能確診，倒是經(jīng)常有家長面對這樣的診斷抱以懷疑態(tài)度，甚至要求醫(yī)生給患兒開具X線檢查。這種既能滿足家屬要求，又能為醫(yī)院創(chuàng)收的檢查，各位父母琢磨琢磨做醫(yī)生的是滿足呢還是滿足呢還是滿足呢？

2.8 免疫組化及蘇木素-伊紅（HE）染色分析

各組小鼠腸組織置于4%多聚甲醛中固定并制成蠟塊備用。按照試劑盒說明書分別制備TNF-α、IL-6、Occludin、Claudin-1、C-kit、HSP60的免疫組化切片和HE染色切片，采用Nikon DS-U3型成像系統(tǒng)掃描成像，并用NDP.view 2軟件進行分析。

2.9 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0中的ANOVA進行單因素方差分析，結果以表示。

3 結果

3.1 小兒消積止咳口服液緩解LPS誘導的小鼠腸炎病理狀態(tài)

如表2所示，LPS誘導后的小鼠狀態(tài)明顯變差，存在豎毛、蜷縮、排便困難等病理特征；各給藥組小鼠毛發(fā)光滑，整體更活潑，解剖發(fā)現(xiàn)各給藥組小鼠腸組織水腫癥狀也有改善（圖1-A）。HE染色結果（圖1-B）顯示，LPS誘導后的小鼠腸道結構被破壞，腸黏膜及黏膜下層有明顯的炎癥細胞浸潤；各給藥組小鼠腸道炎癥細胞浸潤明顯減少，尤其高劑量組的腸道完整性和炎癥程度與對照組相近。

表2 各組小鼠狀態(tài)評分(, n = 8)

Table 2 State score of mice in each group(, n = 8)

組別劑量/(mg·kg?1)評分 對照80.4±0.2 模型86.0±0.8### 小兒消積止咳口服液504.6±0.7 2003.0±0.7*

與對照組比較：P＜0.001；與模型組比較：P＜0.05

P 0.01control group;P 0.05s model group

A-各組小鼠腸組織外觀 B-各組小鼠腸組織HE染色

3.2 小兒消積止咳口服液提取物的腸道組織靶點鑒定

基于鍵合小兒消積止咳口服液的磁性微球從LPS誘導的小鼠腸道組織捕獲靶點，通過高分辨質譜對靶點蛋白進行鑒定（圖2-A），累計發(fā)現(xiàn)了1333個潛在結合蛋白（圖2-B）。按照（結合組質譜強度－空白組質譜強度）與（競爭組質譜強度－空白組質譜強度）的比值大于2，（結合組質譜強度－空白組質譜強度）與（競爭組質譜強度－空白組質譜強度）進行組內(nèi)檢驗，設置≤0.05的條件，篩選得到20個與小兒消積止咳口服液藥理作用直接相關的靶點蛋白（圖2-C）?；贙EGG分析結果，對這20個靶點蛋白功能進行說明。

A-靶點“鉤釣”流程示意圖 B-靶蛋白火山圖 C-特異性磁珠結合蛋白

在所發(fā)現(xiàn)的潛在靶點類群中，首先重點關注了5個與腸道動力學有關的靶點蛋白，分別是EH結構域蛋白2（EH domain-containing protein 2，Ehd2）、超長鏈特異性?；o酶A脫氫酶（very long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase，Acadvl）、核心組蛋白macro-H2A.1（core histone macro-H2A.1，Macroh2a1）、39S核糖體蛋白L40（39S ribosomal protein L40，Mrpl40）和肽基-tRNA水解酶2（peptidyl-tRNA hydrolase 2，Ptrh2）。研究表明，Ehd2能夠促進細胞內(nèi)三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的交換，維持腸道肌群的正常蠕動[11]。Acadvl缺乏會導致線粒體呼吸鏈功能降低，活性氧水平升高，腸道供能不足。Macroh2al缺失會使線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）表達顯著降低[12]。Mrpl40的缺乏則會導致線粒體鈣失調，從而影響線粒體功能及ATP的合成[13]。Ptrh2的突變可能導致肌肉無力。因此推測小兒消積止咳口服液提取物可能通過靶向調控多個腸道動力學相關蛋白，增強腸道細胞中的線粒體功能，進而為腸道組織細胞提供能量，發(fā)揮促進腸道蠕動的作用。

此外，還注意到6個與腸道炎癥和免疫功能有關的靶點蛋白，分別是ATP依賴性RNA解旋酶DDX1（ATP-dependent RNA helicase DDX1，Ddx1）、色氨酸-tRNA合成酶1（tryptophan-tRNA ligase，Wars1）、惡性腦腫瘤缺失蛋白1（deleted in malignant brain tumors 1 protein，Dmbt1）、異源核糖核蛋白L（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L，Hnrnpl）、富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子（splicing factor, proline- and glutamine-rich，Sfpq）和無POU域八聚體結合蛋白（non-POU domain-containing octamer-binding protein，Nono）。Ddxl是含TIR結構域的接頭分子1（TIR-domain-containing molecule 1，TICAM1）復合物的組成部分，研究發(fā)現(xiàn)該酶活化導致細胞因子的釋放和免疫細胞的活化，從而增加結腸炎的患病幾率[14]。Wars1可以顯著激活髓系細胞觸發(fā)受體-1，從而誘導炎癥反應[15]。研究表明，Dmbt1在炎癥性腸道疾病中含量很高，表明其與腸道炎癥有著密切關系[16]。Hnrnpl可與linc1992特異性結合，并形成功能性的linc1992-hnRNPL復合物，增加TNF-α的轉錄并促進炎癥發(fā)生[17]。Sfpq可以抑制機體的氧化應激，減少炎癥因子的生成。Nono可以被募集到IL-6啟動子區(qū)域的PRDM1結合位點，從而對IL-6的表達起到抑制作用[18]。因此，小兒消積止咳口服液可能通過調控多種與炎癥和免疫相關的靶點蛋白，調控腸道炎癥與免疫功能。

另外，5個與代謝功能相關的靶點蛋白也值得關注：尿苷磷酸化酶（uridinephosphorylase，UDP）- 葡萄糖-4-差向異構酶（UDP-glucose 4-epimerase，GalE）、醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase，mitochondrial，SQOR）、Cand蛋白1（Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1，Cand1）、1-酰基--甘油-3-磷酸?；D移酶α（1-acyl--glycerol-3-phosphate acyltransferase alpha，Agpat1）和短鏈特異性?；o酶A脫氫酶（short-chain specific acyl-CoA dehydrogenase，Acads）。其中，GalE能夠催化UDP-葡萄糖向UDP-半乳糖以及UDP--乙酰氨基葡萄糖向UDP--乙酰半乳糖胺的轉化，有助于膳食中半乳糖的分解代謝。SQOR也可以作用于腸Cajal間質細胞，產(chǎn)生傳導電興奮，進而激活腸道運動。有研究報道，CAND1可以通過調控去泛素化機制進而抑制脂肪形成，而脂肪對于調控腸道炎癥水平至關重要[19]。Agpat1既可以促進腸道對脂質的代謝，同時也能調節(jié)血漿葡萄糖水平[20]。Acads可以降低實驗動物對油脂食物的偏好，進而降低油脂食物的攝入，減輕腸胃負擔[21]。因此推測，小兒消積止咳口服液提取物可能通過靶向這些蛋白，維持了腸道細胞的正常代謝。

最后，還發(fā)現(xiàn)了4個與腸道細胞凋亡相關的靶點蛋白，分別是真核起始因子4A-I（Eukaryotic initiation factor 4A-I，Eif4a1）、U4/U6.U5 tri-snRNP相關蛋白2（U4/U6.U5 tri-snRNP-associated protein 2，Usp39）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）/ATP轉運酶2（ADP/ATP translocase 2，Slc25a5）和氨酰tRNA合成酶復合作用多功能蛋白2（aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 2，Aimp2）。其中，Eif4a1可以調節(jié)腸壁細胞的新陳代謝，對于腸道的自體修復具有潛在意義。而Usp39作為一種去泛素化酶，可以提高細胞周期檢測點激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2）的穩(wěn)定性，進而抑制細胞凋亡。有研究表明，Slc25a5通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路促進細胞的生長，并抑制細胞凋亡[22]。Aimp2可以調節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導，維持腸道干細胞的穩(wěn)定增殖，進而加快腸道細胞生長[23]。由此推測小兒消積止咳口服液提取物可能通過靶向多個與腸道上皮細胞凋亡相關的靶點，抑制腸道上皮細胞凋亡。

綜上可以推測，小兒消積止咳口服液提取物可能通過靶向多種不同功能的靶點蛋白群，包括促進腸道蠕動、調控腸道炎癥與免疫功能、維持腸道細胞的正常代謝以及抑制腸道上皮細胞凋亡，最終發(fā)揮改善腸道病理狀態(tài)的作用。

3.3 小兒消積止咳口服液促進腸道動力學標志蛋白表達

Cajal間質細胞在維持胃腸動力中發(fā)揮重要作用，而C-kit是一種酪氨酸蛋白激酶受體，在Cajal間質細胞中廣泛表達[24]。免疫組化結果顯示，模型組腸組織C-kit表達與對照組相比明顯降低；與模型組相比，各給藥組腸組織C-kit表達有明顯增加（圖3-A）。鑒于腸道動力和腸道細胞的線粒體能量代謝關系密切，而HSP60可作為評價細胞線粒體功能狀態(tài)的標志物[25]。免疫組化結果顯示，模型組與對照組相比HSP60表達明顯減少，各給藥組與模型組相比HSP60表達增加（圖3-B），提示小兒消積止咳口服液能夠保護線粒體及其功能。此外，檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）和ATP合酶b（ATP synthase b subunit，ATPb）是線粒體合成中的2種關鍵酶，利用qRT-PCR檢測其mRNA表達量發(fā)現(xiàn)，模型組腸組織和mRNA表達量明顯減少（＜0.05、0.01），給藥組后上述2個指標mRNA表達量顯著回升（＜0.05、0.01，圖3-C、D）。表明小兒消積止咳口服液能夠有效促進Cajal間質細胞的增殖，同時促進腸道細胞線粒體中ATP的合成并加強能量代謝，進而維持小腸正常運動功能。

3.4 小兒消積止咳口服液改善腸道炎癥微環(huán)境及黏膜屏障

炎癥因子的過度表達是腸道炎癥損傷的關鍵病理指標。如圖4-A、B所示，TNF-α和IL-6在正常腸道組織中幾乎沒有表達，而在模型組中兩者水平有明顯升高；與模型組相比，給予小兒消積止咳口服液后的腸道組織中TNF-α和IL-6表達明顯減少，說明小兒消積止咳口服液具有顯著抑制腸道炎癥的作用。

炎癥因子的異常表達常會導致腸道黏膜的破壞和腸壁的損傷，而Claudin-1和Occludin是評價腸道細胞致密性的重要指標。如圖4-C、D所示，對照組腸道組織中Claudin-1和Occludin均有表達，且對照組細胞完整，細胞致密性好；與對照組相比，模型組Claudin-1和Occludin表達明顯減少，細胞間隙增大；而給予小兒消積止咳口服液后的腸道組織損傷有所減輕，Claudin-1和Occludin的表達也明顯增加。推測小兒消積止咳口服液可以有效抑制腸道炎癥反應，進而保護腸道內(nèi)皮細胞，維持腸組織黏膜的致密性與完整性。

A～D-各組小鼠腸組織C-kit (A) 和HSP60 (B) 蛋白表達和CS (C) 和ATPb (D) mRNA表達 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖4 小兒消積止咳口服液增加小鼠腸道炎癥組織TNF-α(A)、IL-6(B)、Occludin(C)和Claudin-1(D)蛋白表達

4 討論

Cajal間質細胞是一種胃腸起搏細胞，遍布整個腸道，主要參與胃腸基本電節(jié)律調控和神經(jīng)遞質信號傳導，與胃腸運動關系密切[26]。C-kit是其特異性標志物，幾乎所有的Cajal間質細胞都會表達C-kit，因此可以通過標記C-kit來識別小腸間質細胞[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，小兒消積止咳口服液可以顯著增加小鼠腸道中C-kit的表達，表明小兒消積止咳口服液可能通過促進Cajal間質細胞增殖，增強小鼠腸道動力，提高小鼠腸道的傳輸功能。HSP60是在線粒體中穩(wěn)定表達的一種蛋白，HSP60缺失可能導致細胞線粒體碎片化，因此通過檢測HSP60的表達可以判斷腸組織中能量合成情況。ATP可以為腸道活動提供充足的能量，CS和ATPb參與ATP的生成，是影響腸道動力的重要能量代謝相關的酶，因此提高二者的表達，對于增強腸道動力具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)小兒消積止咳口服液能夠提高小鼠腸組織中HSP60的表達以及CS和ATPb的活性，提示小兒消積止咳口服液可能通過保護線粒體完整，進而增強了小鼠腸道組織的能量代謝。此外，腸黏膜對穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境有重要作用，腸道上皮細胞緊密連接對維持腸黏膜屏障具有重要意義。而小兒消積止咳口服液能夠通過提高Claudin-1和Occludin的表達，從而發(fā)揮維持腸組織黏膜的致密性和完整性的作用。

綜上所述，小兒消積止咳口服液能夠有效改善LPS誘導的小鼠腸炎，其作用機制可能與增強腸道動力、改善腸道免疫微環(huán)境以及維持腸道黏膜完整性有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 翟艷芳. 血清PCT聯(lián)合CRP鑒別診斷小兒細菌性腸炎與病毒性腸炎的臨床價值分析 [J]. 現(xiàn)代診斷與治療, 2021, 32(18): 2970-2972.

[2] 馬文校, 劉億托, 羅艷貞, 等. 理中湯加味治療慢性腸炎脾胃虛弱證臨床觀察 [J]. 深圳中西醫(yī)結合雜志, 2021, 31(15): 67-68.

[3] 葛俊德, 李曉驕陽, 劉閏平, 等. 基于“肺與大腸相表里”的小兒消積止咳口服液功效網(wǎng)絡分析與作用機制探討[J]. 中草藥, 2020, 51(15): 3978-3986.

[4] 王卉, 魏小維, 胡思源, 等. 小兒消積止咳口服液治療痰熱咳嗽兼食積證的多中心臨床研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2010, 25(5): 376-380.

[5] 肖旭坤, 王翰華, 阮洪生. 枇杷葉化學成分和藥理活性研究進展 [J]. 中醫(yī)藥導報, 2019, 25(21): 60-66.

[6] 張曉娟, 趙良友, 李建華, 等. 中藥枳實的研究概況 [J]. 中醫(yī)藥學報, 2021, 49(1): 94-100.

[7] 楊欣, 王樂. 桔梗提取物對類風濕性關節(jié)炎大鼠的抗炎作用 [J]. 現(xiàn)代食品科技, 2020, 36(1): 22-27.

[8] 張學人. 中藥提取物連翹酯苷A對內(nèi)毒素血癥小鼠的免疫調節(jié)作用及相關機制研究 [J]. 中醫(yī)藥導報, 2016, 22(21): 57-60.

[9] 裴哲. 小兒消積止咳口服液聯(lián)合注射用炎琥寧治療兒童支原體肺炎的臨床效果 [J]. 河南醫(yī)學研究, 2018, 27(23): 4351-4352.

[10] 郭強, 姚璐, 劉忠, 等. 基于靶點“鉤釣”策略的首薈通便膠囊腸道直接作用靶點鑒定 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(3): 505-510.

[11] Hoernke M, Mohan J, Larsson E,. EHD2 restrains dynamics of caveolae by an ATP-dependent, membrane-bound, open conformation [J]., 2017, 114(22): E4360-E4369.

[12] Giallongo S, di Rosa M, Caltabiano R,. Loss of macroH2A1 decreases mitochondrial metabolism and reduces the aggressiveness of uveal melanoma cells [J]., 2020, 12(10): 9745-9760.

[13] Napoli E, Tassone F, Wong S,. Mitochondrial citrate transporter-dependent metabolic signature in the 22q11.2 deletion syndrome [J]., 2015, 290(38): 23240-23253.

[14] Zhou Y R, Wu W, Xie L L,. Cellular RNA helicase DDX1 is involved in transmissible gastroenteritis virus nsp14-induced interferon-beta production [J]., 2017, 8: 940.

[15] Nguyen T T T, Yoon H K, Kim Y T,. Tryptophanyl-tRNA synthetase 1 signals activate TREM-1 via TLR2 and TLR4 [J]., 2020, 10(9): 1283.

[16] Ligtenberg A J M, Veerman E C I, Nieuw Amerongen A V,. Salivary agglutinin/glycoprotein-340/DMBT1: A single molecule with variable composition and with different functions in infection, inflammation and cancer [J]., 2007, 388(12): 1275-1289.

[17] Li Z H, Chao T C, Chang K Y,. The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL [J]., 2014, 111(3): 1002-1007.

[18] Lee K, Jang S H, Tian H,. NonO is a novel co-factor of PRDM1 and regulates inflammatory response in monocyte derived-dendritic cells [J]., 2020, 11: 1436.

[19] Dubiel D, Ordemann J, Pratschke J,. CAND1 exchange factor promotes Keap1 integration into cullin 3-RING ubiquitin ligase during adipogenesis [J]., 2015, 66: 95-100.

[20] Agarwal A K, Tunison K, Dalal J S,. Metabolic, reproductive, and neurologic abnormalities in Agpat1-null mice [J]., 2017, 158(11): 3954-3973.

[21] Kruger C, Kumar K G, Mynatt R L,. Brain transcriptional responses to high-fat diet in Acads-deficient mice reveal energy sensing pathways [J]., 2012, 7(8): e41709.

[22] Li X W, Yan X, Wang F,. Down-regulated lncRNA SLC25A5-AS1 facilitates cell growth and inhibits apoptosis via miR-19a-3p/PTEN/PI3K/AKT signalling pathway in gastric cancer [J]., 2019, 23(4): 2920-2932.

[23] Yum M K, Kang J S, Lee A E,. AIMP2 controls intestinal stem cell compartments and tumorigenesis by modulating Wnt/β-catenin signaling [J]., 2016, 76(15): 4559-4568.

[24] 鄧靜, 凌江紅, 上官鑫超, 等. 枳實對功能性消化不良大鼠胃Cajal間質細胞及其SCF/c-Kit信號通路的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2018, 33(6): 2304-2309.

[25] 曹海燕, 翟玉龍, 孫夏承, 等. 基于電鏡和免疫組化的線粒體數(shù)目標志物評估肝癌的初步研究 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2016, 16(14): 2646-2650.

[26] Iino S, Ward S M, Sanders K M. Interstitial cells of Cajal are functionally innervated by excitatory motor neurones in the murine intestine [J]., 2004, 556(Pt 2): 521-530.

[27] Vannucchi M G. Receptors in interstitial cells of Cajal: Identification and possible physiological roles [J]., 1999, 47(5): 325-335.

Anti-enteritis targets and mechanism of Xiaoer Xiaoji Zhike Oral Liquid

LUO Qian-wei1, YAO Lu1, YANG Zhuo1, YAO Jing-chun2, SUN Cheng-hong2, ZHANG Gui-min2, ZENG Ke-wu1

1. State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China

To explore the direct targets of Xiaoer Xiaoji Zhike Oral Liquid (小兒消積止咳口服液, XXZL) in improving intestinal inflammation, and explain the mechanism of XXZL on protecting the intestinal tract and exerting the effect of eliminating accumulation through the biological function of inflammatory targets.The target proteins from intestinal tissues of lipopolysaccharide (LPS)-induced mice were captured by “target fishing” strategy, and identified by high resolution mass spectrometry, followed by signaling pathway analysis based on Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). The functions of target proteins were verified by qRT-PCR and immunohistochemistry assays.A total of 1333 binding proteins were identified, and these target proteins were mainly related to intestinal dynamics, intestinal immunity and mucosal barrier. Moreover, the immunohistochemistry and qRT-PCR assays confirmed the potential effects of XXZL on intestinal protection.XXZL can ameliorate LPS-induced intestinal tissue inflammation in mice, via enhancing intestinal motility, improving intestinal immune microenvironment and maintaining the integrity of intestinal mucosa.

Xiaoer Xiaoji Zhike Oral Liquid; enteritis; target identification; intestinal dynamics; immune microenvironment

R285.5

A

0253 - 2670(2022)08 - 2368 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.013

2021-12-17

國家自然科學基金資助項目（81973505）；國家重點研發(fā)計劃基金資助項目（2019YFC170892，2019YFC1711000）

羅倩微（1999—），女，碩士，研究方向為藥理學。Tel: 18811089606 E-mail: luoqianwei423@163.com

曾克武，研究員，研究方向為天然產(chǎn)物與中藥化學生物學。Tel: (010)82801404 E-mail: ZKW@bjmu.edu.cn

張貴民，研究員，從事藥物研發(fā)工作。E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

[責任編輯 李亞楠]