基于設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補(bǔ)的提取工藝研究

張 梅，況 剛，張有金，雷燕莉，譚瑤琳，余志晴，段思洋，劉 濤, 6*

基于設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補(bǔ)的提取工藝研究

張 梅1，況 剛2，張有金3，雷燕莉4，譚瑤琳5，余志晴4，段思洋4，劉 濤1, 6*

1. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106 2. 重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400047 3. 成都大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610081 4. 成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610106 5. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 6. 四川省抗病毒中藥產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610106

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補(bǔ)的提取工藝，確定其提取工藝參數(shù)范圍，提高原藥材利用率，減少能源損耗，以達(dá)到減少碳排放量和保護(hù)環(huán)境的目的。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出活性成分，同時(shí)結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版一部相關(guān)北劉寄奴、骨碎補(bǔ)項(xiàng)下確定柚皮苷、木犀草素為指標(biāo)性成分，采用Minitab 17軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，初步確定提取次數(shù)、提取時(shí)間以及加溶媒倍數(shù)為關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPP），通過(guò)軟件Design-Expert 10進(jìn)行Box-Behnken 3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attribute，CQA）和CPP間的數(shù)學(xué)模型，最后通過(guò)Monte Carlo法計(jì)算獲得基于概率的設(shè)計(jì)空間，并對(duì)點(diǎn)內(nèi)、點(diǎn)外進(jìn)行驗(yàn)證。確定最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，提取次數(shù)3次，每次提取時(shí)間2～3 h，加溶媒倍數(shù)為11～15倍。運(yùn)用設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝所得到的理論值與預(yù)測(cè)值結(jié)果接近，表明該法穩(wěn)定可靠，可避免常規(guī)設(shè)計(jì)方法潛在的過(guò)度提取弊端，在大生產(chǎn)中可以節(jié)約資源和減少碳排放。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；設(shè)計(jì)空間法；北劉寄奴；骨碎補(bǔ)；柚皮苷；木犀草素；Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；關(guān)鍵工藝參數(shù)；關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)；Monte Carlo法

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）主要是脊柱產(chǎn)生病變，累及骶髂關(guān)節(jié)，引起脊柱纖維化和強(qiáng)直的自身免疫疾病[1-2]。國(guó)內(nèi)強(qiáng)直性脊柱炎患者多發(fā)群體集中于青壯年，發(fā)病率為0.3%左右[3-4]，且男性較女性易發(fā)，發(fā)病率是女性的3倍左右[5]。大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為AS的病因病機(jī)為腎督虧虛[6]，臨床研究也表明AS早期為骨代謝異常導(dǎo)致骨質(zhì)炎癥，閻小萍等[7]認(rèn)為可通過(guò)增強(qiáng)骨密度、提高骨代謝，以降低脊柱至畸概率。因此，早期監(jiān)控骨代謝變化、預(yù)防骨折及骨質(zhì)疏松發(fā)生顯得尤為重要?，F(xiàn)已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，可以通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）、MMP-9、組織因子（tissue factor，TF）、Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled coil forming protein kinase 1，ROCK1）等AS相關(guān)基因介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而抑制AS病變蔓延至其他部位[8-11]。

骨碎補(bǔ)為水龍骨科槲蕨屬植物槲蕨(Kunze) J. Sm.的干燥根莖，性溫，味苦，歸肝腎二經(jīng)，有療傷止痛、補(bǔ)腎強(qiáng)骨、益督活血的功效[12]，現(xiàn)代藥理研究表明，骨碎補(bǔ)有增加成骨細(xì)胞增殖分化、抑制破骨細(xì)胞性骨吸收、改善骨代謝以及促使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用，臨床常用于抗骨質(zhì)疏松癥和促進(jìn)骨折愈合[13]，目前已有骨碎補(bǔ)總黃酮膠囊上市銷售。北劉寄奴為玄參科陰行草屬植物陰行草Benth.的干燥全草，性寒，味苦，歸脾、胃、肝、膽經(jīng)，中醫(yī)藥理論認(rèn)為腰為腎之府，腰病變至腎督虧虛，AS早期肝血不足者筋得不到濡養(yǎng)，有腰背疼痛之狀，直至僵硬，嚴(yán)重者使脊柱和外周關(guān)節(jié)產(chǎn)生病變[14-15]。本課題組前期研究表明北劉寄奴、骨碎補(bǔ)進(jìn)行配伍用于治療AS有較好的療效。

設(shè)計(jì)空間法建立的設(shè)計(jì)空間使中藥材工藝參數(shù)在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，徐冰等[16]認(rèn)為藥品生產(chǎn)工藝參數(shù)在設(shè)計(jì)空間內(nèi)則可無(wú)需再進(jìn)行申報(bào)，可提高藥品監(jiān)管的靈活性，節(jié)約大量人力、財(cái)力以及物力。中藥提取工藝是中藥制造業(yè)中至關(guān)重要的一步，傳統(tǒng)固定工藝參數(shù)模式進(jìn)行提取往往要消耗大量溶劑和熱能。一些藥物在前期上市研究時(shí)，其工藝參數(shù)確定的指標(biāo)可能與藥物活性無(wú)關(guān)，因此，目前國(guó)家鼓勵(lì)對(duì)復(fù)方制劑的制備工藝進(jìn)行持續(xù)評(píng)價(jià)與改進(jìn)。而質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）理念則主要是對(duì)中藥材的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attribute，CQA）和工藝參數(shù)（critical process parameters，CPP）進(jìn)行研究，并以藥物活性成分為指標(biāo)，確定工藝參數(shù)范圍，保證產(chǎn)品質(zhì)量在可靠工藝范圍內(nèi)運(yùn)行，減少生產(chǎn)中批次不合格問(wèn)題，從而有力的保證產(chǎn)品質(zhì)量，可達(dá)到降低能源消耗，達(dá)到“低碳”目的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SQP電子天平，奧多利斯科學(xué)儀器有限公司；FA-2004分析電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；BT-6000分析電子天平，上海友聲衡器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；800Y型高速多功能粉碎，永機(jī)康市鉑歐五金制品有限公司；PS-40超聲波清洗器，深圳得康清洗設(shè)備有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，北京科偉永興儀器有限公司；OH6-903385-III電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZDHW調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；Eclassical 3200高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 材料

北劉寄奴（批號(hào)210425）、骨碎補(bǔ)（批號(hào)210425）均購(gòu)自四川省成都市荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院劉濤教授鑒定，分別為玄參科陰行草屬植物陰行草Benth.的干燥全草、水龍骨科槲蕨屬植物槲蕨(Kunze) J. Sm.的干燥根莖；對(duì)照品柚皮苷（批號(hào)wkq21020606）、木犀草素（批號(hào)wkq21040905），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；用于液相分析的甲醇、乙腈為色譜級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥99.9%，磷酸（批號(hào)2019010201）、冰乙酸（批號(hào)2020123001）、95%乙醇（批號(hào)2020040901）、甲醇（批號(hào)2020040902）為分析級(jí)，均購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；怡寶純凈水，華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥物活性成分篩選

為確定提取工藝指標(biāo)成分與臨床療效相關(guān)，采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）分別以北劉寄奴、骨碎補(bǔ)為關(guān)鍵詞檢索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為篩選條件，得到兩者活性成分，并對(duì)活性成分的相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行搜集[17-20]。

以“ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)、GengCards數(shù)據(jù)庫(kù)以及結(jié)合Venny 2.1.0在線工作站得到MMP2、MMP9、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-4等48個(gè)藥物-疾病交集基因。將STRING軟件分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)基因互作網(wǎng)絡(luò)圖[21-25]（圖1），根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析篩選出的重要節(jié)點(diǎn)多來(lái)源于木犀草素（MOL000006）和柚皮苷（MOL004328），再結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版一部相關(guān)北劉寄奴、骨碎補(bǔ)項(xiàng)下最終確定柚皮苷、木犀草素為后續(xù)研究中的指標(biāo)性成分，文獻(xiàn)研究也表明，這2種成分具有治療強(qiáng)直性脊柱炎的作用[26-27]。

2.2 活性成分柚皮苷、木犀草素的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 取柚皮苷、木犀草素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含柚皮苷70.0 μg/mL、木犀草素70.6 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取“1.2”項(xiàng)下2味中藥飲片（配伍比例1∶1）適量（各25 g），加11.5倍體積分?jǐn)?shù)為45%乙醇，提取1次，提取1 h，濾過(guò)，待冷卻至室溫，抽濾，量取總體積，取適量濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

圖1 成分-靶點(diǎn)基因互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.3 色譜條件[28-29]采用Supersil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量為1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；以乙腈-0.1%冰乙酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～15 min，15%～33%乙腈；15～25 min，33%～51%乙腈；25～30 min，51%～15%乙腈；30～35 min，15%～15%乙腈。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明供試品色譜峰與對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間一致對(duì)應(yīng)。色譜圖見圖2。

2.2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以混合對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得到柚皮苷回歸方程＝10 307＋9 162.6，＝0.999 9，線性范圍4.375～70.000 μg/mL；木犀草素回歸方程＝34 051＋12 810，＝0.999 7，線性范圍4.4～70.4 μg/mL；結(jié)果表明，柚皮苷、木犀草素在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 混合對(duì)照品(A) 和北劉寄奴-骨碎補(bǔ)供試品(B) 的HPLC圖

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算柚皮苷、木犀草素的峰面積的RSD分別為2.93%、2.13%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取“1.2”項(xiàng)下北劉寄奴、骨碎補(bǔ)適量，依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h后分別進(jìn)樣10 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果表明，柚皮苷、木犀草素峰面積的RSD分別為2.15%、4.86%，即供試品溶液在室溫下放置24 h基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取“1.2”項(xiàng)下北劉寄奴、骨碎補(bǔ)6份，依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄柚皮苷、木犀草素峰面積并計(jì)算其含量。結(jié)果表明柚皮苷、木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為4.76%、4.38%，表明該色譜條件下測(cè)定重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取已測(cè)定柚皮苷、木犀草素含量的北劉寄奴骨碎補(bǔ)各12.5 g，分別添加藥材中等量的柚皮苷和木犀草素的對(duì)照品溶液，依“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。計(jì)算得柚皮苷、木犀草素的平均回收率分別為94.23%、96.31%，RSD分別為2.36%、3.41%。

2.2.10 樣品測(cè)定 將“2.2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2.3 干膏率測(cè)定

精密量取北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取液50 mL，置于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，在干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏率。

干膏率＝/50

表示50 mL提取液的干膏質(zhì)量，表示總提取液體積，表示生藥材質(zhì)量

2.4 CPP和CQA的確定

對(duì)北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取過(guò)程中提取次數(shù)（1）、提取時(shí)間（2）、加溶媒倍數(shù)（3）以及乙醇體積分?jǐn)?shù)（4）進(jìn)行篩選和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將柚皮苷提取量（1）、木犀草素提取量（2）以及干膏率（3）作為北劉寄奴-骨碎補(bǔ)中間體制備工藝的CQA。

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 取“1.2”項(xiàng)下2味中藥飲片適量，分別加入10倍量水及45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%乙醇，提取2次，每次提取1 h[30-33]，濾過(guò)，合并2次濾液，待冷卻至室溫，抽濾，量取總體積，取適量濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。綜合評(píng)分結(jié)果見表1，可知用體積分?jǐn)?shù)為45%乙醇進(jìn)行提取各項(xiàng)指標(biāo)較好。

綜合評(píng)分＝干膏率/最大干膏率×20＋木犀草素量/最大木犀草素量×40＋柚皮苷量/最大柚皮苷量×40

表1 溶媒篩選結(jié)果表

Table 1 Solvent screening results table

試驗(yàn)號(hào)X1/次X2/hX3/倍X4/%Y1/mgY2/mgY3/%綜合評(píng)分 11210075.600.198.7538.00 2121045170.1922.268.7895.60 3121050112.5014.767.6867.54 4121055122.8021.267.9681.00 51210606.0420.638.1152.89 612106595.4923.977.7678.46 7121070154.6525.017.7093.89 8121075138.5421.157.2682.93

2.4.2 CPP確定 利用Minitab 17軟件對(duì)提取次數(shù)（1）、提取時(shí)間（2）、加溶媒倍數(shù)（3）以及乙醇體積分?jǐn)?shù)（4）進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

分別以1～3對(duì)1～4進(jìn)行線性回歸，得回歸方程1＝?14.5＋25.001＋19.182＋2.143＋0.0894；2＝?4.39＋3.431＋0.972＋0.8453＋0.0044；3＝0.014 5＋0.020 431＋0.011 472＋1.633×10?33－2.15×10?44。方差分析見表3，由表3可知13均對(duì)12或3顯著，標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的pareto圖見圖3，由圖3可知效應(yīng)值影響較大的工藝參數(shù)分別為1、2、3。結(jié)合方差分析和pareto圖最終確定提取次數(shù)1、提取時(shí)間2、加溶媒倍數(shù)3作為本研究中的關(guān)鍵工藝參數(shù)。

2.4.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為考察提取次數(shù)（1）、提取時(shí)間（2）、加溶媒倍數(shù)（3）對(duì)北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝的影響規(guī)律，利用軟件Design-Expert10中Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，得到17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中中心點(diǎn)重復(fù)5次試驗(yàn)，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 2 Plackett-Burman experimental design and results

試驗(yàn)號(hào)X1/次X2/hX3/倍X4/%Y1/mgY2/mgY3/%試驗(yàn)號(hào)X1/次X2/hX3/倍X4/%Y1/mgY2/mgY3/% 1131560116.2316.288.557331540149.7321.3712.75 21184056.884.405.0983184099.6614.779.51 333860159.7214.1011.90913154082.7712.367.70 411156089.1916.657.02103186091.4412.628.28 51384090.128.427.11111186032.297.254.09 6311540132.9624.4210.951233860133.9719.2810.69

表3 方差分析

Table 3 Analysis of variance

誤差來(lái)源自由度Y1Y2Y3 離均方平均和均方F值P值離均方平均和均方F值P值離均方平均和均方F值P值 模型412 592.7003 148.1807.6600.011257.78064.4453.8200.0597.036×10?31.759×10?318.2400.001 線性412 592.7003 148.1807.6600.011257.78064.4453.8200.0597.036×10?31.759×10?318.2400.001 X117 500.0007 500.00018.2500.004141.453141.4538.3900.0235.010×10?35.010×10?351.9600.000 X214 412.9004 412.93010.7400.01411.40711.4070.6800.4381.578×10?31.578×10?316.3600.005 X31670.200670.2101.6300.242104.903104.9036.2200.0413.920×10?43.920×10?44.0700.084 X419.6009.5800.0200.8830.0160.0160.0000.9765.500×10?55.500×10?50.5800.473 誤差72 877.400411.060 117.98816.855 6.750×10?49.600×10?5 合計(jì)11375.768 375.768 7.711×10?3

圖3 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的pareto圖(響應(yīng)為綜合評(píng)分, α = 0.05)

2.5 北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝的確定和驗(yàn)證

運(yùn)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，采用Monte Carlo法獲取基于達(dá)標(biāo)概率的設(shè)計(jì)空間，設(shè)定計(jì)算機(jī)模擬10 000次，計(jì)算步長(zhǎng)為0.02，達(dá)標(biāo)概率為0.9可以獲得較為穩(wěn)定可靠的結(jié)果[34-35]。建立設(shè)計(jì)空間，采用Matlab（2016b）軟件提供的Monte Carlo仿真法計(jì)算獲得北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝參數(shù)的設(shè)計(jì)空間圖（圖4）。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 4 Box-Behnken experimental design and results

編號(hào)X1/次X2/hX3/倍Y1/mgY2/mgY3/% 122.08.0218.1224.178.68 222.015.0296.8035.3710.66 332.011.5386.2440.9212.27 421.08.0231.1721.428.08 521.511.5294.8326.139.56 631.515.0373.3940.7311.94 711.011.5132.3515.615.59 821.015.0266.7630.129.24 921.511.5260.9128.689.82 1021.511.5279.0325.129.58 1112.011.5187.6521.197.12 1211.515.0189.3721.787.53 1321.511.5278.6929.669.26 1411.58.0127.5413.255.55 1531.58.0267.4423.4010.41 1621.511.5280.2225.639.37 1731.011.5309.8524.499.20

在最佳提取工藝范圍分別選取點(diǎn)內(nèi)（?1，0.9，?0.9）、點(diǎn)外（?0.9，0.94，?0.78）平行進(jìn)行2組實(shí)驗(yàn)，測(cè)定柚皮苷量、木犀草素量、干膏率，結(jié)果表明點(diǎn)內(nèi)A的各項(xiàng)指標(biāo)及綜合評(píng)分均優(yōu)于點(diǎn)外B，驗(yàn)證結(jié)果見表5。從驗(yàn)證結(jié)果可得該模型具有較好的預(yù)測(cè)能力，且在設(shè)計(jì)空間內(nèi)操作能保證提取液質(zhì)量的穩(wěn)定性。

圖4 北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝設(shè)計(jì)空間圖

表5 設(shè)計(jì)空間結(jié)果驗(yàn)證

Table 5 Verification of design space results

編號(hào)X1/次X2/minX3/倍Y1/mgY2/mgY3/%綜合評(píng)分 1211610127.7826.399.8199.99 2211610126.0418.039.5686.27 31114976.5715.196.3860.01 41114979.0413.015.9556.60

3 討論

目前多數(shù)提取工藝研究采用1個(gè)或多個(gè)化學(xué)成分作為指標(biāo)成分，但這些成分是否為其有效成分并未得到充分的研究，只是引用文獻(xiàn)進(jìn)行說(shuō)明。本實(shí)驗(yàn)在提取工藝選擇指標(biāo)時(shí)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)處方治療AS的成分進(jìn)行篩選確定，再結(jié)合文獻(xiàn)和《中國(guó)藥典》2020年版一部相關(guān)北劉寄奴、骨碎補(bǔ)藥材項(xiàng)下的指標(biāo)性成分，最終選取木犀草素、柚皮苷為本研究中的指標(biāo)性成分。

本研究基于質(zhì)量來(lái)源于設(shè)計(jì)理念，以北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝為例建立其設(shè)計(jì)空間，選取柚皮苷、木犀草素和干膏率作為關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用設(shè)計(jì)空間法研究工藝與質(zhì)量參數(shù)的關(guān)聯(lián)性，通過(guò)文獻(xiàn)研究和前期實(shí)驗(yàn)確定提取次數(shù)、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、加溶媒倍數(shù)為影響北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取過(guò)程的CPP，對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明提取次數(shù)、提取時(shí)間、加溶媒倍數(shù)對(duì)提取工藝影響較大。通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探究CPP和CQA的相關(guān)性，采用Monte Carlo法進(jìn)行模擬計(jì)算，最終得到北劉寄奴-骨碎補(bǔ)提取工藝參數(shù)操作空間為提取次數(shù)3次，每次提取時(shí)間2～3 h，加溶媒倍數(shù)為11～15倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)為45%。經(jīng)驗(yàn)證設(shè)計(jì)空間內(nèi)選取的點(diǎn)的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于設(shè)計(jì)空間外，驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，大生產(chǎn)中采用設(shè)計(jì)空間法達(dá)到工藝可調(diào)的目的，在中藥原藥材質(zhì)量波動(dòng)較大的情況下也能最終保證中藥制劑質(zhì)量穩(wěn)定可控[16]。

近年來(lái)，世界各國(guó)都在提倡低碳經(jīng)濟(jì)，隨著我國(guó)醫(yī)藥市場(chǎng)的快速開發(fā)和國(guó)際市場(chǎng)對(duì)天然產(chǎn)物需求的持續(xù)增長(zhǎng)，中藥產(chǎn)業(yè)將成為我國(guó)藥品行業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中心之一，中藥材的提取在傳統(tǒng)工藝過(guò)程中，多采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，并采取固定的提取工藝參數(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，可能存在過(guò)度提取的弊端，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不同批次或同一批次間波動(dòng)范圍較大[36]。而設(shè)計(jì)空間的建立，則是對(duì)原料藥材提取工藝范圍進(jìn)行確定，可以根據(jù)生產(chǎn)設(shè)備條件、原料藥材的質(zhì)量以及不同的環(huán)境在設(shè)計(jì)空間范圍內(nèi)對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，保證中間體、最終產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性[37]。同時(shí)，將進(jìn)一步提高工藝參數(shù)與產(chǎn)品質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)性，保證產(chǎn)品同一批次產(chǎn)品質(zhì)量一致性，做到安全有效、均一可控[38]。除此之外，設(shè)計(jì)空間的建立提高了重要分析方法的耐用性，分析多個(gè)變量間的相互作用，減少了提取時(shí)間、能源消耗[39]，從而可能降低碳排放量、提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)低碳經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of extraction technology of-based on design space method

ZHANG Mei1, KUANG Gang2, ZHANG You-jin3, LEI Yan-li4, TAN Yao-lin5, YU Zhi-qing4, DUAN Si-yang4, LIU Tao1, 6

1. School of Food and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China 2. School of Biological and Chemical Engineering, Chongqing Second Normal University, Chongqing 400047, China 3. Clinical Medical College, Chengdu University, Chengdu 610081, China 4. College of Pharmacy, Chengdu University, Chengdu 610106, China 5. School of Pharmacy, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530200, China 6. Sichuan Provincial Engineering Research Center for Antiviral Chinese Medicine Industrialization, Chengdu 610106, China

To optimize the extraction process of Beiliujinu (, SH)-Gushibu (, DR) by network pharmacology and design space method, determine the range of extraction process parameters, improve the utilization rate of raw medicinal materials and reduce energy consumption, so as to reduce carbon emissions and protect the environment.The active components were screened by network pharmacology, and naringin and luteolin were determined as the index components under the relevant items of “” 2020 edition. The Plackett-Burman experimental design was carried out by Minitab 17 software. The extraction times, extraction time and solvent multiple were preliminarily determined as the critical process parameters (CPP). The Box-Behnken three-factor three-level experimental design was carried out by software Design-Expert 10, and the mathematical model between the critical quality attribute (CQA) and CPP was established. Finally, the probability-based design space was obtained by Monte Carlo method, and the interior and exterior points were verified.The optimal extraction process was determined as follows: ethanol concentration 45%, extraction three times, extraction time 2—3 h each time, and solvent multiple 11—15 times.The verification results show that the theoretical value obtained by using the design space method to optimize the extraction process of SH-DR is close to the predicted value, indicating that the method is stable and reliable, which can avoid the potential excessive extraction drawbacks of conventional design methods, and can save resources and reduce carbon emissions in mass production.

network pharmacology; design space method;;; naringin; luteolin; Plackett-Burman experimental design; critical process parameters; critical quality attribute; Monte Carlo method

R284.2

A

0253 - 2670(2022)08 - 2341 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.08.010

2021-10-30

四川省科技創(chuàng)新苗子工程資助項(xiàng)目（2021054）；2021年四川省大學(xué)生創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202111079126X）；2021年四川省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202111079087）；四川省2021—2023年高等教育人才培養(yǎng)質(zhì)量和教學(xué)改革項(xiàng)目（JG2021-1106）

張 梅（2001—），在讀本科生，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)研究。Tel: 18381355193 E-mail: 2523016935@qq.com

劉 濤（1976—），博士，教授，主要從事中成藥新藥開發(fā)及再評(píng)價(jià)工作。Tel: 13378118375 E-mail: liutao0578@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]